高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定玩具中雙酚A的遷移量

李函珂,張 青,黃寧珊,周懿琦,林捷聰,林紹鵬,田 勇,蟻樂洲,劉崇華,黃理納

(廣東檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東 廣州 510623)

作為一種用于制造塑料、環(huán)氧樹脂和其他材料的化合物，雙酚A(BPA)數(shù)十年來被大量生產(chǎn)和廣泛使用，已經(jīng)導(dǎo)致人類的普遍暴露[1]。同時(shí)，雙酚A也是一種內(nèi)分泌干擾物，可干擾激素的合成及代謝，且與人體生殖系統(tǒng)的多種病變相關(guān)，如前列腺增生和女性性早熟[2-3]。對(duì)于兒童,研究亦表明雙酚A暴露或?qū)е聝和逝智铱赡軐?duì)學(xué)習(xí)和記憶能力有副作用[4-5]。此外，妊娠期雙酚A暴露還可能影響兒童在3歲左右時(shí)的行為和情緒調(diào)節(jié)能力[6]。

鑒于雙酚A的暴露風(fēng)險(xiǎn)和兒童易受傷害的特質(zhì)，歐盟 1272/2008號(hào)法規(guī)將雙酚A歸為第2類生殖毒性物質(zhì)[7]。2014年，歐盟指令2014/81/EU明確規(guī)定玩具中單體雙酚A的遷移量不得高于 0.1 mg·L-1[8]。然而，由于歐洲食品安全局在2015年建議將雙酚A的每日耐受攝入量(TDI)臨時(shí)設(shè)為4 μg·kg-1·d-1[9],歐盟委員會(huì)的玩具安全專家組決定采用3 μg·kg-1·d-1作為雙酚A的TDI,最終使得玩具中雙酚A的遷移量在(EU)2017/898指令中被進(jìn)一步降至 0.04 mg·L-1[10]。為了解特定條件下兒童與玩具的口部接觸雙酚A遷移量，歐盟玩具安全標(biāo)準(zhǔn)EN 71-10：2005給出了遷移條件，其中以水作為模擬液[11]，同時(shí)EN 71-11：2005還給出了測(cè)定雙酚A遷移量的高效液相色譜-二極管陣列-熒光檢測(cè)(HPLC-DAD-FLD)方法[12]。然而，上述標(biāo)準(zhǔn)所采用的遷移條件和檢測(cè)方法均已過時(shí)，其中，EN 71-9：2005中所采用的遷移溫度(20 ℃)不能代表口部接觸過程中可預(yù)見的最壞情形，且EN 71-10：2005中檢測(cè)方法的定量下限已接近2017/898指令中規(guī)定的雙酚A遷移限量[12]，故已無法滿足新指令的限量要求。因此，須采用更為合理的遷移條件并建立更可靠、靈敏的檢測(cè)方法，其定量下限通常應(yīng)不高于限量的1/10(即LOQ≤4 μg·L-1)。雙酚A的測(cè)定已被廣泛研究，主要包括酶聯(lián)免疫法(ELISA)[13]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[14]，以及高效液相色譜(HPLC)與熒光檢測(cè)器(FLD)[15]、電化學(xué)檢測(cè)器(ECD)[16]、質(zhì)譜檢測(cè)器(MS)[17]或串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)器(MS/MS)聯(lián)用的方法[18-19]。上述方法中，HPLC-MS/MS法因可檢測(cè)亞ppb級(jí)的雙酚A且受干擾和基體效應(yīng)的影響小，而得到廣泛應(yīng)用。

本文旨在建立和優(yōu)化適于檢測(cè)痕量雙酚A遷移量的HPLC-MS/MS方法。同時(shí)，在實(shí)驗(yàn)中亦發(fā)現(xiàn)聚酰胺(PA、尼龍66)和聚醚砜(PES)的針式過濾器可導(dǎo)致雙酚A的大量損失，但一些標(biāo)準(zhǔn)方法并未對(duì)該問題足夠重視，甚至存在錯(cuò)誤，故按標(biāo)準(zhǔn)流程操作后可能獲得雙酚A遷移假陰性[20-21]。為此，本文首次系統(tǒng)全面地研究了遷移溶液過濾時(shí)所用針式過濾器對(duì)雙酚A回收率的影響，測(cè)定了玩具樣品的雙酚A遷移量，以評(píng)估玩具的雙酚A暴露水平。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

1200系列高效液相色譜儀(美國Agilent公司)、3200 QTRAP三重四極桿質(zhì)譜儀(美國AB Sciex公司)、SW22 型恒溫水浴振蕩器(德國Julabo公司)。

雙酚A標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(純度99.8%，德國Dr.Ehrenstorfer 公司)。甲醇(色譜純，美國Fisher公司)；實(shí)驗(yàn)所用去離子水均取自Milli-Q Direct 純水系統(tǒng)，電阻率不低于18.2 MΩ·cm。

0.45 μm 和 0.22 μm 混合纖維素(MCE)針式過濾器購自天津領(lǐng)航實(shí)驗(yàn)設(shè)備股份有限公司；0.45 μm 和 0.22 μm 聚酰胺(PA，尼龍66)、聚醚砜(PES)和聚四氟乙烯(PTFE)針式過濾器購自天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；直徑約0.7 μm 四甲基氯硅烷(TMCS)去活的玻璃棉購自德國CNW Technologies公司；自制不同材質(zhì)塑料片(50 mm×10 mm×1.0 mm)，材質(zhì)包括丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物(ABS)、聚碳酸酯(PC)、聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚丙烯(PP)和聚亞苯基砜(PPSU)；含約10 g/kg雙酚A的自制聚氯乙烯(PVC)塑料片(50 mm×10 mm×1.0 mm)。

玩具樣品均購自廣州本地市場(chǎng)，包括玩具賽車、變形金剛玩具、玩具手槍和益智玩具套裝。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取一定量雙酚A，用甲醇配制為100 mg·L-1的雙酚A標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液；用超純水將上述溶液逐級(jí)稀釋，得到質(zhì)量濃度為2、5、10、 20、50、100 μg·L-1的雙酚A標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 樣品前處理

樣品前處理程序基于EN 71-9:2005條款6并進(jìn)行了修改[11]：將玩具樣品剪為若干表面積為(10±1.0) cm2的小片，剪切過程中使玩具的不可接觸及內(nèi)表面的面積最小。其后，將小片置于250 mL三角瓶中，并加入預(yù)熱至40 ℃的100 mL 水作為模擬液。將三角瓶加塞密封后，置于40 ℃恒溫水浴中，以150 r/min的頻率振蕩遷移1 h。遷移完成后，取一定體積模擬液，用MCE針式過濾器過濾后直接進(jìn)行HPLC-MS/MS分析。

1.4 儀器條件

1.4.1色譜條件色譜柱：Poroshell 120 EC-C18RRHD 柱(100 mm×2.1 mm，2.7 μm，美國Agilent公司)；進(jìn)樣體積：5 μL；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：水(A)-甲醇(B)。梯度洗脫程序：0～4.00 min，50%～95% B;4.00～6.00 min，95% B;6.00～6.10 min，95%～50% B;6.10～10.00 min，50% B。流速：0.35 mL·min-1。

1.4.2質(zhì)譜條件電離模式：ESI-；檢測(cè)方式：多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；噴霧電壓：-4 500 V；離子源溫度：600 ℃；氣簾氣壓力：241.3 kPa；霧化氣壓力：241.3 kPa；輔助氣壓力：310.3 kPa；儀器控制和數(shù)據(jù)分析軟件：Analyst 1.6.2。優(yōu)化后得到兩對(duì)響應(yīng)較強(qiáng)的離子對(duì)m/z227.1/133.3、m/z227.1/211.1，其中m/z227.1/133.3用于定量，對(duì)應(yīng)的去簇電壓、碰撞能量和碰撞池出口電壓分別為-58、-36、-4.0 V；m/z227.1/211.1用于輔助定性，對(duì)應(yīng)的去簇電壓、碰撞能量和碰撞池出口電壓分別為-58、-33、-4.8 V。

2 結(jié)果與討論

2.1 遷移條件的選擇

圖1 不同遷移溫度下的雙酚A遷移量(n=3)Fig.1 BPA migration under different temperatures during migration(n=3)

考慮到遷移條件應(yīng)能夠代表雙酚A對(duì)兒童暴露的可預(yù)見的最壞情形，本實(shí)驗(yàn)以歐盟玩具標(biāo)準(zhǔn)EN 71-10:2005所采用的遷移條件進(jìn)行修改。所用模擬液為去離子水，這是由于去離子水被廣泛用作模擬口部接觸過程中雙酚A暴露的模擬液[15,22-23]。此外，由于口部接觸時(shí)的溫度通常接近人體體溫(即37 ℃)，且Van Engelen等[24]建議若接觸溫度在20～40 ℃范圍內(nèi)，則遷移溫度應(yīng)選用40 ℃，因此本研究將遷移溫度設(shè)為40 ℃，這與EN 71-10:2005所采用的20 ℃不同[11]。圖1為不同溫度下含約10 g/kg雙酚A的PVC塑料片的雙酚A遷移量，由圖可見，當(dāng)遷移溫度由20 ℃升至40 ℃后，雙酚A遷移量顯著上升，幅度達(dá)164%，該結(jié)果也進(jìn)一步說明相較于20 ℃，40 ℃更能代表口部接觸時(shí)的最壞情形。

根據(jù)De Groot 和Juberg 等對(duì)兒童口部接觸時(shí)間的研究，將遷移時(shí)間設(shè)為1 h[25-26]。而根據(jù) K?nemann 等[27]的研究，選用10 cm2作為樣品的表面積，以代表一個(gè)可輕易被兒童咬住的物體的最大表面積。

2.2 針式過濾器的影響

針式過濾器因操作簡(jiǎn)便，常被用于液相色譜上機(jī)前溶液的過濾，常用過濾器的材質(zhì)包括PA、PTFE等[28-29]。已有研究表明PA和PES過濾器均會(huì)導(dǎo)致雙酚A在過濾時(shí)大量損失[29-30]，因此，本研究采用MCE、PA、PES和PTFE 4種常用的不同材質(zhì)過濾器對(duì)添加不同濃度(5、20、100 μg·L-1)雙酚A的水和甲醇進(jìn)行過濾，濾液由HPLC-MS/MS測(cè)定并計(jì)算雙酚A回收率，結(jié)果如圖2。可見，經(jīng)不同孔徑的PA和PES過濾器過濾后，水溶液中的雙酚A均大量損失，且僅當(dāng)其達(dá)100 μg·L-1時(shí)才可被檢測(cè)到(圖2A)；0.45 μm的PTFE過濾器對(duì)雙酚A的回收率雖高于90%，但該過濾器無法完全過濾細(xì)小顆粒物，仍可導(dǎo)致液相色譜六通閥及色譜柱的堵塞；而用0.22 μm的PTFE過濾器時(shí)雙酚A損失則高達(dá)23%，表明雙酚A的回收率可能與過濾器的孔徑大小存在一定關(guān)聯(lián)；MCE過濾器對(duì)雙酚A的回收率均高于90%，可歸因于雙酚A與纖維素酯之間的相互作用較弱，且MCE過濾器中加入的醋酸纖維素可能抑制了雙酚A的吸附[30]，因此MCE過濾器可滿足本實(shí)驗(yàn)要求；玻璃棉對(duì)雙酚A的回收率也均高于90%，但由于玻璃棉(GF)常用于對(duì)采集的水樣進(jìn)行過濾以去除其中可見的固體顆粒，仍可能導(dǎo)致液相色譜儀堵塞，故不適用于本實(shí)驗(yàn)[31]。此外，由圖2B可見，不同濃度的雙酚A甲醇溶液經(jīng)PA和PES過濾器過濾后，其回收率明顯高于雙酚A水溶液，此結(jié)果亦得到 Salgueiro-González等[28]的證實(shí)，可歸因于甲醇對(duì)雙酚A的洗脫能力強(qiáng)于水。但對(duì)0.22 μm的PES過濾器和0.45 μm的PA過濾器而言，仍有高達(dá)20%的雙酚A損失，表明此兩種過濾器對(duì)雙酚A的保留機(jī)制不同，且過濾器材質(zhì)會(huì)顯著影響雙酚A的回收率[32]。

將經(jīng)不同體積分?jǐn)?shù)(0%、25%、50%、75%、100%)甲醇溶解的100 μg·L-1雙酚A溶液分別由PA和PES過濾器過濾后，測(cè)定雙酚A的回收率，以考察甲醇含量對(duì)雙酚A回收率的影響。由圖可見，雙酚A的回收率隨甲醇體積分?jǐn)?shù)的增大而增加(圖3A)，可歸因于甲醇對(duì)雙酚A的洗脫能力強(qiáng)于水。此外，僅25%的甲醇就可大幅提高雙酚A的回收率，可能是由于雙酚A在甲醇中的溶解度遠(yuǎn)大于水中[33]。此性質(zhì)為僅有PA或PES過濾器可用時(shí)提供了一個(gè)降低雙酚A過濾損失的替代方法，即將遷移溶液與甲醇按一定比例混合。

而Hebig等[34]研究也表明，使用針式過濾器時(shí)，通過棄掉一定體積的濾液，可大幅降低待測(cè)物在過濾時(shí)的損失，即過濾器中的吸附位點(diǎn)可被待測(cè)物飽和而在繼續(xù)過濾時(shí)不再損失。本實(shí)驗(yàn)將100 μg·L-1的雙酚A水溶液分別由PA和PES過濾，但分別棄掉前0、1、2、5、10、15 mL濾液，以研究棄掉濾液體積與雙酚A回收率的關(guān)系(圖3B)。由圖可見，通過棄掉一定體積的濾液，雙酚A損失逐漸降低，且當(dāng)棄掉濾液體積達(dá)15 mL時(shí)，除0.22 μm的PES過濾器損失了15%的雙酚A外，其余各過濾器的雙酚A回收率均已接近100%。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)棄掉濾液體積達(dá)25 mL時(shí)，該過濾器的雙酚A回收率升至100%，表明其吸附位點(diǎn)最多，故對(duì)雙酚A的吸附最強(qiáng)。若待過濾溶液中雙酚A濃度更低，則為使雙酚A回收率接近100%所需棄掉的濾液體積亦更多。同時(shí)，上述結(jié)論也為僅有PA或PES過濾器可用時(shí)提供了另一個(gè)降低雙酚A過濾損失的替代方法。但不論通過將待過濾溶液與甲醇混合亦或棄掉一定體積濾液，均遠(yuǎn)不及直接使用MCE過濾器便捷，且后者對(duì)于大批量樣品處理更為有利，因此本文采用MCE直接過濾。

2.3 儀器條件的優(yōu)化

2.3.1色譜條件的優(yōu)化本實(shí)驗(yàn)采用梯度洗脫，一方面是由于梯度壓縮效應(yīng)可得到更窄的色譜峰[35]，有利于提高方法的靈敏度，另一方面，由于流動(dòng)相的溶劑強(qiáng)度在洗脫過程中不斷增大，亦有利于減少色譜柱內(nèi)的累積污染。同時(shí)，考慮到雙酚A的logKow值為3.0，且本文所用的液相色譜儀器的壓力上限為60 MPa，因此本實(shí)驗(yàn)選用Poroshell 120 EC-C18柱(100 mm×2.1 mm，2.7 μm)進(jìn)行分離。由于雙酚A的一、二級(jí)電離常數(shù)分別為9.4±0.3(pKa1)和10.37±0.07(pKa2)[36]，在水-甲醇體系(pH≤7.0)中其電離可忽略且主要以分子形式存在，故本研究采用水-甲醇作為流動(dòng)相。

2.3.2質(zhì)譜條件的優(yōu)化在負(fù)離子模式下對(duì)雙酚A進(jìn)行母離子掃描，得到去質(zhì)子離子峰，即[M-H]-。其后，調(diào)節(jié)去簇電壓(DP)，使其響應(yīng)最高。確定母離子后，繼續(xù)進(jìn)行子離子掃描，其中m/z133.3和m/z211.1兩個(gè)子離子的響應(yīng)最高(圖4A)，其形成可歸因于[M-H]-離子失去了CH4和C6H6O基團(tuán)[37]。其后，調(diào)節(jié)碰撞能量(CE)和碰撞池出口電壓(CXP)使子離子響應(yīng)最高。經(jīng)優(yōu)化，m/z227.1→133.3的響應(yīng)最高，因此選其作為定量離子對(duì)。優(yōu)化后的MRM參數(shù)如“1.4.2”所示。

上述優(yōu)化條件下，50 μg·L-1雙酚A溶液的提取離子色譜圖(XIC)如圖4B所示。

圖4 雙酚A的碰撞誘導(dǎo)解離質(zhì)譜圖(A)及提取離子色譜圖(50 μg·L-1)(B)
Fig.4 Collision-induced dissociation(CID)mass spectra of BPA(A) and extracted ion chromatograms(XIC) of BPA(50 μg·L-1)(B)

2.4 線性范圍、檢出限與定量下限

按“1.2”方法配制雙酚A系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在優(yōu)化條件下進(jìn)行HPLC-MS/MS分析。以得到的峰面積(y，counts)為縱坐標(biāo)，雙酚A的質(zhì)量濃度(x，mg·L-1)為橫坐標(biāo)作圖，得到線性方程為y=4 220x-2 062，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.999 4，曲線各點(diǎn)的回測(cè)精度為94.7%～110%，表明雙酚A在0.002～0.1 mg·L-1范圍內(nèi)線性良好。此外，取ABS、PC、PET、PP和PPSU塑料片若干，加入一定量雙酚A標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“1.3”方法處理，以得到的雙酚A濃度標(biāo)準(zhǔn)偏差的3倍和10倍分別作為方法檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)。結(jié)果顯示，本方法的檢出限和定量下限分別為0.30～0.52 μg·L-1和1.00～1.72 μg·L-1(表1)。

表1 不同材質(zhì)塑料片中雙酚A的加標(biāo)回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=7)、方法檢出限及定量下限Table 1 Spiked recoveries,RSDs,LODs and LOQs(n=7) of BPA in plastic sheets made of different materials

(續(xù)表1)

MaterialSpiked(μg·L-1)Found(Mean±SD)(μg·L-1)Recovery(%)RSD(%)LOD(μg·L-1)LOQ(μg·L-1)100103±5.11035.0PC22.1±0.11066.70.451.502019.8±0.599.12.4100100.1±2.11002.1PET21.9±0.196.55.40.321.082019.6±0.897.74.3100101.8±4.01024.0PP22.1±0.21068.60.521.722020.8±1.51047.110096.8±7.296.83.7PPSU21.9±0.196.75.40.321.082020.6±0.51032.2100101.4±3.01013.0

2.5 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

以不同材質(zhì)陰性塑料片為樣品，將其浸入模擬液后，分別添加不同濃度的雙酚A標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到方法的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。由表1可見，3個(gè)加標(biāo)水平下雙酚A的回收率為96.5%～106%，RSD為2.0%～8.6%，表明本方法的準(zhǔn)確度和精密度良好。此外，還測(cè)定了陽性PVC塑料片的雙酚A遷移量，以考察方法的日內(nèi)和日間精密度。結(jié)果表明，該陽性PVC塑料片的日內(nèi)和日間雙酚A遷移量分別為(4.3±0.2) mg·L-1和(4.1±0.3) mg·L-1，日內(nèi)和日間RSD分別為4.0%和8.7%，表明本方法具有良好的日內(nèi)和日間精密度。

2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定

將本方法用于從廣州本地市場(chǎng)所購?fù)婢叩碾p酚A遷移量測(cè)定，對(duì)所購?fù)婢邩悠飞瞎灿?jì)26個(gè)可觸及的塑料部件進(jìn)行測(cè)試，以評(píng)估雙酚A的暴露水平。結(jié)果表明，上述塑膠部件的雙酚A遷移量均低于本方法的定量下限，滿足歐盟指令(EU)2017/898的要求。

3 結(jié) 論

本研究在歐盟玩具安全標(biāo)準(zhǔn)EN 71-10：2005的基礎(chǔ)上改進(jìn)了遷移條件并建立了可靠且能直接檢測(cè)痕量雙酚A遷移量的HPLC-MS/MS方法，采用的遷移條件能夠代表兒童與玩具口部接觸過程中可預(yù)見的最壞情形，且方法的定量下限低至1.00～1.72 μg·L-1，可滿足2017/898指令中雙酚A限量(0.04 mg·L-1)的要求。研究表明，當(dāng)樣品中含有大量雙酚A時(shí)，僅有極少數(shù)可遷移至模擬液中，故即使雙酚A遷移測(cè)試合格的樣品或仍含有大量雙酚A，因此雙酚A的潛在暴露風(fēng)險(xiǎn)仍然存在。同時(shí)，MCE過濾器的雙酚A損失最小，PA和PES過濾器的雙酚A損失最大，因而前者更適于遷移溶液的過濾。本研究亦提出了當(dāng)僅有PA和PES過濾器可用時(shí)的兩種替代方法，即可將待過濾遷移溶液與甲醇混合或在過濾時(shí)棄掉一定體積的濾液，以減少雙酚A在過濾時(shí)的損失。