干姜附子肉桂湯誘導(dǎo)口腔潰瘍的機(jī)制研究

浙江中醫(yī)藥大學(xué) 杭州 310053

上火是指因精神緊張、過(guò)度勞累、辛熱藥食等引起的[1]，以人體頭面部口、舌、牙齦、咽喉、眼、鼻等部位皮膚黏膜出現(xiàn)紅腫熱痛、潰瘍癥狀為主要特征，并可伴有全身癥狀、反應(yīng)的一種輕微易反復(fù)的疾病[2]。上火癥狀雖有一定自限性，但嚴(yán)重者亦會(huì)變生其它病證?，F(xiàn)代社會(huì)由于飲食結(jié)構(gòu)的變化和競(jìng)爭(zhēng)的日益加劇，上火的發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，但目前對(duì)上火的病理生理機(jī)制還不是很清楚。

在上火的諸多癥狀中，口腔潰瘍具有典型代表性，類似于中醫(yī)的“口疳”“口瘍”“口瘡”，最早記載于《黃帝內(nèi)經(jīng)》，“歲金不及，炎火乃行……民病口瘡”。將口瘡的病因歸于為“火”，由此可見(jiàn)口腔潰瘍與“火”的關(guān)系密切。附子、肉桂、干姜是大辛大熱之品，長(zhǎng)期使用容易誘發(fā)口腔潰瘍等上火癥狀。在前期研究中，課題組利用干姜附子肉桂煎劑建立了大鼠上火模型，通過(guò)對(duì)血清和尿液代謝的研究，筆者推斷熱性藥可能通過(guò)導(dǎo)致機(jī)體上火進(jìn)而誘發(fā)口腔潰瘍。因此本課題以口腔潰瘍?yōu)榍腥朦c(diǎn)，通過(guò)干姜附子肉桂湯建立上火的大鼠模型，進(jìn)一步探討上火的發(fā)病機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性SD大鼠20只，6～8周齡，體質(zhì)量（150±20）g，購(gòu)于上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2013-0016]，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（浙）2018-0012]。所有大鼠均在全封閉清潔級(jí)狀態(tài)下隔離飼養(yǎng)，室溫20℃，相對(duì)濕度40%～60%，每日光照12h，自由攝食、飲水。

1.2 藥品與試劑 淡附片、干姜、肉桂均由浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠提供。HE染色試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：C0105）；HRP標(biāo)記的抗大鼠IgG抗體和抗大鼠IgA抗體購(gòu)自北京博奧森公司（批號(hào)：bs-0293R-HRP、bs-10491R-HRP）；RNA 試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司(批號(hào)：74104)；基因芯片由上海康成生物工程有限公司制備（L Series 90:RayBio Label-based Rat Antibody Array，AAR-BLM-1-2）。

1.3 主要儀器及軟件 Histocentres包埋機(jī)、HM 300E石蠟切片機(jī)均購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司；光學(xué)顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Zeiss公司；安捷倫微陣列芯片掃描儀購(gòu)自美國(guó)Agilent公司。

1.4 方法

1.4.1 藥品制備 稱取淡附片、干姜、肉桂各200g，以單蒸水800mL煎煮1h，共煎煮2次，然后將2次的中藥水煎劑混合，再以R202型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將其濃縮成1g·mL-1。中藥水煎劑大鼠灌胃量估算如下，首先以60kg體重的成人干姜附子肉桂湯藥物使用量代入公式，然后結(jié)合大鼠的體重，以下述公式換算出大鼠每日最大中藥煎劑的灌胃量，計(jì)算公式如下：K鼠/K人為人和小鼠間按體表面積換算的等效劑量比值。

1.4.2 動(dòng)物分組及給藥 將20只健康SD大鼠用完全隨機(jī)法分為兩組：對(duì)照組和模型組，每組各10只。兩組大鼠均以普通飼料喂養(yǎng)，其中對(duì)照組給予0.9%氯化鈉溶液0.1mL/（10g·d）灌胃；模型組給予1g·mL-1干姜附子肉桂水煎劑0.1mL/（10g·d）灌胃，均為1次/d，連續(xù)21d，觀察大鼠狀態(tài)。

1.4.3 樣品采集 灌胃第21天，以10%水合氯醛麻醉大鼠，劑量為0.33mL/100g，麻醉后腹主動(dòng)脈取血1mL，委托浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè)。用吸頭卡住大鼠兩側(cè)口角，令其開(kāi)口，剪刀剪取口腔黏膜組織，一部分以10%中性甲醛溶液固定，用于病理切片HE染色和免疫組化檢測(cè)，另一部分以PBS清洗后-80℃凍存，用于基因芯片檢測(cè)。

1.4.4 HE染色觀察口腔黏膜組織病理變化 取大鼠口腔黏膜組織，10%中性甲醛溶液固定后，脫水、包埋、HE染色試劑盒染色，用病理切片掃描儀掃描切片，觀察口腔黏膜組織病理變化。

1.4.5 免疫組化檢測(cè)口腔黏膜組織IgG和IgA的表達(dá) 取口腔黏膜組織，10%中性甲醛溶液固定后，脫水、包埋、烤片、脫蠟、抗體孵育、DAB顯色液顯色、染色、封片，400倍光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.4.6 基因芯片的檢測(cè)與分析 兩組各取4只大鼠的口腔黏膜組織。實(shí)驗(yàn)采用全基因表達(dá)譜（the Whole Genome Oligo Array，4x44K，Agilent Technologies），陣列由Agilent Scanner G2505C掃描，獲得的陣列圖像通 過(guò) AgilentFeature Extraction Software（version 11.0.1.1）進(jìn)行分析。后期基因芯片數(shù)據(jù)分析包括原始數(shù)據(jù)歸一化分析、基因表達(dá)分析、差異基因篩選、差異基因的GO富集分析和KEGG Pathway分析等。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，兩組間差異比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?；蛐酒Y(jié)果的原始數(shù)據(jù)用軟件 Agilent Feature Extraction Software（v11.0.1.1）歸一化，后續(xù)數(shù)據(jù)處理通過(guò)Agilent GeneSpring GX（v12.1）進(jìn)行，最后通過(guò)Volcano Plot篩選差異性表達(dá)基因。以Ratio值＞1.5，表達(dá)差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）≥2.0，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠基本狀態(tài)比較 灌胃過(guò)程中和灌胃后，兩組大鼠均無(wú)死亡。灌胃21d后，與對(duì)照組比較，模型組大鼠皮毛粗糙、舌質(zhì)暗紅，并且行動(dòng)更加頻繁，難以捕捉。

2.2 兩組大鼠血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果比較 灌胃21d后，對(duì)照組大鼠的白細(xì)胞（white blood cell，WBC）計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞（neutrophil，NEUT）、淋巴細(xì)胞（lymphocyte，Lymph）計(jì)數(shù)和中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比值（neutrophils-lymphocyte ratio，NLR），與灌胃前比較，略微降低，單核細(xì)胞（monocyte，MONO）計(jì)數(shù)略有升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。模型組以干姜肉桂附子湯灌胃 21d后，WBC、NEUT、MONO 計(jì)數(shù)、NLR 均升高，其中NEUT、NLR和MONO升高明顯，與灌胃前比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），Lymph稍有降低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 兩組大鼠血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果（±s）Tab.1 The results of blood routine examination in two groups(±s）

表1 兩組大鼠血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果（±s）Tab.1 The results of blood routine examination in two groups(±s）

注：與模型組灌胃前比較，*P＜0.05，**P＜0.01。Note:Compared with model group before intragastric administration,*P＜0.05,**P＜0.01.

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2.3 兩組大鼠口腔黏膜病理學(xué)檢測(cè)比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠口腔黏膜組織發(fā)生表皮脫落、炎性浸潤(rùn)的現(xiàn)象。見(jiàn)圖1。

圖1 大鼠口腔黏膜病理學(xué)檢測(cè)（HE染色）Fig.1 HE staining of oral mucosa in rats(HE staining)

2.4 兩組大鼠口腔黏膜IgG和IgA表達(dá)比較 IgG染色和IgA染色顯示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠的口腔黏膜組織均表現(xiàn)出角化層與顆粒層變薄收縮的現(xiàn)象。IgG染色顯示，模型組的口腔黏膜組織棘層與基底層IgG陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞多于對(duì)照組。見(jiàn)圖2。IgA染色顯示，模型組棘層與基底層中IgA陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞多于對(duì)照組，見(jiàn)圖3。

2.5 基因芯片檢測(cè)結(jié)果

2.5.1 差異基因篩選 結(jié)果顯示模型組與對(duì)照組的口腔黏膜組織基因存在顯著差異。模型組與對(duì)照組相比較發(fā)現(xiàn)463個(gè)差異表達(dá)基因，模型組中有299個(gè)基因表達(dá)高于對(duì)照組，164個(gè)基因表達(dá)低于對(duì)照組。見(jiàn)圖4。紅點(diǎn)代表具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異表達(dá)的基因，垂直線代表P值，水平線代表差異倍數(shù)變化。

圖2 兩組大鼠口腔黏膜免疫組化IgG染色結(jié)果（400×）Fig.2 The results of IgG immunohistochemical staining in two groups(400×)

圖3 兩組大鼠口腔黏膜免疫組化IgA染色結(jié)果（400×）Fig.3 The results of IgA immunohistochemical staining in two groups(400×)

2.5.2 差異基因KEGG信號(hào)通路分析和GO富集分析 根據(jù)最新的（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫(kù)和GO分析，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行分析。結(jié)果顯示模型組與對(duì)照組的差異表達(dá)基因主要與代謝、細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)、甘油三酯（triglyceride,TAG）的生物合成、細(xì)胞黏附、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能密切相關(guān)。信號(hào)通路分析顯示，差異基因主要涉及脂肪的消化與吸收、類固醇生物合成、細(xì)胞外基質(zhì)-受體相互作用（extracellular matrix-receptor interaction,ECM-receptor interaction）、黏著斑通路、缺氧誘導(dǎo)因子-1信號(hào)通路（hypoxia-inducible factors-1 signalingpathway， HIF-1 signalingpathway）、磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B信號(hào)通路（phosphatidylinositol 3'-kinase-protein kinase B signaling pathway，PI3K-Akt signaling pathway）等。上調(diào)與下調(diào)的信號(hào)通路見(jiàn)圖5。其中主要信號(hào)通路及主要差異基因見(jiàn)表2，表3則是表2中差異基因的概括。

圖4 差異基因火山圖Fig.4 Volcano map of genes with significant differences

圖5 差異表達(dá)基因的Pathway分析Fig.5 Pathway analysis of differentially expressed genes

表2 差異基因主要涉及的Pathway分析Tab.2 Main Pathway analysis of differential genes

表3 主要通路中的基因分析Tab.3 Gene analysis in the main pathway

3 討論

上火屬于傳統(tǒng)的中醫(yī)學(xué)俗語(yǔ)，一般指體內(nèi)陰陽(yáng)失衡導(dǎo)致的目赤、咽痛、口干、口腔潰瘍、牙齦腫痛、便秘、尿赤等臨床表現(xiàn)，雖然現(xiàn)代醫(yī)學(xué)并無(wú)與上火相對(duì)應(yīng)的疾病診斷，但是上火在臨床上是一種常見(jiàn)的綜合征，而且與飲食、勞倦、氣候有關(guān)[2]。清代《王九峰醫(yī)案·咳嗽》中云：“咳嗽氣喘，胸中氣急且悶，多食不舒，甚則頭面上火。”[3]指出上火的好發(fā)部位在頭面部，并多表現(xiàn)為頭面部的黏膜損傷性病變[2]，而口腔潰瘍正是其中的典型代表。

熱性中藥辛熱燥烈，易耗陰動(dòng)火，過(guò)服會(huì)耗傷陰津，陰液不足則誘發(fā)虛熱證[4]。干姜附子肉桂湯作為熱性藥中具有代表性的一個(gè)方子，臨床經(jīng)驗(yàn)提示，長(zhǎng)期使用易誘發(fā)口腔潰瘍等上火癥狀。1987～1989年用此復(fù)方制造的熱證動(dòng)物模型研究證明，附子、干姜、肉桂三藥合用對(duì)大鼠有增強(qiáng)代謝功能和增加耗氧量的作用[5]。后期進(jìn)一步研究表明，附子、干姜、肉桂灌胃的大鼠可以選作為熱證模型[6]。本研究中，利用干姜附子肉桂湯灌胃建立了上火大鼠模型，該模型大鼠表現(xiàn)出了上火的一系列癥狀，采用基因芯片技術(shù)檢測(cè)上火大鼠口腔黏膜組織發(fā)現(xiàn)，干姜附子肉桂湯灌胃的大鼠其多種基因水平發(fā)生改變，這可能是上火引發(fā)口腔潰瘍的機(jī)制之一。

經(jīng)干姜肉桂附子湯灌胃21d后，血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組大鼠的WBC、NEUT、MONO、NLR均升高。其中NLR是系統(tǒng)炎性反應(yīng)的評(píng)價(jià)指標(biāo)，反映炎癥激活因子和免疫調(diào)節(jié)因子之間的平衡狀態(tài)，NLR升高反映機(jī)體炎性反應(yīng)激活和免疫能力低下[7]。因此血常規(guī)結(jié)果提示模型組大鼠可能出現(xiàn)上火現(xiàn)象，并有炎癥傾向。有研究表明口腔潰瘍?cè)缙诳梢?jiàn)毛細(xì)血管明顯擴(kuò)張、充血，隨后血管周圍和黏膜下出現(xiàn)淋巴細(xì)胞密集浸潤(rùn)，同時(shí)中性粒細(xì)胞散在浸潤(rùn)，最終出現(xiàn)黏膜潰破[8]。HE染色結(jié)果顯示模型組大鼠的口腔黏膜組織發(fā)生表皮脫落、炎性浸潤(rùn)，角化層與顆粒層出現(xiàn)變薄收縮，提示大鼠的口腔黏膜組織有一定的損傷。同時(shí)，免疫組化的結(jié)果顯示模型組口腔黏膜組織的IgG和IgA的表達(dá)均升高，表明模型組的口腔黏膜組織出現(xiàn)了炎癥反應(yīng)。以上結(jié)果表明模型組大鼠已經(jīng)上火并誘發(fā)了口腔潰瘍，造模成功。

利用基因芯片技術(shù)人們不但可以對(duì)很多基因的功能進(jìn)行研究，同時(shí)還可以利用整體研究的特色從基因?qū)哟螌?duì)疾病精確分類[9]?；蛐酒夹g(shù)分析結(jié)果顯示，對(duì)照組與模型組的口腔黏膜組織在代謝、細(xì)胞黏附等方面的基因表達(dá)存在較大差異。雖然基因芯片得出較多差異基因，本文結(jié)合通路分析，選擇了與本研究相關(guān)性最強(qiáng)，而且FC相對(duì)較高的兩個(gè)基因進(jìn)行重點(diǎn)討論。在脂肪的消化與吸收相關(guān)基因中，與對(duì)照組相比，模型組二脂酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶2（acyl CoA：diacylgycerol acyltransferase 2，DGAT2）表達(dá)升高。DGAT2是一種完整的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)微粒體酶，是催化TAG合成最后一步反應(yīng)的酶，也是TAG合成過(guò)程中唯一的關(guān)鍵酶和限速酶[10-11]。DGAT2在脂質(zhì)代謝中扮演著十分重要的角色，是脂肪合成的限速酶[12-13]，其催化產(chǎn)生的TAG是真核生物中性脂類的主要貯存形式[14-15]。TAG在絕大多數(shù)植物和動(dòng)物體內(nèi)是最重要的脂類貯藏形式[16]，在營(yíng)養(yǎng)缺乏和應(yīng)激時(shí)提供能量[17]。在上火的一系列癥狀中如口瘡、牙宣等都是以頭面部黏膜損傷為主，而導(dǎo)致黏膜免疫系統(tǒng)異常的主要原因就是能量代謝紊亂。本實(shí)驗(yàn)中模型組大鼠口腔黏膜組織中DGAT2基因表達(dá)水平相對(duì)升高，說(shuō)明模型組大鼠口腔黏膜組織的脂質(zhì)代謝水平受到影響。

ECM受體相互作用和黏著斑通路相關(guān)基因中，模型組的Ⅺ型膠原α2（collagen typeⅪ alpha-2，COL11A2）基因表達(dá)低于對(duì)照組。膠原蛋白是蛋白質(zhì)的一種，是ECM的主要成分[18]。細(xì)胞通過(guò)ECM的黏附作用能夠動(dòng)態(tài)地感知周圍環(huán)境的變化[19]。ECM能夠維持正常細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，其合成和代謝不平衡會(huì)引起基質(zhì)硬度的變化，特別是蛋白質(zhì)的大量堆積容易導(dǎo)致ECM物理硬度發(fā)生變化[20]，進(jìn)而影響?zhàn)ぶ叩男纬珊图?xì)胞的黏附作用，而細(xì)胞黏附作用的改變會(huì)造成細(xì)胞一系列生物學(xué)功能的改變[21]。模型組大鼠的口腔黏膜組織中的COL11A2表達(dá)降低，從而影響了ECM受體相互作用及黏著斑的形成，造成ECM合成和代謝的不平衡，影響了ECM對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用。

基因芯片結(jié)果說(shuō)明模型組大鼠脂肪的消化和吸收增強(qiáng)，ECM受體相互作用和黏著斑的形成受阻，從而對(duì)口腔黏膜組織的外層保護(hù)作用降低，同時(shí)伴有一些基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)增強(qiáng)，以上綜合因素可能是上火引起的口腔潰瘍發(fā)作的原因。本研究利用基因芯片的方法，通過(guò)對(duì)上火模型大鼠的口腔黏膜組織進(jìn)行研究，找出了其中的差異表達(dá)基因，為熱性藥引起的機(jī)體上火的發(fā)病機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。運(yùn)用現(xiàn)代多學(xué)科的技術(shù)方法，開(kāi)展上火發(fā)病機(jī)制的研究，有助于揭示其科學(xué)內(nèi)涵，豐富中醫(yī)學(xué)理論，對(duì)預(yù)防相關(guān)疾病的發(fā)生和促進(jìn)中醫(yī)理論的現(xiàn)代化也具有重要意義。