乙醛酸的高效液相色譜法分析條件探討

黃真真，劉 照，黃存賀，周 蕓，陳 杰，張明峰，黃長(zhǎng)榮

(萬(wàn)華化學(xué)集團(tuán)股份有限公司，山東 煙臺(tái) 264000)

乙醛酸是最簡(jiǎn)單的分子中同時(shí)存在醛基和羧基兩種官能團(tuán)的醛酸，能夠發(fā)生酯化和縮合反應(yīng)，使其成為廣泛應(yīng)用于香料、醫(yī)藥、農(nóng)藥、皮革、造紙、防腐緩釋、食品添加劑等行業(yè)的精細(xì)化工品[1-2]。乙醛酸典型的應(yīng)用有香蘭素、乙基香蘭素、尿囊素和苯乙酮等化工品。近年來(lái)，乙醛酸的需求進(jìn)入快速增長(zhǎng)期，市場(chǎng)需求強(qiáng)勁。因此，其精確定量對(duì)相關(guān)行業(yè)的發(fā)展意義重大。

目前文獻(xiàn)報(bào)道乙醛酸的測(cè)試手段主要有四種，分別是分光光度法、電位滴定法、毛細(xì)管電泳法和高效液相色譜法[3-7]。分光光度法是利用鹽酸羥胺與醛的加成產(chǎn)物肟的紫外吸收特性進(jìn)行檢測(cè)。該方法操作繁瑣、費(fèi)事，且不能有效區(qū)分各種分子形式的醛基[8]；電位滴定法則是采取酸堿中和反應(yīng)的原理，通過(guò)加入二甲基乙酰胺溶劑來(lái)降低滴定液中的質(zhì)子遷移效率來(lái)區(qū)分強(qiáng)酸和弱酸的滴定突越。然而，該方法不能區(qū)分電離常數(shù)與乙醛酸相近的其他弱酸[6]。另有文獻(xiàn)報(bào)道采用高效毛細(xì)管電泳和毛細(xì)管區(qū)帶電泳法測(cè)試草酸和乙醛酸[5,9]。然而，電泳分離法重現(xiàn)性差的技術(shù)瓶頸目前還未有令行業(yè)滿意的解決方案。

高效液相色譜法測(cè)試乙醛酸又分為兩種方式。第一種是使用HPLC離子對(duì)試劑或者離子抑制法結(jié)合外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法直接測(cè)定[7,10-12]，然而，該系列方法中，乙醛酸保留時(shí)間較短，且靈敏度低。當(dāng)樣品背景復(fù)雜時(shí)，很難實(shí)現(xiàn)乙醛酸和復(fù)雜基體的有效分離。另外一種高效液相色譜方法是，將乙醛酸與2，4-二硝基苯肼( DNPH)反應(yīng)生成乙醛酸腙，利用該腙類物質(zhì)對(duì)紫外-可見(jiàn)光較強(qiáng)的特征吸收進(jìn)行測(cè)定。目前已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道使用DNPH衍生法測(cè)試乙二醛和乙醛酸[3]。然而，該文獻(xiàn)并未提及DNPH衍生過(guò)程中產(chǎn)生的乙醛酸腙異構(gòu)體現(xiàn)象。本文開(kāi)展了關(guān)于DNPH與乙醛酸反應(yīng)生成順?lè)串悩?gòu)體腙的影響因素的研究。同時(shí)，通過(guò)考察衍生過(guò)程中的一系列條件，建立了對(duì)乙醛酸快速，準(zhǔn)確的高效液相色譜測(cè)試方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原理

乙醛酸的醛基可與DNPH的肼基進(jìn)行親核加成反應(yīng)，生成乙醛酸腙化合物。由于腙的分子結(jié)構(gòu)中存在碳氮雙鍵，使得該反應(yīng)會(huì)同時(shí)生成乙醛酸腙的順?lè)串悩?gòu)體[13]。反應(yīng)式如圖1所示。MOPAC軟件計(jì)算得到順式乙醛酸腙異構(gòu)體的偶極矩為4.647，反式乙醛酸腙的偶極矩為5.417。說(shuō)明乙醛酸腙順式異構(gòu)體分子極性較小，反式異構(gòu)體分子極性較大。該腙類化合物在紫外-可見(jiàn)光光區(qū)有特征吸收，因此可采用高效液相色譜接紫外檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。

A.反應(yīng)示意圖；B.乙醛酸腙順?lè)串悩?gòu)體立體結(jié)構(gòu)

圖1 乙醛酸與DNPH反應(yīng)生成乙醛酸腙順?lè)串悩?gòu)體

Fig.1 Glyoxalic acid reacts with DNPH,and produces cis-and transglyoxalic acid hydrazone

1.2 儀器與試劑

液相色譜儀器采用島津LC-20A，配備SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器，CTO-10ASvp柱溫箱，SPD-M20A檢測(cè)器。使用Waters XSelect HSS T3 5 μm ×4.6 mm×250 mm色譜柱。賽默飛(Thermo Fisher)Q-Exactive Orbitrap高分辨質(zhì)譜，用于乙醛酸腙色譜峰定性。乙醛酸水溶液(標(biāo)示質(zhì)量分?jǐn)?shù)含量不低于50%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)，分析純，TCI)采用核磁共振法標(biāo)識(shí)濃度為53.9%。2，4-二硝基苯肼(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；磷酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)不低于85%，分析純，南京峰展精細(xì)化工廠)；乙腈(色譜純，美國(guó)，Merck)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 衍生溶液的配置

DNPH母液的配制：準(zhǔn)確稱取0.3 g DNPH(精確至0.0001 g)至100 mL容量瓶中，加入乙腈約60 mL，純水40 mL溶解，加入100μL磷酸，配制成酸性的濃度為3000 mg/L的DNPH溶液。置于冰箱中冷藏備用。

配制乙腈/水稀釋液：量取50 mL乙腈、50 mL純水、適量磷酸于100 mL容量瓶中，搖勻，調(diào)節(jié)pH值約為3，備用。

1.3.2 衍生成腙反應(yīng)

稱取0.2194 g乙醛酸標(biāo)品，加入乙腈/水稀釋液(1.3.1所示)稀釋至10.6494 g，濃度為11104.5 mg/kg，定義為乙醛酸標(biāo)準(zhǔn)母液A。

稱取上述乙醛酸母液A0.2049 g，加入乙腈/水稀釋液(1.3.1所示)稀釋至10.0285 g，濃度為226.9 mg/kg，定義為乙醛酸標(biāo)準(zhǔn)母液B。

取1 mL 乙醛酸標(biāo)準(zhǔn)母液B于50 mL容量瓶中，加入適量的DNPH 溶液 (DNPH 與羰基的物質(zhì)的量比為30)，用5%磷酸調(diào)節(jié)pH值至3，置于40 ℃恒溫水浴中反應(yīng)60 min。

1.3.3 液相色譜條件

液相色譜采用如下流動(dòng)相: A，乙腈；B，0.1% 磷酸水溶液；柱溫40℃，流速為1.0 mL/min。色譜洗脫梯度如表1所示。進(jìn)樣量為 10 μL，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為 365 nm。

表1 乙醛酸腙色譜分離條件Table 1 HPLC separation conditions for glyoxalic acid hydrazone

2 結(jié)果與討論

采用 1.3.2 節(jié)的衍生方法及上述條件分離已知濃度的乙醛酸標(biāo)準(zhǔn)母液B 與 DNPH的衍生產(chǎn)物，分離色譜圖見(jiàn)圖2。通過(guò)高分辨 Q-Exactive Orbitrap 質(zhì)譜定性，確認(rèn)在保留時(shí)間為 6.2min和9.9min 出現(xiàn)的2個(gè)色譜峰歸屬為乙醛酸腙的反式和順式異構(gòu)體色譜峰，分離情況良好，見(jiàn)圖3。

圖2 乙醛酸腙液相色譜分離圖

Fig.2 HPLC chromatogram of glyoxalic acid hydrazone

上圖為反式異構(gòu)體質(zhì)譜圖；下圖為順式異構(gòu)體質(zhì)譜圖圖3 乙醛酸腙質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectrum of lower one is of trans-glyoxalic acid hydrazone.

分別對(duì)反式和順式兩個(gè)乙醛酸腙峰面積積分，并作算術(shù)加和。以乙醛酸上機(jī)濃度為橫坐標(biāo)，乙醛酸腙峰面積之和作縱坐標(biāo)。得到可用于乙醛酸定量的外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線。線形回歸方程為y = 73166 x + 81934，在乙醛酸濃度范圍7～140 mg/kg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)為0.9999。如圖4所示。

圖4 乙醛酸外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線

Fig.4 Standard calibration curve for glyoxalic acid hydrazone

2.1 衍生條件的優(yōu)化

乙醛酸的醛基可以和DNPH反應(yīng)，生成穩(wěn)定的，有顏色的腙類衍生物。本文考察了衍生試劑與乙醛酸的相對(duì)摩爾含量、衍生溫度、衍生時(shí)間及pH對(duì)順、反乙醛酸腙生成效率的影響。

2.1.1 DNPH衍生試劑用量考察

在反應(yīng)溫度70℃，衍生時(shí)間為3 h，pH值為2的條件下考察了DNPH與乙醛酸不同物質(zhì)的量比之下，乙醛酸順?lè)串悩?gòu)體的產(chǎn)率及生成總量的影響，結(jié)果如圖5、6所示。在衍生試劑與乙醛酸物質(zhì)的量比從1增大至300的過(guò)程中，乙醛酸腙反式和順式兩種異構(gòu)體比例接近1，并未發(fā)生顯著變化。當(dāng)DNPH與乙醛酸的物質(zhì)的量比大于7.5時(shí)，乙醛酸腙的生成總量不再變化。此時(shí)，乙醛酸腙兩種異構(gòu)體峰面積加和穩(wěn)定?？芍狣NPH與乙醛酸濃度比在大于7.5，衍生溫度為70℃，衍生時(shí)間3h能夠使乙醛酸衍生完全。且DNPH與乙醛酸腙的比例對(duì)兩種異構(gòu)體生成并無(wú)影響。

圖5 DNPH與乙醛酸物質(zhì)的量比對(duì)反式和順式異構(gòu)體生成比例的影響

Fig.5 The ratio of DNPH to glyoxalic acid influenced the production of trans and cis glyoxalic acid dydrozone

圖6 DNPH與乙醛酸物質(zhì)的量比對(duì)乙醛酸生成總量的影響Fig.6 The ratio of DNPH to glyoxalic acid influenced the total amount of glyoxalic acid hydrozone

2.1.2 衍生時(shí)間考察

圖7 衍生時(shí)間對(duì)乙醛酸腙反式和順式異構(gòu)體生成比例的影響Fig.7 Derivazation time influenced the output of glyoxalic acid hydrazone isomers

圖8 衍生時(shí)間對(duì)乙醛酸腙生成總量的影響Fig.8 Derivazation time influenced the total amount of glyoxalic acid hydrazone

本文在乙醛酸與DNPH 摩爾質(zhì)量比為30，衍生pH值為2，衍生溫度為70℃的條件下，采用1.3.3液相色譜條件進(jìn)樣分析，考察了衍生時(shí)間對(duì)乙醛酸腙生成的影響?？疾鞎r(shí)間分別為10min、20min、0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h。結(jié)果如圖7、8所示。從圖7、8可以看出，乙醛酸腙反式和順式兩種異構(gòu)體的比例隨著衍生時(shí)間的延長(zhǎng)不斷下降。當(dāng)衍生時(shí)間為10min時(shí)，異構(gòu)體比為4.99；當(dāng)衍生時(shí)間大于2h后，異構(gòu)體比趨于穩(wěn)定。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)，乙醛酸腙在衍生時(shí)間為10min時(shí)已經(jīng)全部生成。隨著衍生時(shí)間的延長(zhǎng)，乙醛酸腙生成總量并未發(fā)生顯著變化。因此可以得出結(jié)論，在DNPH和乙醛酸摩爾濃度比為30，衍生溫度為70℃，衍生時(shí)間1h能夠使乙醛酸衍生完全。完全可以滿足分析測(cè)試需求。

2.1.3 衍生體系pH值的考察

圖9 衍生體系pH值對(duì)乙醛酸腙反式和順式異構(gòu)體生成比例的影響

Fig.9 Derivazation pH influenced the output of glyoxalic acid hydrazone isomers

圖10 衍生體系pH值對(duì)乙醛酸腙生成總量的影響Fig.10 Derivazation pH influenced the total amount of glyoxalic acid hydrazone

控制乙醛酸與DNPH 摩爾質(zhì)量比為30，調(diào)節(jié)衍生體系pH值至2、3、4、5、6，7，放入70℃烘箱中，反應(yīng)時(shí)間為1 h。采用1.3.3液相色譜條件進(jìn)樣分析，考察了衍生體系pH值對(duì)乙醛酸腙生成的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖9、10所示。當(dāng)pH值為2時(shí)，兩種異構(gòu)體的生成比例為1.2。隨著衍生體系pH值的增加，兩種異構(gòu)體的生成比例穩(wěn)定在1左右。當(dāng)pH值處于2～5時(shí)，乙醛酸腙總量的測(cè)試結(jié)果與理論值一致，當(dāng)衍生體系pH值大于5時(shí)，乙醛酸腙的總量測(cè)試結(jié)果比理論值小，不能滿足乙醛酸定量的需求。pH值太低會(huì)增加實(shí)驗(yàn)人員操作的風(fēng)險(xiǎn)性。因此，本文選擇pH值為3 為最佳反應(yīng)pH值。

2.1.4 衍生溫度考察

本文在DNPH和乙醛酸摩爾濃度比為30，反應(yīng)時(shí)間60min，pH值=3，反應(yīng)溫度分別為30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃時(shí)，采用1.3.3液相色譜條件進(jìn)行分析檢測(cè)?？疾炝搜苌鷾囟葘?duì)乙醛酸順式和反式異構(gòu)體生成比例的影響?？疾旖Y(jié)果如圖11、12所示。從圖中可知，低溫有利于反式異構(gòu)體的生成。隨著衍生溫度的升高，反式和順式異構(gòu)體之比逐漸減小。當(dāng)衍生溫度為80℃時(shí)，兩種異構(gòu)體的比例接近1。然而，溫度對(duì)乙醛酸總量的測(cè)定并未產(chǎn)生顯著影響。衍生溫度過(guò)高，容易增加有機(jī)溶劑揮發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，并且會(huì)增加實(shí)驗(yàn)人員灼傷的安全隱患。另外，室溫的操作條件隨著季節(jié)變化不可控。綜上分析，將乙醛酸的衍生溫度設(shè)定為40℃。

圖11 衍生溫度對(duì)乙醛酸腙反/順異構(gòu)體生成比例的影響

Fig.11 Derivazation temperature influenced the output of glyoxalic acid hydrazone isomers

圖 12 衍生體系pH值對(duì)乙醛酸腙生成總量的影響Fig.12 Derivazation temperature influenced the total amount of glyoxalic acid hydrazone

通過(guò)以上條件的考察，最終確定乙醛酸的合理衍生溫度為40℃，衍生時(shí)間為60min，衍生體系pH值為3，DNPH與乙醛酸的物質(zhì)的量比為30。如1.3.2部分衍生條件所示。

2.2 加標(biāo)回收率和檢測(cè)限

為了驗(yàn)證在1.3.2條件下乙醛酸測(cè)定的準(zhǔn)確性，我們?cè)O(shè)計(jì)了分級(jí)加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)。向含有草酸，乙醛酸，愈創(chuàng)木酚的樣品中加入標(biāo)樣乙醛酸。將226 mg/kg的乙醛酸平均分為四份。分別加入一定量的乙醛酸，使其終止?jié)舛葹?50 mg/kg，303 mg/kg，488 mg/kg和792 mg/kg。考察在此四個(gè)濃度體系下的加標(biāo)回收率。測(cè)試結(jié)果如表2所示。四個(gè)加標(biāo)濃度下乙醛酸的回收率為98.9%～102%?？梢酝耆珴M足工業(yè)乙醛酸定量的需求。以信噪比(S/N) 為3 時(shí)所對(duì)應(yīng)的乙醛酸質(zhì)量濃度為檢出限，乙醛酸的檢出限為0.5 mg /kg。

表2 乙醛酸的加標(biāo)回收率(n=4) Talbe 2 Spiked recoveries of glyoxalic acid (n=4)

2.3 方法的精密度

選擇將1.3.2所示母液B，按照1.3.2所示的衍生條件以及1.3.3所示的液相色譜條件進(jìn)行7次測(cè)定，計(jì)算乙醛酸含量的平均值和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果表明，樣品中乙醛酸含量測(cè)定值RSD為1.06%，測(cè)試值與理論值一致。說(shuō)明本方法能夠可靠地測(cè)定乙醛酸的含量。

3 結(jié)論

本文建立的HPLC 方法測(cè)定乙醛酸的含量，精密度高，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可以完全滿足工業(yè)分析要求。本文同時(shí)研究了衍生條件對(duì)乙醛酸腙反式和順式異構(gòu)體生成的影響。表明，衍生體系較低的溫度，較低的pH值以及較短的衍生時(shí)間有利于乙醛酸腙反式異構(gòu)體的生成。