超高壓液相色譜-質(zhì)譜同時測定釀酒、制曲原料中多種真菌毒素的方法研究

羅文業(yè)，卓毓崇，周 艷，徐克贊，何世興，時 源，陳 振，徐 源

（四川省古藺郎酒廠有限公司，四川古藺646523）

真菌毒素是真菌在食品或飼料里生長所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，對人類和動物都有害。許多農(nóng)作物都很容易被霉菌和真菌侵蝕。植物生長期的脅迫或收獲后惡劣的儲藏條件都可能使真菌類感染大量日常用品，經(jīng)常產(chǎn)生無法忍受的味道。也有可能在一些真菌生長過程產(chǎn)生有毒的二級代謝產(chǎn)物，潛在地污染動物飼料和人類消費的食品。這些二級代謝產(chǎn)物一般來說是霉菌毒素。

黃曲霉毒素B1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮均屬于真菌毒素，在很多國家都對其立法規(guī)定了限量。

目前關(guān)于糧食中真菌毒素的檢測方法有很多，最普遍的是高效液相色譜、紫外檢測法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等。但都是一次測定一種真菌毒素，處理也相對復(fù)雜。采用超高壓液相色譜-質(zhì)譜同時測定糧食中多種真菌毒素，該方法快速簡便,定性、定量準(zhǔn)確,靈敏度極高，可以滿足國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2761—2017對糧食中真菌毒素限量限制的要求。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑

小麥、高粱、大米、玉米，市售。乙腈，色譜純。甲酸，色譜純。甲醇，色譜純。正己烷，色譜純。氯化鈉，分析純。60%甲醇水溶液：量取60 mL甲醇用超純水定容至100 mL。真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品或標(biāo)準(zhǔn)品溶液：黃曲霉素B1、脫氧雪腐鐮刀菌稀醇、玉米赤霉烯酮和赭曲霉素A，有國家認(rèn)可的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書，固體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度含量≥98.0%。

1.2 實驗儀器

超高壓液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，超高壓液相色譜：WATERS ACQUITY UP-LC/TQD,電噴霧（ESI）離子源。色譜柱：BEH C18（2.1 mm×100 mm,1.7 μm）或相當(dāng)者。萃取柱：OASIS HLB 1cc（30 mg）Cartridge，或性能相當(dāng)者。Masslynx 4.1質(zhì)譜色譜操作軟件。

1.3 儀器工作條件

（1）液相色譜參考條件

色譜柱：BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）或相當(dāng)者。流動相A：超純水+0.1%甲酸。流動相B：乙腈+0.1%甲酸。流速：0.3 mL/min。進(jìn)樣體積：10 μL。進(jìn)樣方式：自動進(jìn)樣。柱箱溫度：40℃。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

（2）質(zhì)譜參考條件

離子源：電噴霧離子源（ESI）。檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測MRM模式。毛細(xì)管電壓：4 kV。錐孔電壓：多級。離子源溫度：120℃。脫溶劑氣（N2）流量：800 L/h。脫溶劑氣（N2）溫度：450 ℃。錐孔氣（N2）流量：5 L/h。碰撞氣體（Ar）壓力，3.5×10-3毫巴。質(zhì)譜參數(shù)見表2，其中“*”表示定量離子對。

1.4 真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

0.1 mg/mL真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：準(zhǔn)確稱取或吸取一定量上述4種標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇分別配制成0.1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，-18℃下避光保存?zhèn)溆谩?/p>

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：吸取一定量上述標(biāo)準(zhǔn)溶液于容量瓶中，用甲醇配制成一系列的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.5 試驗方法

1.5.1 樣品的預(yù)處理

將糧食去除雜質(zhì)后進(jìn)行粉碎過10目篩，稱取樣品20 g，加入5 g氯化鈉和30 mL正己烷。準(zhǔn)確加入100 mL 60%（v/v)甲醇水溶液，搖勻,然后用超聲波提取30 min。提取后，用直徑15 cm快速定性濾紙過濾。待靜置分層后，取1 mL甲醇水溶液用于凈化。

1.5.2 樣品的凈化

分別取1 mL甲醇和水對萃取柱進(jìn)行活化和平衡，然后往萃取柱中加入1 mL待凈化液，當(dāng)完全通過柱子后加1 mL水進(jìn)行清洗。清洗結(jié)束后加1 mL甲醇進(jìn)行洗脫，接收洗脫液，用甲醇將洗脫液定容至2 mL，作為測定液待分析。

1.5.3 樣品的分析

將凈化后的樣品放入進(jìn)樣盤中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制時的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用條件自動進(jìn)樣測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇

流量對LC/MS有重要影響，實驗比較了Waters ACQUITY UPLCTM BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)和BEH C18（2.1 mm×50 mm 1.7 μm）以及YMC-Pack ODS-AQ(4.6 mm×150 mm,3 μm)色譜柱對4種真菌毒素的分離情況，在相同流速下Waters ACQUITY UPLCTM BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)分離效果好，所以選擇其為本實驗用分析柱。但不足的是玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A不能分離。

表2 質(zhì)譜參數(shù)

2.1.2 流動相的優(yōu)化

由于真菌毒素易溶于乙腈，本實驗采用乙腈為洗脫劑。為了促進(jìn)樣品的離子化，本實驗先后在流動相中加入了0.1%甲酸、0.1%乙酸和10 mmol/L乙酸銨，結(jié)果表明，加入甲酸時的離子豐度最強(qiáng)，因此最終確定在流動相中添加0.1%甲酸進(jìn)行梯度洗脫。標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見圖1。

圖1 4種真菌毒素質(zhì)譜圖

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

根據(jù)4種真菌毒素的性質(zhì)和樣品的特性，本實驗采用電噴霧離子源進(jìn)行離子化。實驗中分別采用正、負(fù)兩種離子模式，發(fā)現(xiàn)正離子模式下的離子化效果明顯高于負(fù)離子模式。分別在全掃描模式和子離子掃描模式確定了4種真菌毒的質(zhì)譜參數(shù)，結(jié)果見表2。

2.3 樣品凈化條件的選擇

對于真菌毒素的萃取和凈化，目前相關(guān)文獻(xiàn)大部分使用乙腈水溶液或甲醇水溶液萃取，用免疫親和柱和多功能凈化柱凈化。本實驗通過試驗采用正己烷配合甲醇水溶液萃取，使用OASIS HLB 1cc（30 mg）Cartridge萃取小柱凈化。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測限

測定1.4節(jié)中的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。按照確定的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用條件，待儀器處于穩(wěn)定狀態(tài)后，按濃度由低到高的順序進(jìn)樣檢測分析，以真菌毒素的濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，得到4種真菌毒素的線性方程和相關(guān)系數(shù)。計算3倍信噪比和10倍信噪比時所對應(yīng)的樣品濃度，分別作為方法的檢出限和定量限。結(jié)果見表3。

表3 線性方程、線性范圍及檢出限

2.5 方法精密度和加標(biāo)回收試驗

將每種樣品連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣5次，測得各組分的峰面積，計算其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），來衡量方法的精密度。同時將每種樣品取3份，分別添加不同體積的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.5節(jié)進(jìn)行前處理，在1.3節(jié)條件下測定，計算樣品加標(biāo)回收率。玉米樣品的回收實驗結(jié)果見表4，其他幾種糧食樣品的回收率也都在80%～96%，各項數(shù)據(jù)說明該方法的精密度和回收率都比較良好；精密度分析結(jié)果見表5，RSD值均小于5%。

表4 玉米樣品加標(biāo)回收率

表5 精密度分析結(jié)果

3 結(jié)論

本實驗建立的超高壓液相色譜-質(zhì)譜法同時檢測糧食中黃曲霉毒素B1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮4種真菌毒素，采用梯度洗脫，在質(zhì)譜正離子掃描模式下監(jiān)測，5 min內(nèi)完成4個組分檢測。4種真菌毒素黃曲霉毒素B1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮的檢出限分別為 0.02 μg/kg、10 μg/kg、0.5 μg/kg、0.4 μg/kg，能滿足我國國標(biāo)GB 2761—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量》對糧食中4種真菌毒素的要求。該方法靈敏度高、準(zhǔn)確性好，而且簡單快速，能在短時間內(nèi)檢測大量的樣品，可用于糧食中真菌毒素的檢測及其風(fēng)險評估。