外源表油菜素內(nèi)酯對牡丹耐熱性的影響

任增斌，陳法志，舒常慶，李秀麗，劉克華，戢小梅

（1.武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院林業(yè)果樹研究所，湖北 武漢 430075；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝林學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430070；3.潛江市園林局，湖北 潛江 433100）

牡丹為芍藥科（Paeoniaceae）芍藥屬（Paeonia）落葉灌木，原產(chǎn)中國，是我國十大名花之首，素有“花中之王，國色天香”美譽，歷來為世人所喜愛［1］?！P丹’（Paeonia ostii‘feng dan’）屬于牡丹早花品種，是江南牡丹品種群起源較純的原種［2］，其生長強健、著花繁多、結(jié)籽量大，根、花、葉、種子均可被利用，兼具觀賞、食用、油用、藥用等多種價值。2011年國家衛(wèi)生部批準(zhǔn)鳳丹牡丹種子加工的牡丹籽油為新資源食品，近幾年‘鳳丹’生產(chǎn)栽培迅猛發(fā)展，截止2016年全國栽培面積已達(dá)到6萬hm2。目前影響牡丹正常生長發(fā)育的主要因素是溫度［2］。高溫對牡丹有抑制作用，在夏季高溫干旱季節(jié)（28℃以上）會停止生長，進入短暫休眠。尤其是南方地區(qū)夏季高溫多濕氣候，嚴(yán)重影響牡丹生長，造成提早落葉［3］。因此，探究牡丹的耐熱機制及提高牡丹耐熱性的技術(shù)措施是南方地區(qū)牡丹研究和生產(chǎn)亟需解決的重大難題。

油菜素內(nèi)酯（brassinolides，BR）是甾醇類植物激素，是迄今為止國際上公認(rèn)的活性最高、最廣譜的植物生長激素，植物經(jīng)極低濃度處理就能表現(xiàn)出顯著的生理效應(yīng)［4］。表油菜素內(nèi)酯（epibrassino?lide，EBR）作為人工化學(xué)合成的油菜素內(nèi)酯類似物，有著和油菜素內(nèi)酯一樣極高的生理活性，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)［5］。近年來研究表明，外源EBR可提高植物對高溫脅迫的抵抗能力［6］，是熱脅迫緩解劑［5］。EBR已應(yīng)用于茶樹、番茄、大豆等植物的耐熱性研究，具有提高耐熱性的作用［7-9］。有關(guān)其應(yīng)用于牡丹的研究未見報道。本實驗以‘鳳丹’牡丹為材料，葉面噴施不同濃度的EBR，比較分析其在高溫脅迫下對牡丹生理生化指標(biāo)及超微結(jié)構(gòu)的影響，揭示外源EBR提高牡丹耐熱性的生理機制，為南方地區(qū)牡丹抗高溫栽培的研究與應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

以‘鳳丹’牡丹3年生容器苗為供試材料，分別放置于25℃恒溫智能光照培養(yǎng)箱中，預(yù)培養(yǎng)15 d，將預(yù)處理好的‘鳳丹’容器苗分成5組，每組10株，分別噴施0.1、0.5、1.0和1.5 mg∕L的EBR，對照組噴施等量的清水，然后置于40℃/35℃（晝∕夜）的光照溫度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，培養(yǎng)箱內(nèi)空氣濕度60%，每天定時澆水，盆栽基質(zhì)含水量保持在50%左右，光照強度4 000 Lx，光暗周期為14 h∕10 h（晝∕夜）。然后采集不同處理的葉片用于相關(guān)生理生化指標(biāo)的測定。

1.2 指標(biāo)測定

1.2.1 生理指標(biāo)測定 采集經(jīng)外源EBR處理的‘鳳丹’葉片用于多項生理指標(biāo)的測定，測定的具體指標(biāo)如下。

相對電導(dǎo)率：采用DDS-11型電導(dǎo)儀測定相對電導(dǎo)率，參照文獻(xiàn)［10］的方法測定，以相對電導(dǎo)率表示植株的電解質(zhì)滲透率；

可溶性糖含量：采用蒽酮比色法測定［11］；

可溶性蛋白含量：考馬斯亮藍(lán)G-250法［12］；

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性：采用氮藍(lán)四唑法測定［13］；

丙二醛（malone dialdehyde，MDA）含量：采用硫代巴比妥鈉（TBA）法測定［14］；

光合速率采用LI-6400光合測定儀測量凈光合速率。

1.2.2 超微結(jié)構(gòu)觀測 高溫脅迫5 d后，采集葉片進行超微結(jié)構(gòu)觀察，將葉片切成1 mm3左右小塊，立即用3%戊二醛固定2 h以上，用0.1 mol∕L的PBS緩沖液沖洗3次，每次15 min，1%鋨酸（OsO4）后固定4 h，0.1 mol∕L的PBS緩沖液沖洗3次，每次15 min，經(jīng)過50%、70%、85%、95%、100%酒精梯度脫水，每次15 min，轉(zhuǎn)入100%丙酮，15 min后轉(zhuǎn)入含有無水硫酸鈉的丙酮，15 min后過渡到樹脂中浸透包埋，聚合，修塊，然后在超薄切片機上切片，切片厚70 nm，經(jīng)醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛雙重染色后，用透射電鏡觀察拍照。

1.3 數(shù)據(jù)分析與處理

用Excel（2013）軟件和SPSS19.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計、處理及圖表分析，用Duncan’s進行多重比較（P=0.05）

2 結(jié)果與分析

2.1 外源EBR處理對高溫脅迫下‘鳳丹’凈光合速率的影響

光合作用是植物物質(zhì)轉(zhuǎn)換和能量代謝的關(guān)鍵，溫度逆境對其影響很大。圖1中凈光合速率從左到右按順序依次為 4.94、6.78、9.87、11.49、12.29 μmol∕m2·s，4 種濃度EBR處理凈光合速率較對照分別提高37.2%、99.8%、133.3%、148.2%，均明顯高于對照（P＜0.05），表明外源EBR可減緩高溫對‘鳳丹’光合作用的抑制。不同濃度EBR處理的凈光合速率隨濃度的升高而升高，呈正相關(guān)，其中濃度1.5 mg∕L處理的凈光合速率值最高，1.0 mg∕L與1.5 mg∕L的凈光合速率差異不明顯，但顯著高于其他兩個低濃度處理。

圖1 EBR對高溫脅迫下‘鳳丹’凈光合速率的影響Fig.1 Effect of epibrassinolide on net photosynthetic rate of′Fengdan′under high temperature stress

2.2 外源EBR處理對高溫脅迫下‘鳳丹’可溶性糖和可溶性蛋白含量的影響

植物體內(nèi)的可溶性糖含量反映了細(xì)胞受逆境脅迫的程度，在熱脅迫條件下，可溶性糖含量越高，細(xì)胞受到的損害程度越高。圖2中可溶性糖含量從左到右按順序依次為42.74、32.32、24.49、20.12、19.83 μg∕g，4種濃度EBR處理可溶性糖較對照分別降低24.4%、42.7%、52.9%、53.6%，均顯著低于對照（P＜0.05），表明外源EBR處理可降低可溶性糖的含量，降低了高溫對鳳丹的傷害。不同濃度處理的‘鳳丹’可溶性糖含量隨濃度的升高而降低，呈負(fù)相關(guān)，其中濃度1.5 mg∕L處理可溶性糖含量最低，1.0 mg∕L和1.5 mg∕L之間差異不顯著，與其他兩個濃度差異顯著。

圖2 EBR對高溫脅迫下‘鳳丹’可溶性糖含量的影響Fig.2 Effect of epibrassinolide on soluble sugar content of′Fengdan′under high temperature stress

可溶性蛋白主要參與植物體內(nèi)細(xì)胞滲透勢的調(diào)節(jié)，可以有效增加植物對細(xì)胞滲透勢的調(diào)節(jié)作用，提高植物的耐熱性。圖3中可溶性蛋白含量從左到右按順序依次為10.63、12.94、13.73、16.29、14.87 mg∕g，4種EBR處理可溶性蛋白含量較對照分別提高21.7%、29.2%、53.2%、39.9%，均明顯高于對照（P＜0.05），表明外源EBR可有效抑制可溶性蛋白含量降低，從而降低了高溫對‘鳳丹’的傷害。不同濃度的EBR處理對可溶性蛋白含量影響隨濃度增加，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，其中濃度1.0 ml∕L的處理可溶性蛋白含量最高，效果最好。

圖3 EBR對高溫脅迫下‘鳳丹’可溶性蛋白含量的影響Fig.3 Effect of epibrassinolide on soluble protein content of′Fendan′under high temperature stress

2.3 外源EBR處理對高溫脅迫下‘鳳丹’相對電導(dǎo)率和丙二醛含量的影響

相對電導(dǎo)率是反映細(xì)胞膜通透性的重要指標(biāo)之一，高溫影響脂膜的透性，導(dǎo)致電解質(zhì)滲透量增加。圖4中相對電導(dǎo)率按順依次為68.13%、55.71%、46.86%、36.19%、42.89%，4種濃度EBR處理‘鳳丹’的相對電導(dǎo)率均顯著低于對照，分別比對照低18.2%、31.2%、46.9%、37.0%，表明外源EBR處理可減緩‘鳳丹’葉片電解質(zhì)的滲出，抑制了相對電導(dǎo)率的上升，能夠更好地保護細(xì)胞膜的完整性；不同濃度EBR處理的‘鳳丹’相對電導(dǎo)率隨著濃度增大呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，其中1.0 mg∕L處理顯著低于其他3個處理，效果最好。

圖4 EBR對高溫脅迫下‘鳳丹’相對電導(dǎo)率的影響Fig.4 Effect of epibrassinolide on relative electrical conductivity of′Fengdan′under high temperature stress

丙二醛是膜脂過氧化的產(chǎn)物，其含量高低可以表明膜脂受破壞的程度［15］。圖5中丙二醛含量從左到右按順序依次為0.501、0.319、0.268、0.115、0.323 μmol∕g，4 種濃度的EBR 處理丙二醛含量分別比對照降低36.3%、46.5%、77.0%、35.5%，均顯著低于對照（P＜0.05），表明外源EBR可緩解膜脂過氧化的過程，有效降低了丙二醛的積累。不同濃度的EBR處理對‘鳳丹’的丙二醛含量影響程度不一樣，隨著濃度增大，丙二醛的含量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，其中1.0 mg∕L處理丙二醛含量最低，僅為對照的23%，效果最好。

2.4 外源EBR處理對高溫脅迫下‘鳳丹’SOD活性的影響

當(dāng)植物在受到高溫脅迫條件下，能夠產(chǎn)生SOD消除大量積累的超氧陰離子自由基，保護細(xì)胞內(nèi)的組織免受氧化傷害。圖6中SOD活性從左到右按順依次為1 246.21、1 673.92、2 039.91、2 475.63、2 039.43 U∕g。4種濃度外源EBR處理SOD活性較對照分別提高了32.3%、63.7%、98.7%、63.6%，均明顯高于對照（P＜0.05），表明外源EBR可有效抑制‘鳳丹’SOD活性的降低，可以保持較高的SOD活性，降低了高溫對‘鳳丹’的傷害。不同濃度的EBR處理SOD活性隨濃度增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，其中1.0 mg∕L處理‘鳳丹’的SOD活性最強，較對照提高98.7%，效果最好。

圖5 EBR對高溫脅迫下‘鳳丹’丙二醛含量的影響Fig.5 Effect of epibrassinolide on MDA content of′Fengdan′under high temperature stress

圖6 表EBR對高溫脅迫下‘鳳丹’SOD活性的影響Fig.6 Effect of epibrassinolide on SOD activity of′Fengdan′under high temperature stress

2.5 外源EBR處理對高溫脅迫下‘鳳丹’超微結(jié)構(gòu)的影響

如圖7（A～E）所示，高溫脅迫下‘鳳丹’細(xì)胞結(jié)構(gòu)均有不同程度的破壞，對照組（圖7A）中細(xì)胞膜已破裂，葉綠體膨大變圓，葉綠體膜破裂，內(nèi)容物外泄，葉綠體中出現(xiàn)大小不一的空洞；線粒體解體；有大量的淀粉粒和磷脂球體的出現(xiàn)，且體積較大。外源EBR處理的‘鳳丹’葉片細(xì)胞結(jié)構(gòu)也有不同程度的破壞，但均明顯比對照輕，其中1.0 mg∕L（圖7D）處理細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損程度最輕，其細(xì)胞膜邊界清晰完整，細(xì)胞內(nèi)葉綠體結(jié)構(gòu)較正常，呈長卵形排布在細(xì)胞膜內(nèi)，葉綠體膜分界清晰，基本沒有內(nèi)容物流出；淀粉粒和磷脂球體數(shù)量較少；線粒體為正常的圓形；細(xì)胞核和液泡形態(tài)正常，清晰可見。說明使用外源EBR可有效保護細(xì)胞膜、葉綠體和線粒體的完整性，進一步驗證了EBR有利于提高‘鳳丹’的耐熱性。

圖7 EBR對高溫脅迫下‘鳳丹’超微結(jié)構(gòu)的影響Fig.7 Effect of epibrassinolide on ultrastructure of′Fengdan′under high temperature stress

3 結(jié)論與討論

近年來，由于“溫室效應(yīng)”現(xiàn)象的加劇，全球氣溫不斷升高，整個農(nóng)林業(yè)面臨嚴(yán)重挑戰(zhàn)，對植物的耐熱性也提出了更高的要求［16］。高溫脅迫下，植物會打破體系原有的動態(tài)平衡，導(dǎo)致氧代謝失調(diào)，造成活性氧、丙二醛的積累，改變膜的透性，嚴(yán)重時對植物造成致死性傷害［17］。油菜素甾醇類物質(zhì)（brassinosteroids，BRs）現(xiàn)已是公認(rèn)的第六大類植物激素［18］，其生理活性遠(yuǎn)超過現(xiàn)有的5種激素［19］，其主要的生理效應(yīng)是促進細(xì)胞的生長和分裂，促進植物的光合作用，提高植物的抗逆性，具體表現(xiàn)為提高植物的抗旱［20-21］、抗鹽［22］、抗熱［15］、抗氧化能力［23］，在不利的自然條件下更為突出，又稱為逆境條件的緩和劑［24-25］。

植株最終產(chǎn)量的形成基礎(chǔ)以及植物對高溫最為敏感、直接的生理反應(yīng)過程都是光合作用。高溫中，植物需要保持很高的光合速率。這樣，植物才能保證生長和生存［26］。牡丹“喜溫和、忌酷熱”，且屬于具有較高的光補償點和較低的光飽和點的一類植物，對光能的有效利用范圍較窄，在南方夏季強光高溫環(huán)境下，其光合生理將受到脅迫［27-28］，主要表現(xiàn)為高溫引起光合速率的下降，在葉片溫度達(dá)到32℃以上時，蒸騰速率不再增加，導(dǎo)致葉片溫度進一步上升，進而危害到植物最主要的光合器官葉片的功能［29］。在茶樹、大豆、龍須菜等研究表明，外源EBR處理顯著提高了高溫脅迫下植物的凈光合速率［7，9，30］。本研究表明，外源EBR可減緩高溫對‘鳳丹’光合作用的抑制，顯著提高了凈光合速率，增強光合能力，不同濃度EBR處理的凈光合速率隨EBR濃度的升高而升高，其中濃度1.5 mg∕L處理凈光合速率值最高，達(dá)到12.29 μmol∕m2·s，較對照提高148.2%。

植物在高溫脅迫下細(xì)胞膜傷害和脂膜透性增加是高溫傷害的本質(zhì)之一［31］。高溫脅迫下植物會發(fā)生過氧化作用，植物體內(nèi)會積累大量的過氧化產(chǎn)物，同時脂膜透性增大，細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)滲透壓增加，繼而引發(fā)電解質(zhì)外滲，從而導(dǎo)致組織浸出液的電導(dǎo)率增大［32］。有研究表明，隨著溫度升高，牡丹葉片電導(dǎo)率呈現(xiàn)不斷上升趨勢，高溫破壞了牡丹葉片細(xì)胞膜的透性［3］。本研究表明，外源EBR處理可減緩‘鳳丹’葉片電解質(zhì)的滲出，抑制相對電導(dǎo)率的上升，能更好地保護細(xì)胞膜的完整性，緩解膜脂過氧化的過程，有效降低丙二醛的積累，從而緩解高溫對‘鳳丹’的傷害。不同濃度EBR處理的‘鳳丹’葉片相對電導(dǎo)率和丙二醛含量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，其中1.0 mg∕L處理效果最好。

自然條件下，植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和消除會處于一種動態(tài)平衡，而遭受高溫后，這種平衡會造成破壞，造成活性氧的過量積累，最終會導(dǎo)致植物受到不同程度的傷害［33］。SOD是植物體內(nèi)抵御活性氧傷害的重要酶類之一，在清除超氧化物陰離子自由基方面起到重要作用。有研究表明，高溫能促進活性氧物質(zhì)的形成，鈍化SOD等抗氧化酶的活性［34］。本研究表明，外源EBR處理可明顯提高‘鳳丹’SOD活性，其中以1.0 mg∕L處理效果最好，表明外源EBR可通過提高高溫脅迫下‘鳳丹’的抗氧化活性，增強清除自由基和活性氧的能力，從而緩解高溫對植物的傷害。這與李治鑫等［7］在茶樹、華智銳等［19］在小麥上的研究結(jié)果一致。在透射電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，外源EBR處理使‘鳳丹’葉片保持較完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，可有效保護細(xì)胞膜，抑制葉綠體和線粒體的變形和解體，進一步驗證了EBR可保護‘鳳丹’葉片細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，從而提高耐熱性。

綜上所述，外源EBR作為一種高活性的植物激素，對高溫脅迫下的牡丹有較好的保護作用，可有效抑制高溫對抗氧化系統(tǒng)和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的傷害，提高牡丹的耐熱性，以1.0 mg∕L處理效果最好，為牡丹的抗高溫栽培提供了理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。EBR作為化學(xué)誘抗劑在牡丹上有較好的應(yīng)用效果和應(yīng)用前景。