miRNA調(diào)控成骨分化及礦化的研究進(jìn)展

袁嘉堯 林燕平 黃佳純 黃宏興

1廣州中醫(yī)藥大學(xué)（廣州510000）；2廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院骨科（廣州510000）

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis）是以骨量減少、骨質(zhì)量受損及骨強(qiáng)度降低，導(dǎo)致骨脆性增加、易發(fā)生骨折為特征的全身性骨病，臨床表現(xiàn)主要有周身疼痛、身高降低、駝背、脆性骨折及呼吸系統(tǒng)受影響等［1］。流行病學(xué)調(diào)查［2］發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松癥已經(jīng)成為我國(guó)50 歲以上人群的重要健康問(wèn)題：50 歲和65 歲以上人群骨質(zhì)疏松癥患病率分別為19.2%和32%；其中，中老年女性骨質(zhì)疏松問(wèn)題尤為嚴(yán)重。由于骨質(zhì)疏松癥的患病人數(shù)較多，其臨床癥狀及并發(fā)癥嚴(yán)重影響老年人的生存質(zhì)量，危害他們的生命安全；而對(duì)骨質(zhì)疏松癥的診斷多依靠疾病發(fā)生后的表現(xiàn)，如骨密度下降、出現(xiàn)全身骨痛癥狀或者發(fā)生脆性骨折等。因此，探討骨質(zhì)疏松癥防治和預(yù)測(cè)方法具有重要的臨床意義。

miRNA 是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的具有重要細(xì)胞調(diào)節(jié)作用的微小RNA 家族，參與了一系列細(xì)胞活動(dòng)的調(diào)節(jié)，包括細(xì)胞分化、增殖和凋亡；加強(qiáng)對(duì)miRNA調(diào)控成骨分化及礦化功能的調(diào)節(jié)機(jī)制的研究，有助于發(fā)現(xiàn)防治骨質(zhì)疏松癥的新位點(diǎn)和研制新藥物，創(chuàng)新防治及預(yù)測(cè)骨質(zhì)疏松癥的方法。

1 miRNA 概述

miRNA 是一類非編碼、單鏈RNA 分子，大約由21 ～25 個(gè)核苷酸組成，負(fù)責(zé)調(diào)控基因的表達(dá)。由于編碼miRNA 內(nèi)5 ～7 個(gè)核苷酸核心的種子序列的堿基配對(duì)不完美，因此可以潛在地識(shí)別許多用于結(jié)合的mRNA 序列；這些miRNA 已經(jīng)成為多細(xì)胞動(dòng)物和植物基因表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，通過(guò)與mRNA 的3′非翻譯區(qū)（UTR）中的互補(bǔ)序列結(jié)合，發(fā)揮其阻斷蛋白質(zhì)翻譯和調(diào)節(jié)mRNA穩(wěn)定性的作用［3］。研究人員預(yù)測(cè)在哺乳動(dòng)物中大約有30%的蛋白質(zhì)編碼基因的活性是由miRNA 控制的；功能研究［4］表明，miRNA 參與幾乎每一個(gè)已被研究的細(xì)胞過(guò)程的調(diào)節(jié)，它們表達(dá)的變化與許多人類病理具有相關(guān)性。據(jù)估計(jì)，miRNA 調(diào)控約60%的人類基因組，但在通過(guò)骨骼細(xì)胞體外表達(dá)譜鑒定的許多miRNA 中，僅有一小部分miRNA 的功能活性和已知靶點(diǎn)已經(jīng)被證實(shí)［3］，但仍有許多miRNA 的作用靶點(diǎn)和功能活性未被闡明。miRNA可以調(diào)節(jié)生物的生命活動(dòng)，但對(duì)其的研究還不夠深入和廣泛，未能最大發(fā)揮miRNA 對(duì)骨質(zhì)疏松癥的防治潛能；研究miRNA 對(duì)成骨分化及礦化的影響機(jī)制，挖掘其對(duì)骨質(zhì)疏松癥的防治作用，對(duì)防治骨質(zhì)疏松癥具有重大意義。下文將對(duì)miRNA 對(duì)成骨分化及礦化的正向調(diào)節(jié)和負(fù)向調(diào)節(jié)作用兩個(gè)方面以及涉及的相關(guān)通路進(jìn)行綜述。

2 miRNA對(duì)成骨分化及礦化的正向調(diào)節(jié)作用

研究人員發(fā)現(xiàn)部分miRNA 通過(guò)靶向作用，刺激相關(guān)mRNA 和蛋白質(zhì)的表達(dá)，促進(jìn)成骨分化及礦化。如ARUMUGAM 等［5］用紫丁香酸處理小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞后，miR-21 的表達(dá)增加，抑制Smad7的表達(dá)使Runx2 的表達(dá)增加，導(dǎo)致成骨細(xì)胞分化增加；TU 等［6］發(fā)現(xiàn)MC3T3-E1 成骨細(xì)胞中miR-142-5p 表達(dá)的激活可以靶向抑制含WW 結(jié)構(gòu)域的E3泛素蛋白連接酶1（WWP1）表達(dá)，增加Runx2、JunB和骨鈣素（OCN）的mRNA 水平，在骨愈合過(guò)程中增強(qiáng)了成骨細(xì)胞的活性和骨基質(zhì)礦化。YANG等［7］發(fā)現(xiàn)SP7 轉(zhuǎn)錄因子可促進(jìn)miR-98 的表達(dá)，而miR-98 會(huì)抑制Fiat 蛋白的表達(dá)，促進(jìn)小鼠原代成骨細(xì)胞的礦化。YIN 等［8］發(fā)現(xiàn)miR-135-5p 通過(guò)阻礙缺氧誘導(dǎo)因子1α 抑制劑（HIF1AN）的翻譯，促進(jìn)MC3T3-E1 細(xì)胞的成骨分化和礦化；表現(xiàn)為ALP 活性、鈣化和Runx2、成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子抗體（OSX）、骨橋蛋白（OPN）和OCN 水平的增加。KARVANDE等［9］發(fā)現(xiàn)甲狀旁腺激素通過(guò)增加葡萄糖攝取，促進(jìn)miR-451a 的表達(dá)，而miR-451a 則可抑制Osr1（odd-skipped related 1）表達(dá)，增加Runx2 、重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白4（BMP-4）水平，增強(qiáng)BMP-4 誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞分化，促進(jìn)成骨細(xì)胞的生成、礦化。HE 等［10］發(fā)現(xiàn)miR-877-3p 表達(dá)的增加可以抑制MC3T3-E1 細(xì)胞中Smad7 mRNA 和蛋白的表達(dá)，促進(jìn)TGF-β1 所誘導(dǎo)的MC3T3-E1 細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的過(guò)程。還有研究［11］發(fā)現(xiàn)在小鼠顱骨原代成骨細(xì)胞中，增加miR-219a-5p 水平會(huì)降低維甲酸相關(guān)孤核受體β（Rorb）的表達(dá)并增加成骨活性，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。LIN 等［12］發(fā)現(xiàn)，miR-874 通過(guò)靶向抑制絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶抑制劑（SUFU），激活Hedgehog 信號(hào)通路，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，增加ALP活性和鈣結(jié)節(jié)數(shù)量，阻滯成骨細(xì)胞于G0/G1 期并抑制細(xì)胞凋亡。

以上研究表明，miRNA 通過(guò)調(diào)控靶基因表達(dá)，促進(jìn)成骨分化和礦化，證實(shí)了miRNA 在促進(jìn)骨形成方面具有巨大潛力；但由于miRNA 對(duì)成骨分化及礦化的研究尚處于體外細(xì)胞層次，其在體內(nèi)的作用機(jī)制尚未闡明，還需要大量臨床樣本和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持；同時(shí)，大部分研究仍停留在miRNA 對(duì)靶基因的影響機(jī)制上，尚未結(jié)合到通路機(jī)制上進(jìn)行研究，研究者可根據(jù)已有的靶點(diǎn)研究，繼續(xù)挖掘miRNA 影響相關(guān)通路促進(jìn)成骨分化和礦化的影響機(jī)制。針對(duì)目前已發(fā)現(xiàn)的miRNA作用靶點(diǎn)，研制靶向投遞人工合成miRNA 或者其模擬物達(dá)到精準(zhǔn)治療的效果，并安全有效地將這些人工合成miRNA 或其模擬物轉(zhuǎn)入細(xì)胞發(fā)揮作用，應(yīng)該是研究人員的最終努力方向；而目前將miRNA 直接應(yīng)用于臨床防治骨質(zhì)疏松癥尚存在很大的難度。

3 miRNA對(duì)成骨分化及礦化的負(fù)向調(diào)節(jié)作用

miRNA 對(duì)成骨分化也具有負(fù)向調(diào)節(jié)作用，其中涉及了BMP-Smad 通路和Wnt/β-catenin 等信號(hào)通路；也有相關(guān)研究表明miRNA 通過(guò)調(diào)控特定基因的表達(dá)負(fù)向調(diào)節(jié)細(xì)胞的成骨分化和礦化。

3.1 miRNA 通過(guò)靶向BMP-Smad 通路負(fù)調(diào)控成骨分化及礦化BMP-Smad 通路是參與調(diào)節(jié)成骨分化重要的信號(hào)通路，BMPs 可以激活一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子促進(jìn)成骨分化。ARFAT 等［13］發(fā)現(xiàn)miR-208a-3p 表達(dá)的增加可下調(diào)MC3T3-E1 細(xì)胞中激活素A I 型受體（ACVR1）蛋白的表達(dá)，抑制BMP2、Smad1/5 和Smad4 的表達(dá)、成骨特異性基因的轉(zhuǎn)錄和骨形成。GU 等［14］發(fā)現(xiàn)miR-155 通過(guò)與小鼠前成骨細(xì)胞中Smad5 mRNA 的3′UTR 位點(diǎn)結(jié)合，阻礙Smad5 的翻譯，抑制成骨細(xì)胞的分化，降低ALP表達(dá)、活性以及鈣化，抑制骨形成。LU 等［15］發(fā)現(xiàn)，miR-451a 可以負(fù)調(diào)控Bmp6 的表達(dá)，在成骨細(xì)胞發(fā)生過(guò)程中調(diào)節(jié)Smad1/5/8 信號(hào)通路的激活，抑制骨形成。也有研究［16］發(fā)現(xiàn)，miR-224 通過(guò)靶向Smad4的3′端非編碼區(qū)，抑制Smad4 的表達(dá)，降低了ALP活性和OCN、OPN、BSP 和Runx2 的表達(dá)水平，抑制成骨細(xì)胞分化。

3.2 miRNA 通過(guò)靶向Wnt/β-catenin 信號(hào)通路負(fù)調(diào)控成骨分化及礦化Wnt/β-catenin 信號(hào)通路也是調(diào)節(jié)成骨分化的重要通路，它能夠激發(fā)前成骨細(xì)胞的增殖能力，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的增殖及分化，增加骨量。LIN 等［17］發(fā)現(xiàn)miR-26b-3p 通過(guò)抑制ER-α和Wnt/β-catenin 的相關(guān)RNA 和蛋白的表達(dá)，抑制ME3T3-E1 的成骨細(xì)胞分化。LI 等［18］發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-503 后Wnt3a、β-catenin、Runx2 和Bcl-2 的表達(dá)受到明顯抑制，而caspase-3 的表達(dá)則明顯上調(diào)，表明miR-503 部分通過(guò)Wnt 途徑，降低MC3T3-E1 細(xì)胞中Wnt3a 的mRNA 和蛋白水平，抑制MC3T3-E1 細(xì)胞的增殖，促進(jìn)MC3T3-E1 細(xì)胞的凋亡。

3.3 miRNA 通過(guò)抑制靶基因表達(dá)負(fù)調(diào)控成骨分化及礦化miRNA 還能通過(guò)抑制靶基因表達(dá)負(fù)調(diào)控成骨分化及礦化，但相關(guān)基因所涉及的信號(hào)通路，仍需進(jìn)一步研究。ZHANG 等［19］發(fā)現(xiàn)miR-133a-5p 可以識(shí)別和靶向Runx2 的3′UTR，抑制Runx2 的表達(dá)水平，下調(diào)成骨分化標(biāo)志物I 型膠原、OCN 和OPN 的表達(dá)，負(fù)調(diào)控成骨細(xì)胞分化和骨形成過(guò)程。YI 等［20］發(fā)現(xiàn)在人脂肪源性干細(xì)胞（ADSCs）向成骨細(xì)胞分化過(guò)程中，miR-30 的過(guò)表達(dá)可以抑制OCN、OPN 和OSX 的表達(dá)，抑制Runx2 介導(dǎo)的成骨細(xì)胞分化。ARUMUGAM 等［21］發(fā)現(xiàn)甲狀旁腺激素使miR-6797-5p 表達(dá)增加，而miR-6797-5p 模擬物的過(guò)度表達(dá)則顯著下調(diào)Runx2 蛋白的表達(dá)，抑制成骨細(xì)胞分化。QIN 等［22］發(fā)現(xiàn)miR-494 通過(guò)抑制BMP2 和Runx2 的表達(dá)，抑制C2C12 細(xì)胞成骨分化。FENG 等［23］發(fā)現(xiàn)抑制miR-152 可以上調(diào)RICTOR 基因的水平，促進(jìn)ALP、Runx2、OCN 和OSX 的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。有研究［24］發(fā)現(xiàn)，miR-193a 通過(guò)下調(diào)高遷移率族蛋白B1（HMGB1）表達(dá)，部分抑制成骨培養(yǎng)基誘導(dǎo)的hBMSC 成骨細(xì)胞分化。此外，MENG 等［25］發(fā)現(xiàn)miR-590-3p 抑制靶基因人隔蛋白7（SEPT7）的表達(dá)，促進(jìn)人胎兒成骨細(xì)胞系hFOB 1.19 細(xì)胞凋亡。YUAN 等［26］發(fā)現(xiàn)miR-148A-3p 通過(guò)靶向和負(fù)調(diào)節(jié)組蛋白去甲基化酶（KDM6B）表達(dá)，發(fā)揮抗成骨作用。WANG 等［27］發(fā)現(xiàn)miR-193a-3p負(fù)調(diào)控富含亮氨酸重復(fù)序列的G 蛋白偶聯(lián)受體4（LGR4）和激活轉(zhuǎn)錄因子4（ATF4）的表達(dá)，抑制LGR4/ATF4 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制BMSCs 的成骨分化，并提示miR-193a-3p/LGR4/ATF4調(diào)節(jié)軸可能在調(diào)節(jié)骨重塑中發(fā)揮重要作用。CHAO等［28］發(fā)現(xiàn)miR-195 通過(guò)直接靶向RAF-1 蛋白激酶mRNA 的3′-UTR，降低RAF-1 的mRNA 和蛋白表達(dá)，抑制RAF-1 誘導(dǎo)的MC3T3-E1 細(xì)胞的過(guò)度成骨分化。HOU 等［29］發(fā)現(xiàn)miR-351 可以通過(guò)靶向抑制維生素D 受體VDR 的表達(dá)，抑制（+）-膽甾-3-酮誘導(dǎo)的MSCs 成骨分化。GAO 等［30］發(fā)現(xiàn)miR-143 可以抑制OSX 的表達(dá)，導(dǎo)致骨量下降和骨缺損的發(fā)生，最終抑制hBMSCs 的成骨分化。

3.4 miRNAs 通過(guò)其他方式負(fù)調(diào)控成骨分化及礦化除了通過(guò)影響通路和抑制靶基因表達(dá)，miRNA 還可以通過(guò)其他方式負(fù)調(diào)控成骨分化及礦化，其背后涉及的通路和靶基因仍需進(jìn)一步研究。有研究［31］發(fā)現(xiàn)miR-320a 的過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致人類原代成骨細(xì)胞中應(yīng)力氧化水平增加和礦化能力降低，而這種對(duì)成骨細(xì)胞的抑制可能與活性氧水平增加有關(guān)。SUN 等［32］發(fā)現(xiàn)miR-181c-5p 通過(guò)抑制細(xì)胞周期蛋白B1（cyclin B1）的翻譯，降低cyclin B1 表達(dá)，使模擬微重力條件下小鼠原代成骨細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯；證明了在模擬微重力下miRNA可部分通過(guò)miR-181c-5p/cyclin B1 途徑抑制小鼠原代成骨細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯在G2 期。LIN 等［33］從采集自女性骨質(zhì)疏松癥患者的血清中，發(fā)現(xiàn)miR-338-3p 和miR-3065-5p 顯著富集，而進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)miR-338 簇的兩個(gè)成員在體外則可以下調(diào)成骨細(xì)胞的分化，并且抑制miR-338 簇水平可以延緩OVX 小鼠骨質(zhì)疏松的進(jìn)展。ZENG 等［34］發(fā)現(xiàn)機(jī)械應(yīng)變上調(diào)了骨細(xì)胞的miR-29b-3p 水平，從而減少了MLO-Y4 骨細(xì)胞的IGF-1 分泌，降低成骨細(xì)胞條件培養(yǎng)液中IGF-1 的水平而抑制成骨細(xì)胞的分化。

以上研究表明，miRNA 通過(guò)與靶基因結(jié)合，負(fù)調(diào)控成骨細(xì)胞的功能和活性。后續(xù)應(yīng)在此類研究基礎(chǔ)上，研究出針對(duì)該種效應(yīng)的miRNA 抑制劑，抑制其對(duì)成骨細(xì)胞活性和功能的負(fù)向調(diào)節(jié)作用。如在癌癥領(lǐng)域，幾種miRNA 靶向療法已經(jīng)進(jìn)入臨床開(kāi)發(fā)，包括一種腫瘤抑制因子miR-34 的模擬物，其研究已經(jīng)到達(dá)了治療癌癥的第一階段臨床試驗(yàn)；而針對(duì)miR-122 的抗miRs，已經(jīng)進(jìn)行到了治療肝炎的第二階段試驗(yàn)［35］。還有部分miRNA 被證實(shí)可以通過(guò)下調(diào)Runx2 表達(dá)或者其他方式達(dá)到負(fù)調(diào)控成骨分化及礦化的效果，可對(duì)其背后所涉及的靶基因和通路進(jìn)行關(guān)注。上述研究結(jié)果提示，除了研究對(duì)應(yīng)的miRNA 抑制劑拮抗其抑制成骨分化的作用外，這些負(fù)向調(diào)控miRNA 也具有對(duì)骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的預(yù)測(cè)作用?，F(xiàn)有的對(duì)于骨質(zhì)疏松癥的常用診斷方法如雙能X 線測(cè)定法不能作為疾病發(fā)生的預(yù)測(cè)手段；而且由于骨密度測(cè)定費(fèi)用較高、技術(shù)及儀器要求較高等原因難以在基層醫(yī)院普及。若能在骨量減少或者骨質(zhì)疏松癥發(fā)生之前找到預(yù)測(cè)指標(biāo)，并且該類指標(biāo)具有檢驗(yàn)方法簡(jiǎn)單、快捷、成本低、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，將會(huì)極大提升骨質(zhì)疏松癥的防治水平。已經(jīng)有許多研究［36-38］發(fā)現(xiàn)miRNA 可以作為預(yù)測(cè)癌癥發(fā)生的指標(biāo)，如大腸癌、前列腺癌和甲狀腺癌等，因此可以預(yù)見(jiàn)miRNA也具有預(yù)測(cè)骨質(zhì)疏松癥的潛能。由于在各種體液、血清中檢測(cè)miRNA十分便利，可以快速地非侵入性地檢測(cè)疾??；在現(xiàn)有的miRNA 調(diào)節(jié)機(jī)制的研究基礎(chǔ)上，開(kāi)發(fā)骨質(zhì)疏松癥的miRNA 早期診斷試劑盒，將會(huì)更好地造福患者。

4 結(jié)語(yǔ)

綜上，研究miRNA防治骨質(zhì)疏松癥的下一步工作應(yīng)該集中于尋找更多與成骨分化相關(guān)的miRNA，并且探尋其作用通路，根據(jù)研究結(jié)果研發(fā)相應(yīng)的促進(jìn)劑和抑制劑，促進(jìn)成骨細(xì)胞活性和功能，抑制其凋亡。當(dāng)前對(duì)骨代謝的研究仍多數(shù)集中在促進(jìn)成骨細(xì)胞活性和增強(qiáng)其功能上，對(duì)抑制破骨細(xì)胞活性、抑制骨凋亡的研究還不多，因此miRNA 對(duì)破骨細(xì)胞增殖、分化和功能的研究尚少，今后研究也應(yīng)該關(guān)注miRNA 對(duì)破骨細(xì)胞的作用機(jī)制，研制出相關(guān)抑制破骨的藥物，創(chuàng)新骨質(zhì)疏松癥的治療。同時(shí)還應(yīng)該關(guān)注miRNA 應(yīng)用的副作用，miRNA 及其模擬物的生物制備，以及確定miRNA 的作用濃度，如何在體內(nèi)傳遞miRNA 使其發(fā)揮作用。已有腫瘤方面的研究證明了miRNA 作為腫瘤早期診斷、預(yù)后和支持臨床決策的理想生物標(biāo)志物的潛力，而miRNA 在骨質(zhì)疏松癥領(lǐng)域是否也具有如此大的應(yīng)用潛力，也應(yīng)該深入研究。