基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的血清代謝組學(xué)在中醫(yī)上火研究中的應(yīng)用

吳德鴻周佳李倩倩譚祖教范永升

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院 杭州 310005 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

“上火”的概念源于中醫(yī)學(xué)對人體和疾病的認(rèn)識，但中醫(yī)學(xué)中尚無專門論述，其內(nèi)容散見于中醫(yī)火熱病證中。上火的基本病機(jī)為陰陽失衡，火熱上炎于頭面，其臨床表現(xiàn)主要以口舌生瘡、口腔潰瘍、牙齦及咽喉腫痛、眼睛紅腫等頭面部癥狀為主，也常兼見心煩易怒、小便色黃、大便秘結(jié)等熱證表現(xiàn)，屬中醫(yī)學(xué)“火熱”證的范疇。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)至今還未有與上火相對應(yīng)的病名，一般認(rèn)為上火與機(jī)體免疫功能失調(diào)情況下出現(xiàn)的局部感染或炎癥反應(yīng)相類似，同時(shí)認(rèn)為上火是機(jī)體受到外界應(yīng)激負(fù)荷后在生理和心理上產(chǎn)生的一種不協(xié)調(diào)的應(yīng)激反應(yīng)，是機(jī)體失去內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定而出現(xiàn)的身心疲勞狀態(tài)，其發(fā)生可能與機(jī)體的神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)失衡相關(guān)。隨著亞健康觀念的提出以及人們對健康追求的逐步重視，在祖國醫(yī)學(xué)對上火認(rèn)識的基礎(chǔ)上，運(yùn)用現(xiàn)代的科學(xué)技術(shù)方法，開展上火的病理機(jī)制研究，不僅能夠豐富其內(nèi)涵，同時(shí)對于上火的防治也有著重要的現(xiàn)實(shí)意義。

代謝組學(xué)以病理生理等刺激下機(jī)體內(nèi)源性代謝物發(fā)生的相應(yīng)變化為研究對象，可以從整體上反映機(jī)體在疾病發(fā)生發(fā)展過程的代謝狀態(tài)改變，有助于闡明病變過程，為疾病預(yù)防、診斷提供有用信息。目前代謝組學(xué)被廣泛用于疾病診斷、藥物安全性評價(jià)、發(fā)病機(jī)制探討、藥物作用機(jī)制研究等醫(yī)藥相關(guān)領(lǐng)域[1-3]。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）技術(shù)具有分離能力強(qiáng)、檢測靈敏度高、分析通量高、檢測范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，在代謝組學(xué)研究中應(yīng)用非常廣泛。

本研究以在校學(xué)生及教師為研究對象，采用LCMS技術(shù)對上火和非上火人群血清中代謝物進(jìn)行檢測，并結(jié)合多變量和單變量統(tǒng)計(jì)挖掘出上火后發(fā)生顯著變化的血清代謝物，進(jìn)一步進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，以期從代謝角度為上火機(jī)制的深入研究提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要儀器 LC 1260/Q-TOF 6520液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀為美國Agilent公司產(chǎn)品；Labconco CentriVap System冷凍離心濃縮儀為美國Labconco公司產(chǎn)品；超純水由Milli-Q系統(tǒng)（美國Millipore公司產(chǎn)品）制備。

1.2 試劑 色譜純乙腈購于Sigma公司（批號：SHBB8059V）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 上火的診斷標(biāo)準(zhǔn) 采用專家咨詢法，通過多輪專家咨詢，確定了上火的診斷標(biāo)準(zhǔn)：1個(gè)主證（頭面部癥狀）或2個(gè)次證（至少1個(gè)為頭面部癥狀）。其中上火頭面部主證：牙齦腫痛、咽喉腫痛、口臭、口腔潰瘍、鼻瘡癤、熱瘡（顏面部皰疹）、口苦、目赤干澀；上火頭面部次證：口角糜爛、目眵增多、舌痛、口渴、鼻衄、鼻腔干燥、齒衄、痤瘡、聲音嘶啞、頭痛；非頭面部癥狀：大便干結(jié)、心煩、小便黃、多食易饑、五心煩熱、痔瘡發(fā)作、潮熱、失眠。

1.3.2 樣本的收集和前處理 選取2013年3月至5月浙江中醫(yī)藥大學(xué)在校學(xué)生及教師54例，年齡22～3 6歲，無重大疾病，排除妊娠、哺乳期婦女和其他不適宜入選的情況。其中符合納入標(biāo)準(zhǔn)的上火病例30例，年齡（22.0±1.3）歲；作為對照組的非上火人群24例，年齡（23.1±3.1）歲。兩組受試者年齡無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。受試者填寫調(diào)查表，空腹?fàn)顟B(tài)下以促凝管采集血5mL，2 000r/min離心分離血清，-80℃保存。

分析前，血清于室溫下解凍并混勻，取100μL血清，加入4倍體積冷乙腈，渦旋后4℃下12 000r/min離心10min沉淀蛋白，取上清液用于分析。同時(shí)，所有血清樣本分別取20μL，混勻后按照上述方法進(jìn)行相同前處理，制備質(zhì)量控制（quality control，QC）樣本。

1.3.3 代謝數(shù)據(jù)采集 以LC-MS作為分離檢測平臺，研究上火人群的血清代謝特征，在質(zhì)譜正離子模式下采集數(shù)據(jù)。色譜條件為：ZORBAX SB-Aq C18柱（2.1mm×50mm×1.8μm，Agilent）用于色譜分析，進(jìn)樣量5μL，柱溫保持在30℃。流動(dòng)相A為0.1%甲酸/水，流動(dòng)相B為0.1%甲酸/乙腈。流速為0.3mL/min，洗脫梯度為：20%B 起始，0～8min 線性升至 50%B，8～12min線性升至 55%B，12～18min線性升至 75%B，18～20min線性升至98%B，在98%B保持2min，然后降至20%B并保持6min以平衡色譜柱。

質(zhì)譜條件為：電噴霧離子源（electrospray ion source，ESI），采用正離子模式檢測，使用高純N2輔助噴霧電離與脫溶劑，干燥氣溫度350℃，流速為9L/min，霧化氣壓40psi；離子源溫度350℃，毛細(xì)管電壓為4 000V，溶劑化離子去簇電壓175V，錐孔電壓65V，Centroid模式采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)，每0.50s采集1次；質(zhì)量掃描范圍m/z 50～1 000。分析過程中采用參比溶液對質(zhì)量軸進(jìn)行同步實(shí)時(shí)校正。靶標(biāo)二級質(zhì)譜分析用來輔助鑒定代謝物，碰撞能量為10、20、40eV。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析 通過安捷倫MassHunter定性分析軟件（美國Agilent公司產(chǎn)品）進(jìn)行分子特征提?。╩olecuar features extraction algorithm，MFE），實(shí)現(xiàn)對譜圖中代謝特征的識別，包括濾噪和同位素峰合并。提取參數(shù)：保留時(shí)間為 0.6～22min，質(zhì)荷比為 50～1 000m/z，信號閾值為100counts，化合物閾值為2 000counts。將MFE后生成的CEF文件導(dǎo)入到Mass Profiler Professional軟件（美國Agilent公司產(chǎn)品）進(jìn)行色譜與質(zhì)譜匹配。色譜匹配時(shí)使用默認(rèn)設(shè)置，質(zhì)譜匹配窗口值為20mDa+50ppm。匹配完成后形成包含保留時(shí)間、質(zhì)量數(shù)、響應(yīng)值信息的峰表。QC樣本中相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）大于30%的變量被刪除，以保證數(shù)據(jù)的可靠性，另外，對于超過30%樣品中響應(yīng)值為“0”的離子采取過濾處理以減小缺失值的影響。

多元統(tǒng)計(jì)分析在SIMCA-P 11.0軟件（瑞典Umetrics Corp公司產(chǎn)品）中完成。采用主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交信號校正-偏最小二乘判別分析（orthogonal signal correction-partial least squares discriminant analysis，OSC-PLS DA）對上火和非上火血清樣本進(jìn)行分型，篩選變量重要性因子（variable importance in the projection，VIP）＞1 的變量進(jìn)行后續(xù)的t檢驗(yàn)，t檢驗(yàn)在SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件中完成。VIP＞1且在兩組內(nèi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的變量（P＜0.05）對兩組樣品的區(qū)分起了重要作用，之后對這些差異代謝物進(jìn)行靶標(biāo)二級質(zhì)譜分析以鑒定其結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 分析方法考察 儀器分析過程中將QC樣本均勻地插入分析序列中用于監(jiān)控整個(gè)樣品分析過程中的儀器狀態(tài)波動(dòng)情況，以確保數(shù)據(jù)的可靠性，每分析10個(gè)樣本插入1個(gè)QC，樣品分析順序完全隨機(jī)以減少系統(tǒng)誤差。圖1為典型的LC-MS代謝指紋譜。

圖1 典型的血清HPLC-MS代謝指紋譜Fig.1 Representative serum metabolic profile analyzed by LC-MS

在7個(gè)QC樣本中代謝物響應(yīng)值的RSD分布趨勢見圖2A。在所有QC樣本中超過78.01%的變量響應(yīng)值RSD＜30%。刪除QC中RSD＞30%的變量，同時(shí)排除樣品中出現(xiàn)頻率＜70%的變量，最終保留了521個(gè)變量的信息，對代謝數(shù)據(jù)進(jìn)行單位方差標(biāo)度化轉(zhuǎn)換，即每個(gè)變量除以該變量方差的平方根，從而在一定程度上消除了響應(yīng)差異的影響又不至于放大系統(tǒng)偏差。在PCA分析中，QC樣本緊密地聚集在PCA得分圖的幾何中心附近，表明分析過程中代謝物分析的質(zhì)量控制良好,得到的代謝數(shù)據(jù)可靠。見圖2B。

2.2 上火與非上火人群的模式識別分析 采用非監(jiān)督的PCA對兩組樣本的整體代謝輪廓進(jìn)行分析，上火和非上火人群在PCA二維得分圖上無明顯分離（圖2B），這可能與飲食和環(huán)境等因素造成的樣本不均一性有關(guān)；為了更好地建立模型及提高模型預(yù)測能力，進(jìn)一步對數(shù)據(jù)進(jìn)行正交信號校正（orthogonal signal correction，OSC），濾除與分類無關(guān)的信息（飲食、環(huán)境等影響）之后進(jìn)行PLS DA建模。圖3A顯示兩組人群得到了很好的分離，表明上火后代謝表型出現(xiàn)一定的變化。模型參數(shù)良好，R2Y（cum）=0.992，Q2（cum）=0.960。圖3B是OSC-PLS DA 第一主成分V圖。以代謝物在上火人群與非上火人群的濃度比值取log2對數(shù)為橫坐標(biāo)，t檢驗(yàn)P值取-log10對數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制代謝物火山圖。火山圖顯示LC-MS檢測到的血清代謝物中，上火后55個(gè)發(fā)生顯著變化，且大部分濃度發(fā)生下調(diào)。見圖3C。

圖2 代謝物RSD分布情況和PCA分析得分圖Fig.2 The RSD distribution plot of QC samples and PCA score plot

圖3 上火與非上火人群的代謝差異分析Fig.3 Metabolic difference between Shanghuo patient and control groups

2.3 上火人群血清差異代謝物 結(jié)合火山圖和VIP值篩選出上火與非上火人群存在顯著差異的代謝物，部分差異代謝物結(jié)構(gòu)已經(jīng)確認(rèn)，主要是脂類物質(zhì)，包括2種磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）、2種溶血磷脂酰膽堿（lysophosphatidylcholine，LPC）、1 種磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）、1種溶血磷脂酰乙醇胺（lysophosphatidylethanolamine，LPE）、2種鞘脂（sphingolipid，SM）、1種甘油三酯（triglyceride，TAG）及膽紅素（bilirubin）等，上述代謝物在上火后下調(diào)明顯（P＜0.05）。見圖 4。

3 討論

上火是民間的一種俗稱，概念形成于祖國醫(yī)學(xué)對其癥狀和病因病機(jī)的樸素認(rèn)識。中醫(yī)學(xué)著述中未對上火進(jìn)行專門論述，但其癥狀表現(xiàn)與中醫(yī)學(xué)中的“牙宣”“口瘡”“唇風(fēng)”“目赤”等相類似。上火發(fā)病部位多位于人體的頭面之上，因此，從發(fā)病部位而言，上火具有“在上之火”的含義，符合“火熱上炎”的特性，其是由多種原因引起陰陽失調(diào)、火熱偏盛而導(dǎo)致的一系列以頭面部為主的癥狀，其臨床表現(xiàn)主要為口舌生瘡、口腔潰瘍、口眼干燥、牙齦及咽喉腫痛、眼睛紅腫、痤瘡等，同時(shí)也常兼見心煩易怒、小便色黃、大便秘結(jié)等火熱證表現(xiàn)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對上火的研究較少，認(rèn)為上火與多種因素引起的神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)失衡以及能量代謝相關(guān)聯(lián)，但也有少量的實(shí)驗(yàn)研究成果，如陳娟等[4]發(fā)現(xiàn)實(shí)熱上火人群體內(nèi)多種蛋白表達(dá)發(fā)生異常，如載脂蛋白C3、乳酸脫氫酶等上調(diào)，載脂蛋白A4、超氧化物歧化酶3、纖溶酶原激活物抑制劑1等下調(diào)。筆者前期研究也發(fā)現(xiàn)，實(shí)熱上火人群體內(nèi)三羧酸循環(huán)、脂肪酸代謝、氨基酸代謝發(fā)生特異性變化[5]。

代謝組學(xué)運(yùn)用現(xiàn)代化的儀器設(shè)備和分析技術(shù)檢測機(jī)體整個(gè)代謝產(chǎn)物譜的變化，并通過多元統(tǒng)計(jì)分析方法研究整體的生物學(xué)功能狀況，與中醫(yī)的整體觀相吻合?；贚C-MS技術(shù)的代謝組學(xué)平臺分析范圍廣、靈敏度高，因而可全面地表征上火人群血清代謝組的特異性變化，為進(jìn)一步探索上火的發(fā)病機(jī)制提供參考依據(jù)。本研究采用LC-MS技術(shù)檢測上火人群和非上火人群的血清代謝物后發(fā)現(xiàn)，上火人群與非上火人群的代謝譜存在顯著差異，部分差異代謝物結(jié)構(gòu)已經(jīng)確認(rèn)，主要是脂類物質(zhì)，如 PC（34:1）、PC（38:7）、LPC（18:1）、LPC（16:0）、LPE（18:2）、PE（34:2）、SM（44:2）、SM（40:2）、TAG（53:3）及膽紅素等，以上代謝物在上火人群中明顯低于非上火人群。

從上述結(jié)果可見，上火人群血清異常代謝物主要是脂類物質(zhì)和膽紅素等。有文獻(xiàn)報(bào)道脂與類脂成分改變可作為細(xì)胞老化的標(biāo)志，脂質(zhì)過氧化對細(xì)胞有損害作用并與細(xì)胞老化有關(guān)[6]?；钚匝踝杂苫╮eactive oxygen species，ROS）是造成衰老的主要因素，細(xì)胞膜上含不飽和脂肪酸側(cè)鏈的磷脂是天然的抗氧化物質(zhì)，可與ROS反應(yīng)，使之被清除，而反應(yīng)生成的過氧化脂質(zhì)會破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能。研究證實(shí)，許多衰老有關(guān)的疾病如動(dòng)脈硬化癥、高血壓、阿爾茲海默癥以及帕金森病等的發(fā)生發(fā)展與脂質(zhì)的異常變化有關(guān)[7-9]。本研究發(fā)現(xiàn)上火人群體內(nèi)多種含不飽和脂肪酸鏈的磷脂水平明顯下降，這可能與上火后氧化應(yīng)激水平的升高有關(guān)。林富祥等[10]采用大學(xué)生“上火”調(diào)查問卷的形式對1 051名在校大學(xué)生進(jìn)行流行病學(xué)問卷調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)常熬夜、壓力過大以及辛辣食物是引發(fā)上火的主要原因，而這些因素也是加速人體衰老的原因，可見上火與衰老是有相關(guān)性的。摒棄不良的生活習(xí)慣、緩解工作和生活壓力不僅可以預(yù)防上火，還可減緩人體的衰老。

圖4 差異代謝物在上火和非上火人群中的變化Fig.4 Significant differential metabolites between Shanghuo patient and control group

血清膽紅素是血紅素代謝的終產(chǎn)物，以往僅用于臨床肝膽疾病的診斷。自1987年發(fā)現(xiàn)膽紅素有抗氧化作用以來，有關(guān)膽紅素的研究越來越受到關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)膽紅素是生理性的抗氧化劑，它不僅能抑制脂質(zhì)氧化及ROS的形成，還能抑制免疫反應(yīng)及炎癥反應(yīng)[11-12]。因此，筆者推測上火主要表現(xiàn)為口腔潰瘍、口瘡等一些頭面部的炎癥反應(yīng)，這與膽紅素的含量減少不能有效抑制免疫反應(yīng)及炎癥反應(yīng)相關(guān)。

上火的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜過程，涉及到免疫、內(nèi)分泌、神經(jīng)、代謝等多個(gè)系統(tǒng)，本研究運(yùn)用代謝組學(xué)中的LC-MS技術(shù)從整體上檢測上火人群血清代謝物的變化，發(fā)現(xiàn)血清中多種脂類物質(zhì)和膽紅素水平均有一定程度下調(diào)，可能與上火人群體內(nèi)炎癥反應(yīng)加強(qiáng)、氧化應(yīng)激水平升高有關(guān)。下一步將運(yùn)用這些最下游的血清代謝物來回溯其上游相關(guān)信號通路中蛋白、基因的表達(dá)，以更好地闡述上火的病理機(jī)制，這也是筆者運(yùn)用代謝組學(xué)研究上火的重要目標(biāo)。