酒糟黃水中二肽和環(huán)二肽的研究

廖勤儉，安明哲，李楊華，周韓玲，王小琴，王 芳，郭 艷

（宜賓五糧液股份有限公司，四川宜賓644007）

二肽是由2個(gè)氨基酸通過一個(gè)肽鍵縮合而成的最小的肽，其兩端的氨基和羧基在一定條件下可以再次肽鍵縮合而成穩(wěn)定的環(huán)二肽。因其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，分子量小，所以能夠通過細(xì)胞膜的滲透以原形直接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，參與細(xì)胞的生長、發(fā)育、生理功能等。目前有許多對(duì)環(huán)二肽類化合物的研究報(bào)道，并發(fā)現(xiàn)許多的環(huán)二肽類化合物具有生物活性，鐘飛等[1]對(duì)近年來生物活性環(huán)二肽的發(fā)現(xiàn)及合成策略進(jìn)行了綜述，并總結(jié)出環(huán)二肽在自然界及天然產(chǎn)物中廣泛存在；盧曦元等[2]對(duì)環(huán)二肽在胞間信息傳遞、抑制毒素、促癌細(xì)胞凋亡和鎮(zhèn)痛作用方面也進(jìn)行了綜述。

酒糟黃水，是固態(tài)白酒發(fā)酵過程中酒糟的浸出液，屬于固態(tài)白酒釀造的副產(chǎn)物，其中含有豐富的微生物、糖類、蛋白質(zhì)降解物、微生物代謝產(chǎn)物、白酒的香味成分等。酒糟黃水中的蛋白，一部分來自于糧食原料，一部分來自微生物菌體，包括微生物蛋白和植物蛋白，在微生物及酸的作用下降解成小分子的肽。同時(shí)，酒糟黃水具有酒糟中的相似成分，五糧濃香型白酒特有的蒸餾方式，使得在白酒蒸餾過程中，酒糟中難揮發(fā)和不揮發(fā)的組分也會(huì)隨著蒸汽經(jīng)精餾塔似的酒糟層，帶入白酒中，如具有生物活性的環(huán)二肽類化合物，筆者此前也進(jìn)行了白酒中環(huán)二肽類化合物的研究，并檢出其中的13種環(huán)二肽[3]。在傳統(tǒng)的中醫(yī)藥理中，酒有白藥之長的說法，合理使用能有效提高中藥療效。因此，將白酒與醫(yī)學(xué)保健相聯(lián)系，研究酒糟黃水中的二肽及環(huán)二肽類生物活性成分，對(duì)于深入研究白酒中的生物活性成分，闡述這些生物活性物質(zhì)的生理活性，能夠?qū)m量飲酒促進(jìn)健康的觀點(diǎn)提供理論依據(jù)，對(duì)于酒糟黃水的回收利用也具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

酒糟黃水：取自五糧液技術(shù)研究中心。

美國Agilent公司1290系列高效液相色譜儀(HPLC)，6520B系列質(zhì)譜檢測(cè)器（Q-TOF），Agilent MassHunter數(shù)據(jù)采集工作軟件、定性定量分析軟件。

制備色譜（GX-281）。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（Heizbad Hei-VAP）。

1.2 色譜條件

分析柱：Agilent Eclipse Plus C182.1×100 mm 1.8-micron。

流動(dòng)相：甲醇B（液質(zhì)級(jí)），超純水A（含0.05%甲酸），0～15 min：5B-100B；15.1～20 min；100B；20.1 min；5B；22 min：stop。

柱溫：30℃。

流速：0.2 mL/min。

進(jìn)樣體積：2 μL。

1.3 質(zhì)譜條件

離子源：DESI源,正模式。

Gas Temp：325℃。

Drying Gas：10 L/min。

Nebulizer：40 psig。

Vcap：4000 v。

Fragmentor：60 v。

1.4 樣品處理

取酒糟黃水，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮成膏狀，用無水乙醇沉淀后，取上清液，膜過濾，濾液經(jīng)制備色譜分離，分段收集，收集液作為待測(cè)樣品。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基酸的二級(jí)特征離子

取各氨基酸，分別用甲酸水溶液配制成濃度為1000 mg/L，進(jìn)行目標(biāo)離子掃描模式，進(jìn)行每個(gè)氨基酸的二級(jí)質(zhì)譜特征離子確定。各氨基酸對(duì)應(yīng)的分子離子、二級(jí)碎片特征離子見表1。

2.2 黃水樣品的制備分離

經(jīng)乙醇沉淀的黃水樣品，進(jìn)樣5 mL，以10 mL/min的流速乙醇水梯度洗脫，按時(shí)間收集（1 min/個(gè)）。

2.3 樣品中二肽和環(huán)二肽類化合物的質(zhì)譜定性檢測(cè)

表1 氨基酸對(duì)應(yīng)的分子離子、二級(jí)碎片特征離子

利用LC-QTOF，分析檢測(cè)各制備分離收集的樣品，先對(duì)各樣品進(jìn)行全掃描，找出具有二肽和環(huán)二肽特征的目標(biāo)離子，再針對(duì)目標(biāo)離子進(jìn)行targetms方式進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜圖檢測(cè)，以確定其結(jié)構(gòu)式。檢測(cè)結(jié)果見表2，各化合物的二級(jí)質(zhì)譜圖見圖1—圖32。

表2 各目標(biāo)化合物分子式、分子離子和二級(jí)碎片特征離子

圖1 Val-Ala

3 結(jié)論

由每個(gè)氨基酸碎片特征離子可以看出，氨基酸在20 eV碰撞能量下的斷裂方式具有規(guī)律性，從其一端的-COOH和-NH3上的-H斷裂，造成46 Da質(zhì)量數(shù)的丟失。環(huán)二肽在20 eV碰撞能量下的特征碎片離子與其含有的兩個(gè)氨基酸的特征碎片離子一致，由此，以氨基酸特征碎片離子解析定性二肽及環(huán)二肽類化合物具有可行性和準(zhǔn)確性。

圖2 Leu-Gly

圖3 Pro-Val

圖4 Leu-Ala

圖5 Val-Tyr

圖6 Pro-Ala

圖7 Leu-Phe

圖8 Pro-Leu

圖9 Val-Leu

通過對(duì)酒糟黃水中樣品的濃縮、萃取、制備色譜分離等前處理方式，利用高分辨高效液相色譜質(zhì)譜（LC-QTOF）分析檢測(cè)，共分離檢測(cè)出二肽和環(huán)二肽化合物32種，分別是Val-Ala，Leu-Gly，Pro-Val，Leu-Ala，Val-Tyr，Pro-Ala，Leu-Phe，Pro-Leu，Val-Leu，Pro-Phe，Val-Phe，Leu-Leu，Cyclo(Pro-Val)，Cyclo(Glu-Leu)，Cyclo(Glu-Phe)，Cyclo(Pro-Leu)，Cyclo(Ileu-Leu)，Cyclo(Pro-Phe)，Cyclo(Val-Phe)，Cyclo(Pro-Pro)，Cyclo(Val-Val)，Cyclo(Leu-Ala)，Cyclo(Val-Ala)，Cyclo(Val-Leu)，Cyclo(Phe-Phe)，Cyclo(Leu-Phe)，Cyclo(Pro-Ala)，Cyclo(Pro-Glu)，Cyclo(Pro-Tyr)，Cyclo(Pro-Thr)，Cyclo(Phe-Ala)，Cyclo(Leu-Leu)。大部分二肽都能找出對(duì)應(yīng)的環(huán)二肽，其中3種沒有檢出對(duì)應(yīng)的環(huán)二肽，可能與預(yù)處理方式有關(guān)。

圖10 Pro-Phe

圖11 Val-Phe

圖12 Leu-Leu

圖13 Cyclo(Pro-Val)

圖14 Cyclo(Glu-Leu)

圖15 Cyclo(Glu-Phe)

圖16 Cyclo(Pro-Leu)

圖17 Cyclo(Ileu-Leu)

圖18 Cyclo(Pro-Phe)

圖19 Cyclo(Val-Phe)

圖20 Cyclo(Pro-Pro)

圖21 Cyclo(Val-Val)

圖22 Cyclo(Leu-Ala)

圖23 Cyclo(Val-Ala)

圖24 Cyclo(Val-Leu)

圖25 Cyclo(Phe-Phe)

王艾晶等[4]從洋蔥伯克霍爾德菌CF-66發(fā)酵液中分離得到的Cyclo(Pro-Phe)對(duì)真菌類病原菌具有強(qiáng)烈的抑制作用。Brauns等[5]驗(yàn)證了Cyclo(Pro-Phe)在結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞中的抑制生長的原因。從海洋放線菌H2003代謝產(chǎn)物中分離得到的Cyclo(L-Pro-L-Leu)對(duì)小鼠FT210細(xì)胞株具有弱的抗腫瘤活性[5]。李德海等[6]對(duì)海洋放線菌發(fā)酵物中生物活性成分的研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)Cyclo(Leu-Ala)、Cyclo(Pro-Val)、Cyclo(Pro-Tyr)、Cyclo(Pro-Phe)等6種環(huán)二肽化合物具有較弱的抗腫瘤活性。可見酒糟黃水中含有較多具有抑菌活性和抗腫瘤活性的環(huán)二肽，將酒糟黃水中的環(huán)二肽類化合物分離提取并應(yīng)用具有可行性。

圖26 Cyclo(Leu-Phe)

圖27 Cyclo(Pro-Ala)

圖28 Cyclo(Pro-Glu)

圖29 Cyclo(Pro-Tyr)

圖30 Cyclo(Pro-Thr)

圖31 Cyclo(Phe-Ala)

圖32 Cyclo(Leu-Leu)