陰虛上火血清蛋白潛在標(biāo)志物的鑒定評估

尉理梁易文晶劉昌銘江婷婷魯任屠慧慧甘霖胡玉婷李志斌黃淮施力穎李仲杰李繼承陳靜

1.紹興市立醫(yī)院 浙江，紹興 312000 2.浙江大學(xué) 3.華南理工大學(xué) 4.中國人民解放軍第一一七醫(yī)院5.浙江醫(yī)院

陰虛上火是各種因素引起的一種亞健康狀態(tài)[1]，在人群中十分常見，以頭面部黏膜損傷為主要特征，常見表現(xiàn)為兩顴潮紅、口內(nèi)疼痛、口干欲飲、手足心熱、大便干燥、舌紅少苔、脈弦細(xì)數(shù)，愈后常易復(fù)發(fā)。陰虛上火具有自限性，但常合并其他病癥存在，例如糖尿病[2]、肺結(jié)核[3]、肝癌[4]、過敏性紫癜[5]等。隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏加快，陰虛上火的發(fā)生率日益升高，尤其是學(xué)業(yè)或工作壓力大的學(xué)生、白領(lǐng)人群，其發(fā)生率逐漸上升，嚴(yán)重影響日常生活質(zhì)量。

傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為，機體由于津液不足，濡潤、寧靜功能減弱，致使陰陽不平衡，陽氣相對過盛而發(fā)展為陰虛上火。心火旺盛則夜不能寐、口舌潰爛；肺火熾盛則干咳無痰、氣短無力；肝火過亢則脅悶不舒、頭暈心煩[6-7]。而現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為陰虛上火是機體代償范圍內(nèi)產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)[8]，其生物學(xué)機制尚不明確。目前，陰虛上火的診斷主要通過望、聞、問、切的方式判別，依賴于中醫(yī)醫(yī)師的主觀經(jīng)驗，缺乏量化統(tǒng)一的診斷標(biāo)準(zhǔn)。因此，亟需運用現(xiàn)代生物學(xué)手段，進(jìn)行陰虛上火生物學(xué)本質(zhì)探討，尋找陰虛上火的新型診斷標(biāo)志物，為揭示陰虛上火的生物學(xué)機制奠定基礎(chǔ)，并建立規(guī)范化量化的診斷指標(biāo)，深化對陰虛上火的認(rèn)識。

實驗室前期以大鼠模型模擬人體陰虛上火狀態(tài)，研究發(fā)現(xiàn)陰虛上火與能量代謝、免疫反應(yīng)密切相關(guān)[9-12]。前期研究顯示陰虛大鼠免疫功能紊亂，尤其是激肽原-1(Kininogen-1，KNG-1)的表達(dá)水平顯著升高[12]，但尚未在人群中驗證。載脂蛋白A2(apolipoprotein A2，APOA2)和載脂蛋白B(apolipoprotein B-100，APOB)是參與膽固醇代謝的重要蛋白。Han等[13]的研究結(jié)果顯示陰虛上火大鼠異常表達(dá)基因促進(jìn)膽固醇合成和代謝，增加能量消耗，降低防御反應(yīng)。CD14是單核細(xì)胞分化抗原，與炎癥反應(yīng)和機體免疫反應(yīng)有關(guān)。因此，本研究假設(shè) KNG-1、CD14、APOB、APOA2 可能與人體陰虛上火的發(fā)生有關(guān)，對其血清濃度進(jìn)行檢測，并評估其作為陰虛上火診斷標(biāo)志物的臨床價值。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器 KNG-1 ELISA檢測試劑盒購于臺灣 Abnova公司（批號：KA1040）；APOB ELISA 檢測試劑盒和APOA2 ELISA檢測試劑盒購于英國Abcam 公司（批號：ab108807、ab108805）；CD14 ELISA檢測試劑盒購于美國Raybiotech公司（批號：ELHCD14-1）。高速離心機購于日本Hitachi公司；全波長酶標(biāo)儀為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣本收集 本研究經(jīng)過浙江大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有受試者均知情同意。于2015年6月至2016年12月共采集34例受試者血清樣本，其中17例陰虛上火組患者來自杭州市蕭山區(qū)中醫(yī)院，17例健康對照為平和體質(zhì)人群，來自解放軍第117醫(yī)院。陰虛上火的診斷依據(jù)2017年發(fā)布的中華人民共和國中醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》中口瘡的中醫(yī)疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)和證候分類診斷標(biāo)準(zhǔn)[14]。納入受試者年齡18～65周歲，均排除合并各系統(tǒng)嚴(yán)重器質(zhì)性病變、精神病、腫瘤、結(jié)核等疾病，并排除懷孕、哺乳期婦女。晨起空腹?fàn)顟B(tài)下，采用一次性真空不抗凝采血管采集受試者全血，于4℃、3 000r/min離心10min，吸取上清液分裝保存于-80℃冰箱。

1.2.2 血常規(guī)和生化檢測 收集受試者血液標(biāo)本，常規(guī)進(jìn)行血常規(guī)和生化檢測。

1.2.3 ELISA 檢測血清 CD14、APOB、KNG-1蛋白的表達(dá) 分別使用ELISA檢測試劑盒檢測人血清CD14、APOB、KNG-1、APOA2表達(dá)。根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行ELISA實驗，其中CD14稀釋5 000倍，APOB稀釋20 000倍，KNG-1稀釋200倍，APOA2稀釋1 000倍。運用酶標(biāo)儀在450nm波長檢測各組血清蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 運用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。兩組之間的性別比較運用χ2檢驗。若兩組樣本符合正態(tài)分布和方差齊性，以±s表示，運用t檢驗進(jìn)行比較；若不符合，運用Mann Whitney U檢驗進(jìn)行非參數(shù)檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。運用GraphPad Prism 5.01軟件繪制散點圖，再運用MedCalc 11.4.2軟件繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲線。

2 結(jié)果

2.1 兩組受試者臨床資料比較 對兩組受試者的臨床資料進(jìn)行了統(tǒng)計分析，陰虛上火組平均年齡為（39.69±15.38）歲，其中男 7例，女 10例；健康對照組的平均年齡為（40.71±9.82）歲，其中男6例，女 11例，兩組之間性別和年齡分布無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.814、P=0.821）。臨床資料分析結(jié)果顯示，陰虛上火組谷草轉(zhuǎn)氨酶（P=0.024）、白蛋白（P=0.023）、高密度脂蛋白（P=0.048）、總膽固醇（P=0.001）、尿素氮/肌酐（P＜0.001）、紅細(xì)胞壓積（P=0.007）、紅細(xì)胞分布寬度含量（P=0.009）顯著低于健康對照組，陰虛上火組平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度（P＜0.001）、單核細(xì)胞絕對值（P=0.024）、單核細(xì)胞百分比（P=0.003）顯著高于健康對照組。見表1。

表1 兩組受試者臨床資料比較Tab.1 Comparison of clinical data between the two groups of subjects

2.2 兩組受試者血清 CD14、APOB、APOA2、KNG-1蛋白的表達(dá)比較 對陰虛上火組與健康對照組受試者的血清 CD14（Swissprot：P08571）、KNG-1（Swissprot：P01042）、APOB（Swissprot：P04114）、APOA（Swissprot：P02652）蛋白的濃度進(jìn)行了檢測。實驗結(jié)果顯示，與健康對照組比較，陰虛上火組血清CD14、KNG-1顯著上調(diào)（P＜0.001，P＜0.05），APOB、APOA2 顯著下調(diào)（P＜0.05，P＜0.01），具有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖 1。

圖1 兩組受試者血清蛋白表達(dá)水平Fig.1 Serum protein expression levels in two groups

2.3 ROC分析 為了研究單個蛋白診斷陰虛上火的效果，本研究繪制了ROC曲線評價每個蛋白的敏感度和特異度，實驗結(jié)果顯示CD14的曲線下面積（area under curve,AUC）值為 0.841，敏感度為 64.70%，特異度為100%；APOA2的AUC值為0.794，敏感度為78.60%，特異度76.50%；APOB的AUC值為0.732，敏感度為94.10%，特異度為54.80%；KNG-1的AUC值為0.725，敏感度為70.60%，特異度為82.40%。實驗結(jié)果顯示，APOB蛋白的特異度較低，不適合作為診斷標(biāo)志物，故舍棄。進(jìn)一步將CD14、APOA2、KNG-1進(jìn)行組合，構(gòu)建蛋白質(zhì)診斷模型，其AUC值為0.934，敏感度和特異度分別達(dá)到100%、71.40%，具有較好的準(zhǔn)確性。見圖2。

圖2 APOA2、CD14、KNG-1蛋白及其組合物的ROC曲線圖Fig.2 ROC curve of APOA2,CD14,KNG-1 protein and their combination

3 討論

陰虛上火是普遍的亞健康狀態(tài)，其循環(huán)往復(fù)的癥狀，嚴(yán)重影響人們的日常生活質(zhì)量。目前，針對陰虛上火癥狀，臨床上多運用中醫(yī)手段進(jìn)行治療。但中醫(yī)治療的前提是辨證，中醫(yī)對“證”的辨別缺乏定量、客觀的標(biāo)準(zhǔn)。陰虛上火產(chǎn)生的生物學(xué)機制尚不明確，其臨床診斷受制于傳統(tǒng)中醫(yī)的個人經(jīng)驗，缺乏客觀統(tǒng)一的量化診斷指標(biāo)，因而存在諸多爭議。本研究進(jìn)行了陰虛上火人群、平和質(zhì)人群的臨床資料分析，對受試者血清特異蛋白濃度的進(jìn)行了檢測，并對特異性蛋白質(zhì)及其組合物的診斷效果進(jìn)行了評估。

陰虛上火組的臨床檢測指標(biāo)仍在正常范圍內(nèi)，但與健康對照組相比，具有顯著差異。陰虛上火組的谷草轉(zhuǎn)氨酶、白蛋白、尿素氮/肌酐比值、高密度脂蛋白、總膽固醇含量顯著下調(diào)，提示陰虛上火患者能量消耗和代謝增強，說明“陰虛生內(nèi)熱”的中醫(yī)理論具有一定的物質(zhì)基礎(chǔ)。于赫等[15]研究發(fā)現(xiàn)，腎陰虛患者體內(nèi)能量代謝增強，有氧氧化增強，與本實驗結(jié)果相符，表明陰虛可能引起能量消耗、代謝增強。并且，陰虛上火組紅細(xì)胞壓積下調(diào)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度上調(diào)、紅細(xì)胞分布寬度下調(diào)，提示陰虛上火患者發(fā)生氧化應(yīng)激，這可能與有氧代謝活動的增強有關(guān)。統(tǒng)計結(jié)果還顯示，陰虛上火患者單核細(xì)胞絕對值與單核細(xì)胞百分比顯著上調(diào)，說明陰虛上火與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。

本研究進(jìn)一步對代謝、炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)陰虛上火患者CD14與KNG-1顯著上調(diào)，APOB與APOA2顯著下調(diào)，具有統(tǒng)計學(xué)意義。KNG-1為激肽原1，是一種炎癥介質(zhì)，能引起血管通透性增加，并具有抑制凝血酶與纖溶酶聚集的功能[16]。已有研究報道，人陰虛上火后腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）表達(dá)水平顯著增加[17]。激肽原可以裂解產(chǎn)生血管舒緩激肽與高分子量激肽原，而高分子量激肽原能夠促進(jìn)單核細(xì)胞釋放TNF-α、IL-1β等細(xì)胞因子與趨化因子[18]。CD14是單核細(xì)胞分化抗原，Toll樣受體（tolllike receptor，TLR）的輔受體，參與炎癥反應(yīng)和機體的固有免疫反應(yīng)。已有報道指出，TNF-α可以上調(diào)CD14的表達(dá)[19]，而CD14可以介導(dǎo)負(fù)電性低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）促進(jìn)細(xì)胞因子釋放的作用[20]。因此，KNG-1、CD14是與陰虛上火免疫紊亂相關(guān)的重要蛋白，二者的上調(diào)說明了陰虛上火患者炎癥反應(yīng)增強。

APOB與APOA2為載脂蛋白。APOB具有介導(dǎo)乳糜微粒、LDL、極低密度脂蛋白運輸?shù)淖饔?，與血脂水平相關(guān)[21-22]。APOB是低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）的主要結(jié)構(gòu)蛋白，檢測其表達(dá)水平能夠反映LDL-C的含量變化。已有研究報道健康人體內(nèi)內(nèi)源性膽固醇的合成與極低密度脂蛋白-APOB-100亞組分的產(chǎn)生有關(guān)[23]；抑制APOB合成，能夠引起脂蛋白中的APOB含量降低[24]。因此，APOB的下調(diào)說明LDL-C的含量降低，可能影響總膽固醇水平和脂蛋白水平變化。

APOA2為高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）組分[25]，具有穩(wěn)定高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）、參與 HDL代謝的功能，其表達(dá)水平下調(diào)可能直接或間接影響總膽固醇水平[26]。本研究顯示，陰虛上火組受試者總膽固醇水平顯著下降，提示陰虛上火人群營養(yǎng)狀況改變。潘照等[27]的研究結(jié)果顯示，腸道菌群可引起“上火”人群普遍體內(nèi)能量代謝紊亂，進(jìn)一步印證了本實驗的結(jié)果。課題組前期研究同樣印證了這一點，陰虛上火大鼠模型的能量代謝增加，體型消瘦[28]。鑒于此，筆者認(rèn)為陰虛上火與機體免疫失調(diào)、能量代謝失衡有關(guān)，推測這4個蛋白與陰虛上火的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可作為診斷陰虛上火的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。

在此基礎(chǔ)上，運用ROC曲線分析了單個蛋白的敏感度和特異度，發(fā)現(xiàn)APOB的特異度低于60.00%，不適于作為潛在的生物學(xué)標(biāo)志物。再將APOA2、KNG-1、CD14進(jìn)行組合，結(jié)果提示其AUC值高于0.900，具有較高的準(zhǔn)確性，優(yōu)于單個蛋白質(zhì)的準(zhǔn)確性，且具有較好的敏感度和特異度。

綜上，本研究認(rèn)為陰虛上火與機體免疫失調(diào)、能量代謝失衡有關(guān)，陰虛上火人群血清4個特異蛋白（APOB、APOA2、KNG-1、CD14）出現(xiàn)差異表達(dá)，為中醫(yī)診斷陰虛上火提供了潛在的生物學(xué)診斷標(biāo)志物，為揭示陰虛上火的生物學(xué)機制提供了實驗依據(jù)，有助于從客觀上認(rèn)識與理解陰虛上火。