MEF兩種制備方法比較及接種密度的篩選

文│相榮科（山東省蘭陵縣畜牧局、北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院）

田興福（山東省蘭陵縣畜牧局）

高建明 穆祥（北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院）

胚胎生物技術(shù)在畜牧生產(chǎn)、培育新品種和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究上具有重要的理論和商業(yè)價(jià)值。胚胎干細(xì)胞技術(shù)則是胚胎分割、胚胎克隆、體細(xì)胞克隆、胚胎嵌合、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)等生物技術(shù)的樞紐。目前，胚胎干細(xì)胞技術(shù)已成為個(gè)體和器官發(fā)生發(fā)育、細(xì)胞分化和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、新基因發(fā)現(xiàn)及其功能表達(dá)調(diào)控、腫瘤發(fā)生等研究領(lǐng)域不可或缺的模型材料和工具。同時(shí)，在細(xì)胞及基因治療、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、藥物開發(fā)等方面也顯示了潛力。

胚胎干細(xì)胞（ESCs）是具有發(fā)育全能性的細(xì)胞。在進(jìn)行ESCs、精原干細(xì)胞等特殊細(xì)胞的研究時(shí)，往往需要成纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)層，已達(dá)到干細(xì)胞維持生物學(xué)特性的條件。同時(shí)，ESCs不僅可以作為體外研究細(xì)胞分化和發(fā)育調(diào)控機(jī)制的模型，還對(duì)移植治療、藥物發(fā)現(xiàn)及篩選、細(xì)胞及基因治療和生物發(fā)育等基礎(chǔ)研究等帶來深遠(yuǎn)的影響。本研究通過酶消化法結(jié)合組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF），力求為胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)和傳代提供方便、價(jià)廉、活性高、數(shù)量多、純度高的飼養(yǎng)層細(xì)胞，從而獲得量多、優(yōu)質(zhì)的ESCs，為以后深入的研究ESCs的分化提供優(yōu)質(zhì)和充足的材料。

本試驗(yàn)以12.5～14.5天的小鼠胚胎為材料，通過酶消化法結(jié)合組織塊培養(yǎng)法分離培養(yǎng)MEF，對(duì)MEF生長(zhǎng)狀況進(jìn)行觀察并對(duì)MEF長(zhǎng)滿孔板的時(shí)間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；獲得的3～5代的MEF，以1×105/孔（低密度）、5×105/孔（中密度）、1×106/孔（高密度）不同密度接種，1天后觀察飼養(yǎng)層細(xì)胞鋪層情況；以購(gòu)買的mESCs為材料，接種到不同密度的飼養(yǎng)層細(xì)胞上，觀察mESCs的生長(zhǎng)情況。結(jié)果表明：通過酶消化法可以較短時(shí)間獲得原代MEF（2.18±0.19天），而組織塊培養(yǎng)為5.13±0.24天，酶消化法結(jié)合組織塊培養(yǎng)法可以獲得更多MEF；1×105/孔密度飼養(yǎng)層鋪層效果比較好，且mESCs生長(zhǎng)狀況良好。

一、材料和方法

1.試驗(yàn)材料。小鼠胚胎干細(xì)胞（mESCs）第3代。昆明白小鼠（SPF級(jí)，6～8周齡）購(gòu)自北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。按公母鼠1∶2的比例晚上合籠，次日早7：00檢查陰道栓。見栓日記為妊娠0.5天。選妊娠12.5～14.5天的孕鼠制備MEF。

2.主要試劑。孕馬血清促性腺素（PMSG）和人絨毛膜促性腺激素（hCG）、PBS（Gene Technology）、絲裂霉素-C、β-巰基乙醇、胎牛血清、0.25%Trypsin-EDTA消化液、特級(jí)胎牛血清。

3.培養(yǎng)液配制。MEF培養(yǎng)液：H-DMEM＋10% FBS＋100國(guó)際單位/毫升青霉素＋100微克/毫升鏈霉素。ESCs培養(yǎng)液：H-DMEM＋20% FBS＋0.1毫摩爾/升β-巰基乙醇（β-ME）＋2毫摩爾/升 L-谷氨酰胺＋100國(guó)際單位/毫升青霉素＋100微克/毫升鏈霉素＋1%非必需氨基酸＋10納克/毫升白血病抑制因子（LIF）。

4.MEF飼養(yǎng)層的制備。酶消化法結(jié)合組織塊培養(yǎng)法。

（1）酶消化法。取妊娠12.5～14.5天孕鼠脫臼法處死，75%的酒精浸泡5分鐘，無菌環(huán)境中打開腹腔，分離出子宮，無Ca2+、Mg2+的PBS洗凈血跡后，分離出胎兒和胎膜，洗凈血跡，把胎兒從胎膜中分離出來。去除胎兒頭、尾、四肢、內(nèi)臟，無Ca2+、Mg2+的PBS洗滌后，將胎體剪碎成小于1立方毫米的組織塊，以1毫升/支胎兒的量加入0.25%Trypsin-EDTA消化液浸泡組織塊，37℃消化約5分鐘，倒置顯微鏡下觀察， 待較多細(xì)胞消化溢出后， 加入等量MEF培養(yǎng)液終止消化，輕微吹打，吸取上清液通過200目細(xì)胞篩后，以1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘獲取細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞密度1×105個(gè)/摩爾，觀察成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)情況和長(zhǎng)滿時(shí)間。

（2）組織塊培養(yǎng)法。組織消化后的殘余組織塊經(jīng)含10%FBS的DMEM洗滌兩次后分散置于培養(yǎng)板底部，每個(gè)組織塊間距約5毫米，加入少量FBS，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～4小時(shí)后，再加入適量MEF培養(yǎng)液，將組織塊浸泡于培養(yǎng)基中。每3天換液一次，每天觀察。

5.飼養(yǎng)層制備。MEF通過10微克/毫升的絲裂霉素C處理2小時(shí)，接種到0.1%明膠包被的孔板上。接種密度分別為1×105/孔（低密度）、5×105/孔（中密度）、1×106/孔（高密度），1天后觀察細(xì)胞的鋪層情況，之后接種ESCs并觀察ESCs生長(zhǎng)情況。

6.小鼠胚胎干細(xì)胞在飼養(yǎng)層上傳代。

（1）mESCs的解凍。準(zhǔn)備37℃溫水，并把ESCs培養(yǎng)液預(yù)熱到37℃，加入9毫升預(yù)熱好的培養(yǎng)液添加到離心管中，把ESCs從液氮中取出，在3分鐘內(nèi)，37℃迅速解凍解凍存管中的細(xì)胞。待完全解凍后，對(duì)凍存管管壁進(jìn)行消毒，把ESCs轉(zhuǎn)移到盛有培養(yǎng)液的離心管中，注意不要產(chǎn)生氣泡。用1毫升培養(yǎng)液沖洗凍存管，減少細(xì)胞損失，并轉(zhuǎn)入離心管中，把懸浮液混勻，1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，吸去上清液，加3毫升ESCs培養(yǎng)液，制成細(xì)胞懸液。把ESCs接種到預(yù)先明膠包被的孔板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第二天，換液，待細(xì)胞長(zhǎng)到70%～80%融合時(shí)，可以進(jìn)行傳代處理。

（2）mESCs的傳代。首先移去ESCs培養(yǎng)液，用無Ca2+、Mg2+的PBS沖洗3遍，洗去殘留的培養(yǎng)液。用預(yù)熱的37℃的0.25%Trypsin-EDTA消化液消化20秒后，加入等量的ESCs培養(yǎng)液吹打使終止消化。之后把消化液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘。吸去上清液，加3毫升ESCs培養(yǎng)液，制成細(xì)胞懸液，把mESCs接種到預(yù)先明膠包被的孔板中。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第二天換液，待細(xì)胞長(zhǎng)到70%～80%融合時(shí)，可以進(jìn)行再次傳代或凍存。

7.數(shù)據(jù)處理及分析。原代MEF長(zhǎng)滿時(shí)間，利用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

二、結(jié)果

1.不同方法培養(yǎng)MEF鋪滿孔板時(shí)間。酶消化培養(yǎng)MEF時(shí)，30分鐘MEF即可貼壁。倒置顯微鏡下觀察，MEF貼壁后。多有長(zhǎng)短不等的數(shù)個(gè)突起，呈梭形、不規(guī)則三角形或扇形，核為卵圓形較大，細(xì)胞界限清晰，原代MEF2.18±0.1天即可長(zhǎng)滿孔板（圖1A）。在原代時(shí)會(huì)有一些雜細(xì)胞，在第3代時(shí)，可得到較純的MEF，生長(zhǎng)連成片，細(xì)胞緊密排列無間隙。

表1 MEF鋪滿孔板時(shí)間

◎圖1 不同培養(yǎng)方法MEF生長(zhǎng)情況

◎圖2 不同接種密度飼養(yǎng)層鋪層情況

組織塊培養(yǎng)法2～3天后可觀察到大量細(xì)胞從組織塊邊緣游出，游出的細(xì)胞大多呈梭形，圍繞組織塊呈放射狀排列（圖1B）。5.13±0.24天后游出的細(xì)胞鋪滿孔板可傳代培養(yǎng)（圖1C）。

2.不同接種密度飼養(yǎng)層鋪層情況。由圖2可見，中等接種密度（圖2B）的飼養(yǎng)層鋪成單層效果比較好，較低接種密度（圖2A）孔板內(nèi)細(xì)胞空隙較大，未能形成飼養(yǎng)單層，較高接種密度（圖2C）細(xì)胞排列較緊密。

3.mESCs在飼養(yǎng)層生長(zhǎng)和傳代。ESCs細(xì)胞解凍后置于孔板中可見細(xì)胞小亮圓邊界清晰，胞漿少，細(xì)胞核大，核仁明顯。細(xì)胞排列致密，呈克隆狀生長(zhǎng)（圖3）。ESCs克隆周圍平滑，倒置顯微鏡下觀察有很強(qiáng)的立體感，克隆邊界清晰、光滑，細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞之間界限不清。隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，細(xì)胞克隆進(jìn)一步增大，中央逐漸突起，倒置顯微鏡下觀察立體感更強(qiáng)，當(dāng)細(xì)胞70%～80%融合時(shí)，需進(jìn)行消化傳代。

從ESCs在不同飼養(yǎng)層密度上生長(zhǎng)狀況來看，在較低密度飼養(yǎng)層上生長(zhǎng)的ESCs形成的克隆小，克隆容易從板底脫落，很難達(dá)到克隆的融合；較高密度飼養(yǎng)層上生長(zhǎng)的ESCs形成的克隆時(shí)間較長(zhǎng)，達(dá)到融合時(shí)的時(shí)間也較長(zhǎng)，且克隆中間部位細(xì)胞顏色加深，可能部分細(xì)胞已經(jīng)老化；在中密度飼養(yǎng)層上生長(zhǎng)的ESCs形成的克隆較快，克隆一旦形成，在1～2天既能達(dá)到融合。

ESCs消化后，按1∶2比例接種在MEF制作的飼養(yǎng)層上之后，約48小時(shí)即可出現(xiàn)典型的ES細(xì)胞克隆。克隆內(nèi)細(xì)胞緊密地聚集在一起，細(xì)胞間界限不清，形似鳥窩，克隆周邊與飼細(xì)胞層界限清楚，無分化跡象。ESCs克隆一旦出現(xiàn)，即可快速生長(zhǎng)。表現(xiàn)為克隆逐漸增大，中央逐漸隆起。待細(xì)胞長(zhǎng)到70%～80%融合時(shí)，可以進(jìn)行再次傳代或凍存。

三、討論

1.不同方法培養(yǎng)MEF。ESCs培養(yǎng)普遍采用飼養(yǎng)層，它已形成一種常規(guī)且穩(wěn)定的ESCs培養(yǎng)方式。目前用于制備飼養(yǎng)層的細(xì)胞主要有MEF、HEF（人胚胎成纖維細(xì)胞）、STO（SIM小鼠胚胎成纖維細(xì)胞）。其中MEF在ESCs建系、擴(kuò)增培養(yǎng)中最為常用。目前制備MEF的方法有酶消化法、組織塊貼壁法、酶消化法結(jié)合組織塊法，但形成細(xì)胞單層的時(shí)間和數(shù)量不同。郎洪彥等用酶消化法制備的MEF的原代培養(yǎng)形成細(xì)胞單層所需時(shí)間為2.3±0.1天，組織塊培養(yǎng)法制備的MEF形成細(xì)胞單層的時(shí)間為5.1±0.3天。

◎圖3 解凍后3天呈克隆狀生長(zhǎng)的mESCs（100×，200×）

本試驗(yàn)通過將酶消化培養(yǎng)法和組織塊培養(yǎng)法結(jié)合起來制備MEF，酶消化法制備的MEF的原代培養(yǎng)形成細(xì)胞單層所需時(shí)間為2.18±0.19天，組織塊培養(yǎng)法制備的MEF形成細(xì)胞單層的時(shí)間為5.13±0.24天。與郎洪彥等研究沒有顯著差別。但該方法既可以在較短時(shí)間內(nèi)獲得大量MEF，從而在較短的時(shí)間內(nèi)獲得飼養(yǎng)層；又可以根據(jù)鋪層時(shí)間上的差異，將一只母鼠制備的MEF分成兩批，從而獲得更多的MEF。

2.不同接種密度對(duì)MEF鋪層的影響。ESCs在飼養(yǎng)層上的生長(zhǎng)對(duì)飼養(yǎng)層細(xì)胞的密度要求較高。王璐等在研究中發(fā)現(xiàn)，飼養(yǎng)層細(xì)胞密度過高，在與ESCs競(jìng)爭(zhēng)養(yǎng)分的同時(shí)細(xì)胞本身易老化，易發(fā)生卷層現(xiàn)象，將胚胎干細(xì)胞包裹其中，無法分離。飼養(yǎng)層細(xì)胞密度過低，分泌分化抑制因子不足，ESCs易發(fā)生分化。Vitezslav Bryja等指出，飼養(yǎng)層細(xì)胞密度過高時(shí)，可以增加換液頻率；飼養(yǎng)層細(xì)胞密度過低時(shí)，可以補(bǔ)加飼養(yǎng)層細(xì)胞，以維持ESCs的培養(yǎng)條件。本試驗(yàn)以三種密度制備飼養(yǎng)層細(xì)胞時(shí)，發(fā)現(xiàn)中等密度制備飼養(yǎng)層細(xì)胞較合適。

3.mESCs在飼養(yǎng)層上生長(zhǎng)狀況。ESCs接種到飼養(yǎng)層細(xì)胞上之后，一般約24～48小時(shí)，最遲3～4天即可出現(xiàn)典型的ESCs克隆。細(xì)胞集落呈一典型的克隆狀生長(zhǎng)，呈長(zhǎng)梭形或橢圓形，結(jié)構(gòu)均勻，表面光滑，細(xì)

胞小，克隆內(nèi)細(xì)胞緊密地聚集在一起，界限不清，形似鳥窩，細(xì)胞中有一個(gè)大的核，核內(nèi)可見到1～2個(gè)核仁，胞質(zhì)較少?？寺≈苓吪c飼養(yǎng)細(xì)胞層界限清楚，無分化跡象。ESCs克隆一旦出現(xiàn)，即可快速生長(zhǎng)。表現(xiàn)為克隆逐漸增大，中央逐漸隆起。一般2～3天后飼養(yǎng)層上即可布滿大量的克隆。本實(shí)驗(yàn)中觀察到的ESCs的生長(zhǎng)情況與文獻(xiàn)中描述的相同，說明ESCs處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。

四、結(jié)論

本試驗(yàn)通過酶消化培養(yǎng)法和組織塊培養(yǎng)法結(jié)合起來制備MEF，不同接種密度制備飼養(yǎng)層，之后讓ESCs在飼養(yǎng)層上生長(zhǎng)，得出通過酶消化法可以較短時(shí)間獲得MEF，酶消化法結(jié)合組織塊培養(yǎng)法可以獲得更多MEF；中等密度飼養(yǎng)層鋪層效果比較好，且ESCs生長(zhǎng)狀況良好。