戒毒一號(hào)的高效液相色譜指紋圖譜研究

李 燦，唐利軍，茹 琴，周 梅，李超英*

（1.江漢大學(xué) 武漢生物醫(yī)學(xué)研究院，湖北 武漢 430056；2.湖北省疾病預(yù)防控制中心，湖北 武漢 430073）

戒毒一號(hào)是江漢大學(xué)武漢生物醫(yī)學(xué)研究院臨床效驗(yàn)方，由延胡索、黨參、西洋參、甘草、茯苓、白術(shù)、黃芪、當(dāng)歸8味中藥組成，各單味藥對(duì)應(yīng)的劑量分別為10 g、15 g、3 g、10 g……。其中延胡索是君藥，具有活血、行氣、息風(fēng)止痛的功效；白術(shù)、茯苓、西洋參、甘草、黨參五藥配伍，輔助君藥，具有活血行氣，溫經(jīng)止痛的功效，共為臣藥；當(dāng)歸、黃芪二藥配伍，具有氣血雙補(bǔ)的功效，共為佐使藥。諸藥配伍，主要用于對(duì)甲基苯丙胺類(lèi)新型毒品成癮患者的脫毒治療，具有良好的鎮(zhèn)靜、安神作用。高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）指紋圖譜廣泛運(yùn)用于中藥材和中成藥質(zhì)量控制的研究［1-3］。為了更好地保證戒毒一號(hào)臨床療效穩(wěn)定、安全可控，本研究通過(guò)分析戒毒一號(hào)中各代表成分的含量及對(duì)應(yīng)的藥理作用，選定戒毒一號(hào)中的有效成分延胡索甲素、延胡索乙素、小檗堿、甘草酸、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1作為考察指標(biāo)，應(yīng)用高效液相色譜法對(duì)10批次戒毒一號(hào)樣品進(jìn)行分析比較，尋找上述指標(biāo)之間的關(guān)系，建立中藥復(fù)方戒毒一號(hào)的指紋圖譜，為戒毒一號(hào)的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Thermo Ulti Mate 3000高效液相色譜儀（Ulti-mate-3000 RS四元泵、TCC-3000 SD柱溫箱、DAD-3000檢測(cè)器，20 μL定量環(huán)的手動(dòng)進(jìn)樣、Chorme Leon 7.0色譜工作站），TGL-16G高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），真空干燥機(jī)（上海豫明儀器有限公司），KQ200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），SZ-97自動(dòng)三重純水蒸餾儀（上海亞榮生化儀器廠），JYH-B40Q1中藥煎煮機(jī)（廣東小熊電器有限公司），BSA223S千分之一分析天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司），SK-20 pH計(jì)（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 試劑

甲醇（批號(hào) M158-4）、乙腈（批號(hào) M157-4）、三乙胺（批號(hào) M182）、乙酸（批號(hào) M041978）三乙胺（批號(hào)M38810）均為色譜純，均購(gòu)于北京邁瑞達(dá)科技有限公司，水為超純水（由SZ-97自動(dòng)三重純水蒸餾儀制得），其他試劑均為分析純。戒毒一號(hào)10批樣品（武漢生物醫(yī)學(xué)研究院提供，批號(hào)分別為1704102、1704103、1704104、1704222、1704223、1704224、1705066、1705067、1705068、1705069（批號(hào)命名方式為：XX-XX-XX-X，年-月-日-批次）。

1.3 對(duì)照品

延胡索甲素（Corydaline，批號(hào) 518-69-4）、延胡索乙素（dl-Trtrahydropalmatine，THP，批號(hào)#6024-856）、小檗堿（Brerberine，批號(hào) 2086-83-1）、甘草酸（Glycyrrhizic acid，批號(hào) 1405-86-3）、人參皂苷Re（Ginsenoside Re，批號(hào) #52286-59-6）、人參皂苷Rb1（Ginsenoside Rb1，批號(hào) #41753-43-9）標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司，純度均≥98%。

2 方法

2.1 延胡索乙素、延胡索甲素、小檗堿、甘草酸色譜條件的選擇

色譜柱：Ultimate TM XB-C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水-磷酸緩沖鹽（0.005 mol∕L的磷酸氫二鈉溶液，以0.005 mol∕L的磷酸氫二鈉調(diào)節(jié)pH至8.0，再以0.1%醋酸水溶液（三乙胺溶液調(diào)節(jié)pH為6.4），采用梯度洗脫（0～20 min 5%～20%乙腈和95%～80%0.2%磷酸，20～40 min 20%～30%乙腈和80%～70%0.2%磷酸，40～55 min 30%～60%乙腈和70%～40%0.2%磷酸，55～60 min 60%～80%乙腈和40%～20%0.2%磷酸，60～65 min 5%乙腈和95%0.2%磷酸）柱溫：30℃；體積流量：1 mL∕min；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；進(jìn)樣量：20 μL，記錄65 min內(nèi)的圖譜。

2.2 人參皂苷Re、人參皂苷Rg1色譜條件的選擇

色譜柱：Ultimate TM XB-C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：以乙腈-純水，二元梯度洗脫（0～20 min 18%～22%乙腈和82%～78%純水，20～30 min 22%～32%乙腈和78%～68%純水，30～45 min 32%～34%乙腈和68%～66%純水，45～50 min 80%乙腈和20%純水，50～55 min 18%乙腈和82%純水）色譜柱柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：體積流量：1 mL∕min；檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm；進(jìn)樣量：20 μL，記錄55 min內(nèi)的圖譜。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱(chēng)取戒毒一號(hào)中延胡索、黨參、西洋參等8味中藥，總重量為94 g，置于1 400 mL純水浸泡30 min后，用中藥煎煮機(jī)大火加熱1 h，再文火煮沸3 h后分離煎出液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將煎出液濃縮至400 mL即得所需濃度藥液。取10 mL藥液并進(jìn)行真空冷凍干燥處理。將干燥后的樣品，加10 mL 80%甲醇溶解，并在50 kHz，120 W條件下超聲40 min后離心，取上層清液過(guò)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)。重復(fù)上述操作10次，即得10個(gè)不同批次的供試品。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

電子分析天平分別精密稱(chēng)取延胡索甲素、延胡索乙素、小檗堿、甘草酸、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1標(biāo)準(zhǔn)品0.5、10、10、50、10、10 mg置于10 mL容量瓶中，甲醇溶液定容至刻度，搖勻后放置，即得濃度為0.05 mg∕mL延胡索甲素、1 mg∕mL延胡索乙素、1 mg∕mL小檗堿、5 mg∕mL甘草酸、1 mg∕mL人參皂苷Re、1 mg∕mL人參皂苷Rb1標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。

3 結(jié)果與分析

3.1 方法學(xué)驗(yàn)證

3.1.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取2.3項(xiàng)下各標(biāo)準(zhǔn)品溶液各1 mL，置于同一10 mL容量瓶中，加入甲醇溶液定容至刻度，配制成含有不同濃度延胡索甲素、延胡索乙素、小檗堿、甘草酸、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，吸取20 μL分別進(jìn)樣3次，按照2.1項(xiàng)下的色譜條件，以封面積值（Y）為縱坐標(biāo)，濃度（X）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得各指標(biāo)線性回歸方程分別為：延胡索甲素Y=0.352 6X+0.849（R2=0.998 5），延胡索乙素Y=0.157X+0.935 3（R2=0.998），小檗堿Y=0.488 2X+3.488 9（R2=0.999 7），甘草酸Y=0.010 2X+0.175 2（R2=0.998 1），人參皂苷ReY=0.179 5X+0.096 7（R2=0.998 2），人參皂苷Rb1Y=0.083 1X+0.451 6（R2=0.998 2）。結(jié)果表明，延胡索甲素、延胡索乙素、小檗堿、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1均在1～167 μg∕mL濃度線性范圍內(nèi)峰面積積分值呈較好線性關(guān)系。

3.1.2 精密度試驗(yàn) 取2.3項(xiàng)下的供試品溶液，按2.1、2.2項(xiàng)下色譜條件連續(xù)測(cè)定6次，結(jié)果顯示共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于0.51%，共有峰的相對(duì)峰面積RSD均小于1.06%，說(shuō)明儀器的精密度良好。

3.1.3 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 用手動(dòng)進(jìn)樣環(huán)精密吸取10 μL甲醇溶劑，注入高效液相色譜儀，記錄180 min內(nèi)的色譜峰。結(jié)果顯示，甲醇對(duì)戒毒一號(hào)的指紋圖譜中共有峰檢出無(wú)影響，專(zhuān)屬性較好。

3.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取2.3項(xiàng)下同一批次的供試品溶液注入高效液相色譜儀，并在第一次進(jìn)樣后的3、6、9、12、24 h各進(jìn)樣1次，按2.1、2.2項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，12次檢測(cè)的圖譜結(jié)果顯示共有峰的相對(duì)峰面積RSD均小于1.03%，共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于0.45%。

3.1.5 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取2.3項(xiàng)下同一批次供試品溶液平均分成6等份，按2.1、2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果顯示共有峰的相對(duì)峰面積RSD均小于1.01%，且共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于0.54%，說(shuō)明本方法的重現(xiàn)性好。

3.2 戒毒一號(hào)HPLC指紋圖譜的確立

按照2.1、2.2項(xiàng)下色譜條件對(duì)10批戒毒一號(hào)供試品進(jìn)行測(cè)定，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件處理各供試品所得的指紋圖譜，生成戒毒一號(hào)HPLC指紋圖譜共有模式。并標(biāo)定了19個(gè)穩(wěn)定性和重復(fù)性好、吸收強(qiáng)、特征明顯的色譜峰為共有峰，10批戒毒一號(hào)供試品和對(duì)照品的色譜疊加圖普見(jiàn)圖1。從指紋圖譜結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，S7號(hào)峰高度適度、峰型對(duì)稱(chēng)、分離度較好，因此選擇S7號(hào)峰作為參照峰。10批樣品平均相似度為0.979，各共有特征峰相對(duì)面積占總峰面積的74.43%，說(shuō)明10批戒毒一號(hào)的HPLC指紋圖譜相似度良好。

圖1 10批不同戒毒一號(hào)樣品的指紋圖譜Fig.1 High performance liquid chromatographic fingerprints of 10 batches of JDYH samples

3.3 戒毒一號(hào)指紋圖譜中特征峰的歸屬分析

取戒毒一號(hào)中單味藥材，按戒毒復(fù)方的煎煮及供試品制備方法制備藥材溶液；同時(shí)取延胡索甲素、延胡索乙素、小檗堿、甘草酸、人參皂苷Re、Rb1對(duì)照品用甲醇稀釋成適當(dāng)質(zhì)量濃度；按照2.1、2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖2。通過(guò)比較各色譜峰保留時(shí)間并對(duì)比圖1確定各峰的來(lái)源。其中19個(gè)共有峰在對(duì)應(yīng)的藥材具有明顯的歸屬感，其中9～17號(hào)峰與延胡索藥材有明顯的歸屬性，1～5號(hào)峰為黨參藥材的歸屬峰，4～8、18號(hào)峰是甘草藥材的歸屬峰。其中11、13、15號(hào)峰是延胡索藥材中的有效成分延胡索甲素、延胡索乙素、小檗堿，18號(hào)峰是甘草中的有效成分甘草酸。

圖2 戒毒一號(hào)指紋圖譜特征峰歸屬Fig.2 Characteristic peaks of fingerprints of JDYH

3.4 戒毒一號(hào)中各檢測(cè)指標(biāo)的含量測(cè)定

經(jīng)測(cè)定中藥戒毒復(fù)方，每毫升中藥復(fù)方水煎劑中，延胡索甲素含量為28.33 μg，延胡索乙素的含量為27.66 μg，小檗堿含量為 3.18 μg，甘草酸含量為381.98 μg，人參皂苷Re為 279.06 μg，人參皂苷Rb1為196.47 μg。圖3為中藥戒毒復(fù)方樣品中，延胡索甲素、延胡索乙素、小檗堿、甘草酸的含量測(cè)定圖譜。圖4為中藥戒毒復(fù)方樣品中，人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的含量測(cè)定圖譜。

圖3 戒毒一號(hào)中延胡索甲素、延胡索乙素、小檗堿、甘草酸指紋圖譜Fig.3 High performance liquid chromatographic fingerprints of corydaline，tetrahydropalmatine，berberine and glycyrrhizic acid

圖4 戒毒一號(hào)中人參皂苷Re、人參皂苷Rb1指紋圖譜Fig.4 High performance liquid chromatographic fingerprints of ginsenoside Re and ginsenoside Rb1

4 結(jié)論與討論

指紋圖譜的大信息量克服了中藥復(fù)方成分復(fù)雜難以確定的難題，是國(guó)際公認(rèn)控制中藥材質(zhì)量的常用手段［4］。戒毒一號(hào)是多組分制劑，療效也是多靶點(diǎn)作用的綜合結(jié)果，所以測(cè)定的指標(biāo)性成分越多，對(duì)于控制中藥制劑的內(nèi)在質(zhì)量越有利。已知戒毒一號(hào)中含有延胡索甲素、延胡索乙素、小檗堿、甘草酸、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1等有效成分，采用HPLC法測(cè)定并查閱相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，將上述成分作為指標(biāo)性成分，既可以增加質(zhì)量控制的覆蓋面，又可克服藥材中所含若干種成分多少無(wú)固定比例規(guī)律的缺陷［5-11］。從10批戒毒一號(hào)樣品的高效液相指紋圖譜可以看出，不同批次的戒毒一號(hào)各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間基本一致，所含成分基本相同，具有良好的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、專(zhuān)屬性。符合指紋圖譜的要求，為戒毒一號(hào)的質(zhì)量控制提供良好的依據(jù)。

延胡索作為戒毒一號(hào)中君藥，鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜效果顯著，本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，單味藥延胡索的有效成分延胡索乙素不僅能降低海洛因的強(qiáng)化行為，還能有效抑制甲基苯丙胺和嗎啡依賴(lài)大鼠條件線索誘導(dǎo)的復(fù)吸行為［12-14］。檢測(cè)結(jié)果顯示其有效成分延胡索甲素含量為28.33 μg∕mL、延胡索乙素含量為27.66 μg∕mL，小檗堿含量為3.18 μg∕mL，測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果專(zhuān)屬性良好、無(wú)陰性干擾，可以作為中藥戒毒復(fù)方質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分。甘草、黨參作為戒毒一號(hào)中占比較大的佐藥，檢測(cè)結(jié)果顯示甘草的主要成分甘草酸含量為381.98 μg∕mL，黨參的主要成分人參皂苷Re含量為279.06 μg∕mL，人參皂苷Rb1含量為196.47 μg∕mL，測(cè)定結(jié)果專(zhuān)屬性良好、無(wú)陰性干擾、含量較高，可以作為戒毒一號(hào)質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分。因此用延胡索甲素、延胡索乙素、小檗堿、甘草酸、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1含量來(lái)控制戒毒一號(hào)的質(zhì)量科學(xué)、可行、有效。