LPS誘導斑馬魚炎癥實熱模型構建及脂質生物標志物篩選研究

中國中醫(yī)科學院中藥研究所 北京 100700

細菌內毒素,又稱脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）,是所有革蘭陰性細菌細胞壁外膜的主要結構成分，由多糖和脂質A組成，能夠引起動物機體發(fā)熱、免疫功能紊亂、微循環(huán)障礙及多器官炎癥等[1-2]。LPS引起機體損傷的機制通常首先是激活單核-巨噬細胞系統，誘導分泌多種炎性介質分子，然后通過這些介質分子在局部或機體其它部分引發(fā)炎癥反應，造成損傷。另外，LPS還可直接作用于內皮細胞、成纖維細胞等靶細胞，使其表面分子表達異常，細胞膜通透性增加，而造成損傷[3-4]。LPS具有很強的致炎活性，根據中醫(yī)理論，內毒素屬于“熱邪”?，F代醫(yī)學的“炎”與中醫(yī)的“火”較相似，中醫(yī)所講的實熱證也屬于“炎癥”范疇[5-6]，因此推測LPS在誘導產生感染性炎癥的同時也會引發(fā)機體實熱癥狀。目前，對于LPS誘導炎癥的機制研究主要集中于抗炎藥物藥效的評價篩選，然而從內源性脂質分子層面的研究鮮有報道。

本實驗采用熒光標記轉基因中性粒細胞斑馬魚，建立LPS誘導的炎癥斑馬魚模型，結合活體成像系統實時監(jiān)測中性粒細胞炎癥遷移過程；計算熒光下斑炎癥馬魚中性粒細胞的個數。通過超高效液相色譜串聯質譜（ultra performance liquid chromatography-Q exactive-mass spectrometry,UPLC-QE-MS）技術進行脂質組學檢測，根據多元統計分析比較模型組和正常對照組斑馬魚的代謝圖譜，尋找潛在生物標志物，以期為LPS誘導的炎癥及可能引發(fā)的實熱癥狀的早期診斷和預防提供幫助。

1 材料和方法

1.1 主要儀器及試劑 DionexTMUltiMateTM3000超快速液相色譜、Q ExactiveTM四極桿軌道離子阱質譜、SavantTMSPD131DDA SpeedVacTM真空離心濃縮儀均為Thermo Fisher Scientific公司產品；Mix-3000震蕩混勻器購于杭州米歐儀器有限公司；Mikro 220R臺式高速冷凍離心機購于Hettich公司；SMZ645解剖顯微鏡、AZ100電動聚焦連續(xù)變倍熒光顯微鏡、與顯微鏡相連的相機（TK-C1481EC）均為日本Nikon公司產品；CP214精密電子天平為奧豪斯公司產品。

二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、甲基纖維素、LPS均購于Sigma公司（批號：BCBV2983、079K0054V、017M4112V）。甲酸、甲醇、乙腈均購于Fisher Scientific公司（批號：A117-50、A456-4、A955-4）；乙酸銨為Sigma-Aldrich公司產品（批號：238074-25G）。以上化學品和試劑均為分析純。

1.2 斑馬魚品系及飼養(yǎng)方法 熒光標記的轉基因中性粒細胞斑馬魚（3 dpf）60尾、28℃養(yǎng)魚用水（水質：每1L反滲透水加入200mg速溶海鹽，電導率為480～510μS/cm；pH 為 6.9～7.2；硬度為 53.7～71.6mg·L-1Ca-CO3）均由杭州環(huán)特生物科技股份有限公司養(yǎng)魚中心繁殖飼養(yǎng)并提供，實驗動物使用許可證號：SYXK（浙）2012-0171。飼養(yǎng)管理符合國際AAALAC認證的要求。

1.3 實驗方法

1.3.1 斑馬魚炎癥模型建立 3 dpf轉基因中性粒細胞斑馬魚中隨機選擇30尾，以卵黃囊注射LPS的給樣方式建立斑馬魚炎癥模型，余下30尾以養(yǎng)魚用水處理的斑馬魚設為正常對照組。兩組分別置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3h后，每組隨機取10尾斑馬魚在熒光顯微鏡下觀察、拍照并保存圖片；用尼康NIS-Elements D 3.10高級圖像處理軟件進行圖像分析，計算斑馬魚炎癥中性粒細胞個數（N），以斑馬魚炎癥中性粒細胞個數的統計學分析結果來評價LPS誘導的炎癥斑馬魚模型是否建立成功[7-8]。

1.3.2 樣品預處理 建模成功后，收集斑馬魚正常對照組和模型組樣本，向1.5mL EP管中加入氯仿:甲醇為3:1的混合物1mL，超聲15min震蕩提?。蝗∠聦勇确?00μL濃縮干燥，加入異丙醇:乙腈為1:1的混合物200μL復溶；渦旋15s，4℃下12 000r/min離心10min；取上清液100μL，置于內襯管中，進樣待測。

1.3.3 液相色譜-質譜聯用 （liquid chromatographymass spectrometry，LC-MS）檢測方法 液相色譜條件：采用DionexTMUltiMateTM3000快速液相色譜，色譜 柱 為 WatersUPLC HSST3（1.8μm，2.1mm ×100mm），流動相為 A（乙腈:水 4:6、0.1%甲酸、10mmol·L-1乙酸銨）和 B（乙腈:異丙醇 9:1、0.1%甲酸、10mmol·L-1乙酸銨）；流速為 0.3mL·min-1；進樣量為 1.0μL；柱溫：50℃；梯度洗脫條件為 0～2min，20～30 B%；2～5min，30～45 B%；5～6.5min，45～60 B%；6.5～12min，60～65 B%；12～14min，65～85 B%；14～17.5min，85～100 B%；17.5～18min，100～100 B%；18～18.1min，100～20 B%；18.1～19.5min，20～20 B%。

質譜條件：電噴霧離子源，正負離子檢測模式采集，離子源電壓分別為3.7kV和3.5kV；毛細管加熱溫度320℃；鞘氣壓力30psi，輔助氣壓力10psi；容積加熱蒸發(fā)溫度300℃；鞘氣和輔助氣均為N2，碰撞氣為N2，壓力為1.5mTorr。一級全掃描參數：分辨率70 000，自動增益控制目標為1×106，最大隔離時間50ms，質荷比掃描范圍50～1 500。

1.4 數據處理 采用Xcalibur 2.2 SP1.48軟件對采集的數據進行色譜峰識別、校正和歸一化處理，然后導入SIMCA 14.1軟件（Umetrics），對數據進行分組和正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA），O-PLS-DA模型下的S-plot圖上距原點越遠的點表明該差異物對模式識別模型的貢獻越大。以變量投影重要性指標（variable importance in the projection，VIP）＞1的脂類化合物作為對模型有貢獻度的標志物，模型組和正常對照組的組間比較采用Progenesis QI中的t檢驗，按P＜0.05及模型組與正常對照組之間的變化倍數（fold change，FC）來尋找正常對照組和模型組之間的差異變量。差異性代謝物的定性方法為：搜索HMDB（網址為http://www.hmdb.ca/）和 LIPIDMAPS（網址為http://www.lipidmaps.org/）等在線數據庫，比較一級質譜信息精確分子質量，誤差限制為0.01Da，通過多級質譜信息碎片推測代謝物結構。

2 結果

2.1 模型建立的評價 模型組斑馬魚炎癥部位中性粒細胞個數（18個）與正常對照組（2個）比較，差異具有統計學意義（P＜0.001），顯示LPS誘發(fā)轉基因中性粒細胞熒光斑馬魚炎癥模型建立成功。見圖1。

2.2 數據分析 利用ESI正負離子模式分別采集正常對照組和模型組樣本數據，采集過程中每間隔6～8個樣本插入1個質控樣本，用于監(jiān)測整個液質系統的穩(wěn)定性和重復性，同時計算質控樣本中提取的代謝特征的變異系數值，變異系數超過15%的代謝特征被刪除。采用監(jiān)督性的多維統計方法即OPLS-DA對代謝物進行分析，在正負離子模式下模型參數R2Y分別為0.911和0.770，表明炎癥模型建立成功。見圖2-3。根據VIP值、P值及FC值等指標衡量兩組之間差異脂質的變量權重，結果顯示正常對照組和模型組明顯分離，說明LPS對斑馬魚脂質代謝網絡產生較大影響。見圖4-5和表1。

圖1 斑馬魚正常對照組與模型組表型圖（80×）Fig.1 Zebrafish normal control group and model group phenotype map(80×)

2.3 組間潛在生物標志物鑒定 通過分析兩組間發(fā)生變化的內源性脂質差異物有助于推測疾病的發(fā)病機制，為臨床上對疾病的預防和治療奠定基礎。本研究共篩選鑒定出28個潛在生物標志物，包括16個磷脂酰膽堿、7個磷脂酰乙醇胺、2個磷脂酰絲氨酸、1個磷脂酸、1個磷脂酰肌醇、1個鞘磷脂。

圖2 正離子模式下模型組和正常對照組OPLS-DA二維得分圖及S-plot載荷圖Fig.2 Two-dimensional score map and S-plot load map of OPLS-DA in model group and normal control group in positive ion mode

圖3 負離子模式下模型組和正常對照組OPLS-DA二維得分圖及S-plot載荷圖Fig.3 Two-dimensional score map and S-plot load map of OPLS-DA in model group and normal control group in negtive ion mode

圖4-1 模型組和正常對照組PC含量比較Fig.4-1 Comparison of PC content in model group and normal control group

圖4-2 模型組和正常對照組PC含量比較Fig.4-2 Comparison of PC content in model group and normal control group

圖5-1 模型組和正常對照組其他脂類代謝差異物含量比較Fig.5-1 Comparison of other lipid metabolism discrepancy content in model group and normal control group

3 討論

脂質代謝與炎癥的關系早已引起廣泛關注，二者密切相關，炎癥可導致脂質代謝紊亂，脂質代謝失衡也可誘發(fā)炎癥反應。鑒于脂質成分與疾病的關系，探索其與疾病相關的生物學功能將有望為疾病的治療尋找到新的靶點[9-10]。有文獻報道細胞炎癥反應與脂質代謝之間的相互作用，脂質代謝紊亂會對引發(fā)炎癥產生影響[11-12]；曲楓[13]利用鞘脂組學分析技術，對乙肝及相關的慢性肝炎開展研究，結果表明，鞘脂代謝網絡的紊亂與疾病的發(fā)展密切相關，發(fā)現并確認了9個鞘脂生物標志物，為慢性乙肝疾病發(fā)病機制研究提供線索；賈志鑫[14]運用所建立的皮膚角質層鞘脂組學分析方法，找到了表征患病兒童與健康對照兒童差異以及表征不同組別患兒病變處皮膚與自身健康對照皮膚之間差異的潛在生物標志物。

斑馬魚具有成年魚個體小、易于飼養(yǎng)、發(fā)育快速、性成熟期短、繁殖力強、體外受精、胚胎透明且完善、易于觀察、適合進行顯微注射和細胞移植操作等特點[15]，且基因與人類高度同源，免疫系統與人類極為相似。因此，斑馬魚可以復制多種疾病模型，從而用于藥物活性、毒性的高通量篩選以及藥物代謝等方面的研究[16]。本實驗應用UPLC-QE-MS的脂質組學技術研究LPS誘導的炎癥斑馬魚與正常斑馬魚的脂質代謝差異，通過多元統計分析，發(fā)現了部分潛在的生物標志物。結果顯示，LPS誘導的內毒素炎癥可能與PC、PE、SM等代謝密切相關，會引起該類脂代謝紊亂。

圖5-2 模型組和正常對照組其他脂類代謝差異物含量比較Fig.5-2 Comparison of other lipid metabolism discrepancy content in model group and normal control group

PC是主要的外葉磷脂。在非神經元真核細胞中，膽堿主要用于合成PC。研究表明，LPS能夠誘使原代骨髓巨噬細胞極化，導致膽堿攝取率和PC合成水平增加，表現出炎癥狀態(tài)[17]。本實驗以LPS誘導炎癥斑馬魚模型，模型組斑馬魚體內的PC水平顯著升高，推測可能是由于膽堿的攝取增加導致PC的合成增加和炎癥的發(fā)生。PE的含量在生物界所存在的磷脂中僅次于PC，二者可以相互轉化。脂質過氧化產生多種脂質醛，最近研究表明PE是這些脂質醛的主要靶標，形成以醛修飾的PE（al-PE）作為炎癥介質的新型家族[18]，說明炎癥的發(fā)生有可能與某些PE的升高有關，這與本實驗中LPS誘導的炎癥斑馬魚體內PE（16:0/22:2）、PE（20:5/18:0）、PE（22:4/19:0）升高結果一致。SM被稱為“生物活性脂類”，是在炎癥反應中合成的一類物質。SM可以通過SM合成酶從神經酰胺合成，也可以通過鞘磷脂酶水解生成神經酰胺。其在細胞內的含量會隨著細胞外刺激的變化而改變，從而影響細胞生長、死亡，引發(fā)包括炎癥反應在內的多個生物學過程[19]。本研究中，在LPS誘導的炎癥斑馬魚模型中，SM水平顯著升高，可能是由于鞘磷脂酶的水解產生神經酰胺，神經酰胺的蓄積進一步導致了炎癥反應發(fā)生[20]。

表1 正負離子模式下模型組與正常對照組比較潛在生物標志物的鑒定結果Tab.1 Identification of potential biomarkers in model group compared with normal control group in positive and negative ion mode

本實驗從脂質組學的角度闡明LPS誘導炎癥斑馬魚模型體內脂質代謝特征，為進一步研究藥物干預后斑馬魚體內脂質代謝變化提供依據，同時為LPS誘導的感染性疾病的早期診斷和預防奠定基礎。