卵巢癌組織中泛素連接酶SIAH2、HIF-1α蛋白的表達觀察

甄娟，劉玉東，宋春紅，朱玉芬，王莉，畢學杰

(1 石家莊市第四醫(yī)院，石家莊050000；2 河北省人民醫(yī)院)

SIAH2是一種高度保守的泛素連接酶，基因定位于染色體3q25，編碼324個氨基酸。SIAH2蛋白具有泛素連接酶的活性，可調(diào)節(jié)一些蛋白的泛素化和降解，并通過其作用的底物在細胞周期、低氧應激及信號轉(zhuǎn)導通路調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。近年來研究[1]發(fā)現(xiàn)，SIAH2可作為一種重要的腫瘤因子，在某些腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，SIAH2在有增殖能力的細胞中表達(正常細胞和腫瘤細胞)，如人胚腎細胞、宮頸癌細胞、乳腺癌細胞及結(jié)直腸腺瘤細胞等，而在不增殖的細胞中表達缺失。SIAH2在肺癌[2]、急性T淋巴細胞白血病[3]、卵巢癌[4]、乳腺癌[5]組織中均呈高表達，并且隨著肺癌及乳腺癌分化程度的降低其表達顯著增加。Malz等[6]研究發(fā)現(xiàn)，SIAH2與肝癌的復發(fā)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，因此SIAH2是作為一種癌基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮其作用的。SIAH2在卵巢癌中的表達及臨床意義罕有報道。低氧誘導因子1α(HIF-1α)在細胞低氧反應中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其表達與腫瘤的生成和轉(zhuǎn)移有關(guān)。研究[7,8]發(fā)現(xiàn)，SIAH2能夠調(diào)節(jié)HIF-1α的表達，從而使其在細胞低氧反應及腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用，SIAH2可通過SIAH2/HIF-1α途徑調(diào)控腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。本研究對卵巢癌組織中的SIAH2蛋白和HIF-1α蛋白進行了定性及定量檢測，觀察其表達變化，探討SIAH2在卵巢癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移中的作用及其與HIF-1α的關(guān)系，為卵巢癌的診斷和治療尋找新的生物學標志物及藥物治療靶點。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2012～2017年在石家莊市第四醫(yī)院接受手術(shù)治療的卵巢癌患者57例、卵巢囊腫患者55例、卵巢交界性腫瘤患者40例，術(shù)前未接受放化療及激素治療，術(shù)中均留取腫瘤組織[其中35例卵巢癌患者手術(shù)時一并留取癌旁組織(距離癌組織>2 cm)]。腫瘤組織和癌旁組織離體后立即放入液氮-70 ℃保存，受檢時切片，先行HE常規(guī)染色后進一步明確診斷，由兩名病理醫(yī)師根據(jù)卵巢腫瘤WHO分類標準和FIGO分期標準確定腫瘤的組織病理類型及病理分期。

1.2 主要試劑 鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶S-P試劑盒和DAB顯色試劑均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司，SIAH2鼠單克隆抗體(sc-81787)和HIF-1α鼠單克隆抗體(sc-13515)均購自美國Santa Cruz公司。

1.3 卵巢癌、卵巢囊腫、卵巢交界性腫瘤患者腫瘤組織中SIAH2、HIF-1α蛋白的定性檢測 采用免疫組化SP法。以PBS代替一抗作為陰性對照，用已知陽性片作陽性對照。SIAH2蛋白與HIF-1α蛋白均以細胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性顯色。每張受檢組織切片在光鏡下隨機選取5個高倍視野(×400)，每個視野計數(shù)200個瘤細胞，總計1 000個瘤細胞：SIAH2蛋白與HIF-1α蛋白陽性細胞百分比為0計0分、≤50%計1分、>50%～≤75%計2分、>75%計3分；細胞無著色計0分、淺黃色計1分、棕黃色計2分、黃褐色計3分。上述兩分值的乘積<4為陰性、≥4為陽性。

1.4 卵巢癌患者腫瘤組織及癌旁組織中SIAH2、HIF-1α蛋白的定量檢測 采用Western blotting法。受檢組織切片進行蛋白質(zhì)免疫印跡，12%SDS-PAGE電泳，一抗(SIAH2 1∶150，HIF-1α 1∶150)和β-actin(1∶200)4 ℃孵育過夜，與相應二抗室溫下孵育2 h，ECL發(fā)光，拍照并進行計算機圖像分析，用Image J軟件半定量分析特異性條帶的光密度值，將β-actin光密度值作為內(nèi)參照，對目的蛋白(SIAH2蛋白與HIF-1α蛋白)的相對表達量進行分析。實驗至少重復3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 卵巢癌、卵巢囊腫、卵巢交界性腫瘤患者腫瘤組織中SIAH2蛋白和HIF-1α蛋白的定性檢測結(jié)果比較 卵巢囊腫、卵巢交界性腫瘤、卵巢癌患者腫瘤組織中SIAH2蛋白和HIF-1α蛋白的陽性表達率分別為7.27%和10.9%、47.5%和42.5%、78.9%和80.7%，兩兩相比，P均<0.05。卵巢癌患者腫瘤組織中SIAH2蛋白與HIF-1α蛋白的陽性表達呈正相關(guān)(r=0.402，P<0.05)。卵巢癌患者腫瘤組織中SIAH2蛋白與HIF-1α蛋白的表達與腫瘤分化程度、FIGO分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)，與患者年齡及腫瘤組織學類型無關(guān)(P均>0.05)，詳見表1。

表1 卵巢癌患者腫瘤組織中SIAH2蛋白和HIF-1α蛋白的陽性表達與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例)

2.2 卵巢癌患者腫瘤組織、癌旁組織中SIAH2蛋白和HIF-1α蛋白的定量檢測結(jié)果比較 卵巢癌患者腫瘤組織、癌旁組織中SIAH2蛋白的相對表達量分別為2.518±0.18、2.016±0.142，兩者相比，P<0.05；卵巢癌患者腫瘤組織、癌旁組織中HIF-1α蛋白的相對表達量分別為1.41±0.14、0.75±0.13，兩者相比，P<0.05。卵巢癌患者腫瘤組織中SIAH2蛋白與HIF-1α蛋白的表達呈正相關(guān)(r=0.408，P<0.05)。

3 討論

SIAH2蛋白的作用底物包括PHD1/3、Spry2[1]、CHK2[9]、PI3K[10]等，一些底物通過自身AXVXP基因序列或銜接蛋白與SIAH2結(jié)合，一些底物直接與SIAH2結(jié)合，從而影響多種細胞功能，如信號轉(zhuǎn)導、細胞分化、線粒體生物合成、低氧和應激反應等。Sun等[11]研究發(fā)現(xiàn)，過表達SIAH2蛋白能夠促進乳腺癌細胞的增殖和侵襲能力，抑制SIAH2蛋白的表達可以減慢乳腺癌的生長和減少腫瘤的擴散轉(zhuǎn)移，推測SIAH2基因是一種癌基因。本研究發(fā)現(xiàn)，SIAH2蛋白在卵巢良性病變、交界性腫瘤、卵巢癌患者腫瘤組織中的陽性表達率依次升高，SIAH2蛋白在卵巢癌患者腫瘤組織中的相對表達量高于癌旁組織，推測SIAH2蛋白作為腫瘤促進因子在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，卵巢癌患者腫瘤組織中SIAH2蛋白的陽性表達隨著FIGO分期的增加而增加，且在低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的卵巢癌患者腫瘤組織中SIAH2蛋白的陽性表達率較高，這與文獻[4]報道一致。推測SIAH2蛋白可以作為卵巢癌診斷的生物學標志物，也可以作為卵巢的藥物治療靶點，并且可以預測卵巢癌患者的預后。

HIF-1蛋白是非常重要的一種核轉(zhuǎn)錄因子，主要由α和β兩個亞基構(gòu)成，α亞基是其主要的功能單位。正常情況下，細胞內(nèi)的泛素-蛋白酶系統(tǒng)能夠?qū)IF-1α蛋白降解，所以HIF-1α蛋白很難被檢測到[12]。當細胞處于缺氧狀態(tài)時，細胞內(nèi)的HIF-1α蛋白穩(wěn)定性提高，濃度逐漸增加，將會啟動其下游多種靶基因的轉(zhuǎn)錄，而HIF-1α下游靶基因的蛋白產(chǎn)物與腫瘤血管生成、浸潤轉(zhuǎn)移、增殖和凋亡密切相關(guān)[13]。腫瘤在低氧時就會誘導HIF-1α表達上調(diào)，而HIF-1α表達上調(diào)就會使血管內(nèi)皮生長因子表達上調(diào)，進而使腫瘤形成更多的新生血管，促進腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移[13～16]。由此可見，HIF-1α蛋白的高表達為腫瘤細胞生長提供了血供，為腫瘤細胞轉(zhuǎn)移開辟了道路，預示著腫瘤有較高的侵襲性。本研究結(jié)果顯示,HIF-1α蛋白在卵巢癌患者腫瘤組織中高表達，而且FIGO分期較晚、分化程度低、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的卵巢癌患者腫瘤組織中HIF-1α蛋白表達水平較高。推測HIF-1α參與卵巢癌發(fā)生發(fā)展，并與腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移有關(guān)。

研究[4]發(fā)現(xiàn)，在急性T淋巴細胞白血病中抑制SIAH2的活性后，通過PHD3調(diào)節(jié)HIF-1α的表達，可抑制白血病細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，促進其凋亡。本研究結(jié)果顯示，SIAH2蛋白和HIF-1α蛋白在卵巢癌癌變過程中的陽性表達率同時依次升高，并且在卵巢癌患者腫瘤組織中二者的相對表達量均顯著高于癌旁組織，卵巢癌組織中SIAH2蛋白與HIF-1α蛋白表達呈正相關(guān)，二者均與腫瘤分化程度、FIGO分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。以上這些結(jié)果提示SIAH2蛋白和HIF-1α蛋白具有協(xié)同作用，與卵巢癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移相關(guān)。推測HIF-1α蛋白可能是SIAH2的蛋白一種底物。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌患者腫瘤組織中SIAH2蛋白和HIF-1α蛋白高表達；SIAH2蛋白和HIF-1α蛋白可能與卵巢癌的發(fā)生及轉(zhuǎn)移有關(guān)，且二者可能具有協(xié)同作用。SIAH2作為一種重要的腫瘤因子，研究其上下游調(diào)控關(guān)系，可為進一步探討其作為卵巢癌藥物治療靶點及預后判斷指標提供理論依據(jù)。