單顆粒熒光閃爍現(xiàn)象、機(jī)理與應(yīng)用

陳方圓，蘇 華，王 偉

(南京大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院 生命分析化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023)

單分子檢測(cè)技術(shù)始于20世紀(jì)80年代末，隨著各種顯微技術(shù)的發(fā)展，人們得以了解單分子水平上的物理與化學(xué)過(guò)程。1989年，Moerner等[1]在液氦條件下檢測(cè)到嵌于對(duì)三聯(lián)苯晶體中的單個(gè)染料分子并五苯的吸收信號(hào)，這是首次在單分子水平上開(kāi)展的實(shí)驗(yàn)研究。隨后幾年，單分子檢測(cè)技術(shù)由低溫檢測(cè)發(fā)展到常溫檢測(cè)，由最初單分子光譜[2]的測(cè)定，到利用近場(chǎng)掃描光學(xué)顯微鏡[3]、遠(yuǎn)場(chǎng)共聚焦熒光顯微鏡[4]以及全內(nèi)反射熒光顯微鏡[5]等技術(shù)實(shí)現(xiàn)單分子熒光成像，并由此發(fā)現(xiàn)了許多單分子尺度特有的新現(xiàn)象。例如，1994年Moerner等[6]在低溫條件下，首次發(fā)現(xiàn)在固體基質(zhì)中的單個(gè)Terrylene分子會(huì)在兩種狀態(tài)間切換，并通過(guò)改變激光功率證明該現(xiàn)象由光照引起。1996年，Brus等[7]發(fā)現(xiàn)單個(gè)CdSe量子點(diǎn)的發(fā)光在激光的連續(xù)照射下并不連續(xù)，而是在“亮態(tài)”和“暗態(tài)”之間隨機(jī)、頻繁轉(zhuǎn)換，表現(xiàn)出顯著的間歇性，并推測(cè)其不發(fā)光的“暗態(tài)”與光致電離過(guò)程有關(guān)。1997年，Moerner與錢永健等[8]觀察到綠色熒光蛋白(GFP)的突變體T203F和T203Y的單分子熒光強(qiáng)度隨時(shí)間波動(dòng)，是蛋白質(zhì)分子熒光閃爍現(xiàn)象的最早報(bào)道。

圖1 一個(gè)CdSe/ZnS量子點(diǎn)熒光發(fā)射強(qiáng)度的時(shí)間曲線Fig.1 Representative fluorescence emission intensity curve of a single CdSe/ZnS quantum dot

上述單個(gè)熒光生色團(tuán)在連續(xù)的激發(fā)光照射下間歇性的熒光發(fā)射現(xiàn)象稱為熒光閃爍(Fluorescence intermittency,俗稱Photobinking)。圖1顯示了一個(gè)CdSe/ZnS量子點(diǎn)的典型熒光閃爍曲線。在穩(wěn)定光源的持續(xù)照射下，其熒光發(fā)射會(huì)在明暗之間波動(dòng)：明是分子熒光處于發(fā)射態(tài)(“On state”)，暗是分子熒光處于非發(fā)射態(tài)(“Off state”)。每一個(gè)狀態(tài)持續(xù)時(shí)間不等，典型時(shí)間范圍從毫秒到數(shù)分鐘[9-10]。熒光閃爍現(xiàn)象具有以下典型特征：首先是個(gè)體之間的不同步性。不同個(gè)體的熒光閃爍現(xiàn)象并不同步，因此含有大量生色團(tuán)個(gè)體的宏觀體系由于系綜平均效應(yīng)無(wú)法觀測(cè)到這一閃爍現(xiàn)象，而是具有穩(wěn)定的熒光發(fā)射。例如，利用穩(wěn)態(tài)熒光光譜儀對(duì)含有大量熒光分子的溶液進(jìn)行測(cè)量時(shí)并不能觀察到熒光閃爍。不僅如此，對(duì)于粒徑較大且結(jié)晶度較差的熒光納米材料，即便在單顆粒水平上測(cè)量也不易觀察到熒光閃爍現(xiàn)象。這主要是由于此類材料往往包含較多熒光生色中心。因此，熒光閃爍現(xiàn)象本質(zhì)上是單個(gè)熒光生色中心的特征，而不是單個(gè)物理個(gè)體的特征。其次，對(duì)單個(gè)熒光生色團(tuán)而言，其熒光發(fā)射強(qiáng)度的時(shí)間曲線具有隨機(jī)性、顯著性和頻繁性[11-12]。隨機(jī)性主要表現(xiàn)在單一發(fā)射態(tài)和非發(fā)射態(tài)的持續(xù)時(shí)間缺乏明顯規(guī)律，往往在毫秒和數(shù)分鐘之間隨機(jī)分布。盡管對(duì)大量事件的統(tǒng)計(jì)分析表明其持續(xù)時(shí)間服從一定的統(tǒng)計(jì)規(guī)律(如冪律分布)[9]，但單一事件本身無(wú)法預(yù)測(cè)，而且受外界環(huán)境的影響規(guī)律尚不明確[13]。顯著性表現(xiàn)在兩個(gè)狀態(tài)之間的發(fā)光強(qiáng)度之間存在明顯差別，通常表現(xiàn)為強(qiáng)烈熒光發(fā)射和完全無(wú)發(fā)射兩種狀態(tài)之間的切換。這一特征有別于熒光相關(guān)光譜分析中由于分子熱運(yùn)動(dòng)引起的熒光強(qiáng)度微小波動(dòng)或漲落。頻繁性表現(xiàn)為在較短的觀測(cè)窗口(通常為數(shù)分鐘)內(nèi)狀態(tài)切換事件頻繁發(fā)生，而非有限的幾次狀態(tài)切換。

自發(fā)現(xiàn)以來(lái)，對(duì)熒光閃爍機(jī)理的探索在相當(dāng)程度上提升了人們對(duì)分子，特別是半導(dǎo)體光物理過(guò)程的認(rèn)識(shí)和理解。盡管目前科學(xué)界一般認(rèn)為這一現(xiàn)象與半導(dǎo)體材料的光致電離和無(wú)輻射俄歇過(guò)程有關(guān)，但許多細(xì)節(jié)仍有很大爭(zhēng)議[14-15]。不僅如此，對(duì)于以熒光量子點(diǎn)作為生物成像探針的應(yīng)用而言，頻繁出現(xiàn)的暗態(tài)不利于定量和空間定位。對(duì)于基于大量半導(dǎo)體的光電顯示和轉(zhuǎn)換器件而言，暗態(tài)的存在將光能以熱輻射的形式加以損耗，從而降低了器件效率。然而熒光閃爍現(xiàn)象不僅為超分辨熒光成像技術(shù)的發(fā)展提供了原始的啟發(fā)[16-17]，近年來(lái)更為半導(dǎo)體異質(zhì)結(jié)[18]和納米化學(xué)[19]等領(lǐng)域帶來(lái)了許多新的潛力和機(jī)遇。因此，探究熒光閃爍機(jī)制具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

1 熒光閃爍的光物理機(jī)制

1.1 有機(jī)熒光分子

相對(duì)而言，有機(jī)熒光分子的熒光閃爍機(jī)制較為明確。1995年，Br?uchle等[20]通過(guò)記錄單個(gè)有機(jī)染料分子(Terrylene)熒光強(qiáng)度的自相關(guān)函數(shù)獲取其系間竄躍速率(S1～T1，T1～S0)，進(jìn)而提出分子系間竄躍到三線態(tài)(壽命較長(zhǎng))導(dǎo)致產(chǎn)生暗態(tài)的觀點(diǎn)。2003年，Orrit等[21]發(fā)現(xiàn)羅丹明6G分子的暗態(tài)由三線態(tài)引起，并通過(guò)構(gòu)建理論模型驗(yàn)證了三線態(tài)作為中間態(tài)而導(dǎo)致熒光分子長(zhǎng)期不發(fā)光的結(jié)論，首次發(fā)現(xiàn)光誘導(dǎo)電荷轉(zhuǎn)移也是引起熒光閃爍的原因之一。之后，Ha等[22]發(fā)現(xiàn)Trolox(一種水溶性VE類似物)是良好的三線態(tài)猝滅劑，能夠有效抑制單分子熒光閃爍現(xiàn)象。

1.2 量子點(diǎn)

Efros等[23]于1997年提出量子點(diǎn)熒光閃爍的off態(tài)是由于帶電激子俄歇復(fù)合引起。盡管許多細(xì)節(jié)仍有待闡明和完善，這一觀點(diǎn)的基本框架已被人們普遍接受。當(dāng)1個(gè)不帶電的量子點(diǎn)在光照下被激發(fā)將產(chǎn)生電子和空穴(激子)，電子和空穴復(fù)合發(fā)射出光子，即產(chǎn)生熒光。若量子點(diǎn)帶電(中性顆粒發(fā)生電荷分離)，在光激發(fā)下又產(chǎn)生1對(duì)電子空穴對(duì)時(shí)，激子和這個(gè)多余的電荷相互作用，將發(fā)生快速非輻射躍遷俄歇過(guò)程。由于俄歇復(fù)合速率比輻射復(fù)合速率高幾個(gè)數(shù)量級(jí)，所以熒光過(guò)程在很大程度上被抑制，量子點(diǎn)則處于非發(fā)射態(tài)，off態(tài)由此產(chǎn)生。直至量子點(diǎn)中這個(gè)多余的電荷被中和，量子點(diǎn)在光照下產(chǎn)生激子，電子和空穴復(fù)合產(chǎn)生熒光，量子點(diǎn)返回on態(tài)。總體上，量子點(diǎn)熒光閃爍過(guò)程是光照引起量子點(diǎn)帶電，發(fā)生on-off的轉(zhuǎn)變；而當(dāng)量子點(diǎn)中的電子被中和后，發(fā)生off-on的轉(zhuǎn)變[24]。

Efros建立的模型為探究熒光閃爍機(jī)制奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。然而，該模型存在一個(gè)與實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象不符的問(wèn)題，即它預(yù)測(cè)的on/off-time統(tǒng)計(jì)分布呈單一指數(shù)關(guān)系[14]。因此，人們?cè)诖四Ｐ偷幕A(chǔ)上進(jìn)行了一系列修正，提出了多種模型解釋on態(tài)和off態(tài)持續(xù)時(shí)間的概率密度與on/off-time成冪函數(shù)的倒數(shù)關(guān)系的規(guī)律，即冪律分布(Power-law distribution)。主要提出了以下模型：①Verberk等[25]構(gòu)建的多載流子陷阱模型，成功地解釋了power-law統(tǒng)計(jì)中off-time的概率分布，但未能解釋on-time的power-law分布。②Shimizu等[26]構(gòu)建的能級(jí)漂移模型，以及在此基礎(chǔ)上，Tang等[27]提出的量子點(diǎn)和捕獲態(tài)能級(jí)均發(fā)生漂移的觀點(diǎn)，這一理論預(yù)測(cè)到on/off-time的power-law分布的斜率在較長(zhǎng)時(shí)間為1.5，而在較短時(shí)間為0.5，與實(shí)際1～2之間分布的規(guī)律不符。③Margolin等[28]構(gòu)建的空間跳動(dòng)模型，該理論模型預(yù)測(cè)的on/off-time斜率為1.5，然而實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示斜率可在1～2之間變化。而且，此模型中電子有可能再也回不到量子點(diǎn)內(nèi)部，從而使量子點(diǎn)不再發(fā)光，與實(shí)驗(yàn)不符。④Kuno等[29]構(gòu)建的勢(shì)壘波動(dòng)模型，電子隧穿勢(shì)壘的高度和寬度存在波動(dòng)，在隧穿過(guò)程中，局域環(huán)境的變化使得on-off和off-on的轉(zhuǎn)變速率發(fā)生變化，而此模型中隧穿速率的6個(gè)數(shù)量級(jí)的變化與實(shí)驗(yàn)不符。

上述模型均是基于熒光閃爍由帶電激子引起的俄歇復(fù)合導(dǎo)致，需要長(zhǎng)壽命捕獲態(tài)，被稱為A型熒光閃爍。但這些模型難以解釋power-law中連續(xù)的壽命分布。與A型熒光閃爍相對(duì)應(yīng)，不需要長(zhǎng)壽命捕獲態(tài)和俄歇復(fù)合的模型，稱為B型熒光閃爍[15]。

圖2 B型熒光閃爍的機(jī)制示意圖[15]Fig.2 Schematic of Type-B blinking mechanism[15]

B型熒光閃爍中，空穴被壽命約為1 μs的捕獲態(tài)捕獲，與導(dǎo)帶電子發(fā)生非輻射復(fù)合產(chǎn)生off態(tài)，電子被激發(fā)和復(fù)合后，量子點(diǎn)迅速回到中性基態(tài)。在這類熒光閃爍過(guò)程中，捕獲速率隨時(shí)間波動(dòng)，當(dāng)捕獲速率遠(yuǎn)大于輻射復(fù)合速率時(shí)，量子點(diǎn)在一段時(shí)間處于off態(tài)。具體過(guò)程為：空穴捕獲速率kt遠(yuǎn)小于量子點(diǎn)的輻射復(fù)合速率kr，量子點(diǎn)發(fā)出熒光，即on態(tài)(圖2A)；當(dāng)kt增大，且大于kr時(shí)，會(huì)發(fā)生on～off的轉(zhuǎn)換(圖2B)；kt遠(yuǎn)大于kr，量子點(diǎn)處于off態(tài)(圖2C)；當(dāng)kt變小，且小于kr時(shí)，發(fā)生off～on的轉(zhuǎn)換(圖2D)。

關(guān)于B型熒光閃爍，F(xiàn)rantsuzov等[30]提出非輻射復(fù)合速率波動(dòng)模型。量子點(diǎn)中電子在最低的兩個(gè)電子能級(jí)間躍遷1S(e)～1P(e)，躍遷產(chǎn)生的能量漂移調(diào)控空穴的捕獲速率(圖2E)。此模型很好地解釋了連續(xù)的壽命分布，但得到的power-law中on和off的指數(shù)數(shù)值為1.5。Barnes等[31]對(duì)此模型進(jìn)行改進(jìn)(圖2F)，提出多復(fù)合中心模型，成功解釋了在交換配體后，量子點(diǎn)的熒光閃爍得到抑制的現(xiàn)象。

目前，量子點(diǎn)熒光閃爍機(jī)制的基本框架已搭建，且上述理論模型能夠解釋大多數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但單獨(dú)任何一個(gè)模型均不能解釋所有的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象和結(jié)果。特別是A型熒光閃爍中量子點(diǎn)電離和中性化的機(jī)理尚未明確。

2 具有熒光閃爍現(xiàn)象的納米材料

隨著納米科學(xué)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)許多種類的納米材料具有優(yōu)異的熒光性能。單顆粒熒光光譜與成像研究顯示，其中一些納米材料表現(xiàn)出熒光閃爍行為，主要包括半導(dǎo)體量子點(diǎn)、碳納米點(diǎn)、聚合物點(diǎn)和金屬團(tuán)簇等。由于光致發(fā)光機(jī)理的不同，另一些常見(jiàn)的熒光納米材料(如上轉(zhuǎn)換材料、碳納米管等)的熒光閃爍特性則較不明顯。需要指出的是，這些認(rèn)識(shí)并非一成不變，而是有望隨著測(cè)量科學(xué)和材料學(xué)科的進(jìn)一步發(fā)展得到深化和革新。

2.1 半導(dǎo)體量子點(diǎn)

以CdSe為代表的Ⅱ-Ⅵ族量子點(diǎn)以其優(yōu)異的量子效率和光穩(wěn)定性，以及成熟的合成方法一直是熒光閃爍研究最重要的模型體系。單顆粒熒光成像揭示的閃爍現(xiàn)象和機(jī)制為科學(xué)家們合成長(zhǎng)時(shí)間處于on態(tài)的量子點(diǎn)指明了方向[11,32]。有關(guān)CdSe量子點(diǎn)熒光閃爍已有許多綜述發(fā)表[15,24]。由于Ⅱ-Ⅵ族量子點(diǎn)鎘元素潛在的毒性，以InP為代表的Ⅲ-Ⅴ族無(wú)鎘量子點(diǎn)得到了發(fā)展。單顆粒熒光成像研究表明，InP同樣具有熒光閃爍現(xiàn)象[33]。2015年，一種新型的量子點(diǎn)——鈣鈦礦量子點(diǎn)(Perovskite)被成功制備[34]。這種量子點(diǎn)除具有Ⅱ-Ⅵ族量子點(diǎn)高量子產(chǎn)率的優(yōu)點(diǎn)外，還能夠利用簡(jiǎn)單鹵素交換實(shí)現(xiàn)可見(jiàn)光區(qū)發(fā)光性質(zhì)調(diào)節(jié)，目前已在LED、量子點(diǎn)激光器、太陽(yáng)能電池等領(lǐng)域展現(xiàn)出應(yīng)用潛力[35]。最近研究發(fā)現(xiàn)，鈣鈦礦量子點(diǎn)同樣存在熒光閃爍行為[36-37]，但亦有研究者發(fā)現(xiàn)合成的鈣鈦礦量子點(diǎn)距離較遠(yuǎn)時(shí)不閃爍，距離靠近時(shí)閃爍[38]。

Ⅳ族量子點(diǎn)以硅量子點(diǎn)為代表。硅為間接帶隙半導(dǎo)體，而當(dāng)硅尺寸減小到4 nm的激子波爾半徑時(shí)，量子限域效應(yīng)使其聲子調(diào)控的間接帶隙躍遷被抑制，而直接帶隙躍遷得到增強(qiáng)，呈現(xiàn)出強(qiáng)的熒光[39]。已有研究表明，硅量子點(diǎn)與Ⅱ-Ⅵ和Ⅲ-Ⅴ族量子點(diǎn)類似，同樣具有熒光閃爍行為[40]。

2.2 熒光碳納米點(diǎn)(石墨烯量子點(diǎn))

自從2004年被首次發(fā)現(xiàn)以來(lái)，熒光碳納米點(diǎn)以其易于制備、低毒和高熒光穩(wěn)定性受到廣泛研究[41]。Sun等[42-44]將激光蝕刻法合成的熒光碳納米點(diǎn)進(jìn)行PEG修飾后，利用共聚焦熒光顯微鏡進(jìn)行了單顆粒成像，發(fā)現(xiàn)其無(wú)閃爍現(xiàn)象。然而，Richards等[45]在對(duì)合成的熒光碳納米點(diǎn)進(jìn)行單顆粒成像時(shí)，發(fā)現(xiàn)熒光碳納米點(diǎn)具有閃爍現(xiàn)象，且on態(tài)和off態(tài)均存在多種熒光強(qiáng)度值，揭示了其多發(fā)光中心的特點(diǎn)，顯著區(qū)別于傳統(tǒng)的半導(dǎo)體量子點(diǎn)和鈣鈦礦量子點(diǎn)。石墨烯量子點(diǎn)屬于一類特殊的熒光碳納米點(diǎn)，嚴(yán)格意義上講是具有一層或者少數(shù)幾層石墨烯結(jié)構(gòu)的熒光碳納米點(diǎn)。Xiao等[46]對(duì)石墨烯量子點(diǎn)進(jìn)行了單顆粒成像并測(cè)得了單顆粒光譜，發(fā)現(xiàn)了大量顆粒測(cè)試時(shí)得不到的信息：石墨烯層數(shù)越多的顆粒,其熒光越強(qiáng)而壽命越短；石墨烯量子點(diǎn)尺寸分布寬，但具有相同的光譜線寬和發(fā)射峰位；石墨烯量子點(diǎn)無(wú)閃爍的特征。

2.3 聚合物點(diǎn)

聚合物點(diǎn)是指由∏共軛聚合物組成的熒光納米顆粒。通常認(rèn)為尺寸大于10 nm的聚合物點(diǎn)不存在閃爍特征，而小尺寸的聚合物點(diǎn)仍存在閃爍。這是由于較大的聚合物點(diǎn)具有多個(gè)發(fā)光中心引起強(qiáng)度平均化所致[47]。

2.4 金屬納米簇

當(dāng)金屬的尺寸達(dá)1 nm左右時(shí)，導(dǎo)體的連續(xù)能帶將變成分離能級(jí)，即量子限域效應(yīng)將使金屬納米顆粒表現(xiàn)出熒光特征，稱為熒光金屬簇，目前主要包括銀、金和銅簇。一般認(rèn)為Ag納米簇不存在熒光閃爍現(xiàn)象，是指其在0.1 ms～1 s的生物學(xué)標(biāo)記窗口中無(wú)閃爍[48]。2007年，Dickson等[49]合成了單鏈DNA修飾的Ag納米簇(C12-Agn)，利用Hg燈激發(fā)在寬場(chǎng)下觀察到其單納米顆粒的近紅外熒光發(fā)射，研究發(fā)現(xiàn)647 nm連續(xù)波激光器照射下，低功率時(shí)C12-Agn未表現(xiàn)出閃爍，而高功率下表現(xiàn)出閃爍(23 000 W/cm2)。金納米簇通常存在長(zhǎng)時(shí)間的閃爍。Majima等[50-51]以405 nm二極管激光器作為光源，在顯微鏡上原位照射自由基前軀體2-羥基-4′-(2-羥乙氧基)-2-甲基苯丙酮和氯金酸的混合物，發(fā)現(xiàn)聚乙酸乙烯酯膜上原位產(chǎn)生了無(wú)配體修飾的熒光金納米簇，直徑約1 nm，最大激發(fā)波長(zhǎng)和最大發(fā)射波長(zhǎng)分別位于409 nm和490 nm，單納米顆粒成像揭示其存在閃爍特征且長(zhǎng)時(shí)間處于off態(tài)，并利用單顆粒熒光研究了其與氧氣的相互作用。

3 單顆粒熒光閃爍的利與弊

雖然量子點(diǎn)的熒光閃爍制約了其在很多方面的應(yīng)用，但熒光閃爍并非完全不利，這一現(xiàn)象的利與弊取決于其用處[52-54]。從基礎(chǔ)研究的角度來(lái)說(shuō)，熒光閃爍現(xiàn)象是中性的。量子點(diǎn)作為熒光探針和單光子源時(shí)，熒光閃爍現(xiàn)象會(huì)帶來(lái)負(fù)面影響。然而，利用量子點(diǎn)的熒光閃爍可以研究反應(yīng)活性及電子轉(zhuǎn)移，而超分辨熒光成像正是利用了量子點(diǎn)熒光閃爍的性質(zhì)。

3.1 熒光閃爍之弊

近年來(lái)，量子點(diǎn)發(fā)光設(shè)備(QD-LEDs)發(fā)展迅猛。顯示器件在經(jīng)歷了陰極射線管(CRT)的笨重、等離子體面板易燒屏、有機(jī)發(fā)光二極管(OLED)壽命短的變革后，QD-LEDs展現(xiàn)了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，具有色彩純凈、飽和度高、色域廣、使用壽命長(zhǎng)等特性。然而，量子點(diǎn)的熒光閃爍會(huì)影響QD-LEDs的發(fā)光性能[55]，這是由于量子點(diǎn)的熒光閃爍會(huì)降低其熒光量子產(chǎn)率，從而直接降低外部量子效率。熒光閃爍對(duì)單分子的光電器件影響尤其大，熒光閃爍的off態(tài)持續(xù)時(shí)間可從秒級(jí)到數(shù)分鐘甚至更長(zhǎng)，甚至可能導(dǎo)致器件長(zhǎng)時(shí)間不發(fā)光。

相比于有機(jī)熒光分子，量子點(diǎn)用作生物探針時(shí)具有光穩(wěn)定性好、亮度高等特點(diǎn)。然而，量子點(diǎn)的熒光閃爍會(huì)導(dǎo)致生物體系中單分子追蹤的中斷，從而要求特殊、復(fù)雜的數(shù)據(jù)分析方法重建單細(xì)胞的軌跡[56-57]。

3.2 熒光閃爍之利

由于光學(xué)衍射極限的存在，光學(xué)顯微鏡的分辨率受限，在數(shù)值孔徑為1.4，入射光波長(zhǎng)為550 nm的情況下，水平方向和z軸方向分辨率分別為200 nm和500 nm[58]。因此，普通的光學(xué)顯微鏡很難看清細(xì)胞結(jié)構(gòu)，所以發(fā)展一種高空間分辨率的技術(shù)尤為重要。

圖3 STORM超分辨熒光成像的原理[17]Fig.3 Schematic of stochastic optical reconstruction microscopy(STORM)with fluorophores[17]

Betzig、Zhuang等[16-17]于2006年幾乎同時(shí)提出了隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微術(shù)(STORM)和光活化定位顯微術(shù)(PALM)。這兩種成像技術(shù)均是利用熒光漂白和熒光恢復(fù)的特性調(diào)控活性熒光生色團(tuán)的密度，通過(guò)單分子水平的超定位技術(shù)實(shí)現(xiàn)超分辨成像，其水平方向和z軸方向分辨率分別能達(dá)到20 nm和50 nm。以STORM超分辨熒光成像為例，綠光和紅光分別為激發(fā)光和成像光源。通過(guò)使用低功率的綠光照射樣品，使少部分熒光分子發(fā)熒光，再將這些發(fā)光的分子全部猝滅，然后再隨機(jī)激活一部分熒光分子。循環(huán)往復(fù)，直至所有的熒光分子均被猝滅(圖3)。這些每次被激發(fā)的分子團(tuán)相距較遠(yuǎn)互不干擾，經(jīng)過(guò)二維高斯擬合能夠精確定位每個(gè)熒光分子的中心位置。連續(xù)拍攝多張圖片，得到所有熒光分子的中心位置，最后疊加構(gòu)成完整的圖像。由此可見(jiàn)，熒光閃爍現(xiàn)象不僅啟發(fā)了超分辨熒光成像技術(shù)的發(fā)展，而且構(gòu)成了一些超分辨技術(shù)(如dSTORM)的直接基礎(chǔ)。

Lagerholm等[59]測(cè)定了DNA片段間的距離，利用量子點(diǎn)的熒光閃爍精確測(cè)定相距很近的量子點(diǎn)的位置，由于每個(gè)量子點(diǎn)閃爍行為不同，通過(guò)連續(xù)拍攝一段錄像，分析比較圖像中每個(gè)像素點(diǎn)記錄的熒光在這段時(shí)間內(nèi)的閃爍情況。選取某個(gè)量子點(diǎn)進(jìn)行分析，將此量子點(diǎn)在這段時(shí)間內(nèi)的每次定位進(jìn)行平均，按此方法對(duì)所有量子點(diǎn)進(jìn)行定位。

Jain等[60]研究了有熒光發(fā)生變化的離子交換反應(yīng)，在交換反應(yīng)發(fā)生時(shí)由于瑕疵或摻雜，導(dǎo)致量子點(diǎn)熒光閃爍嚴(yán)重，從而可通過(guò)熒光閃爍隨反應(yīng)變化的時(shí)間反映中間產(chǎn)物的壽命，所研究的離子交換反應(yīng)如下：

不同于對(duì)多個(gè)顆粒的熒光軌跡單獨(dú)分析，此項(xiàng)研究則是分析多個(gè)顆粒在同一幀的發(fā)光情況求得每刻發(fā)光的顆粒數(shù)(Bright fraction)，從而得到量子點(diǎn)平均閃爍信息。該研究對(duì)不同反應(yīng)方向的Bright fraction隨時(shí)間變化進(jìn)行分析，進(jìn)而由熒光閃爍現(xiàn)象加劇的時(shí)間確定中間態(tài)壽命。因?yàn)樵陔x子交換過(guò)程中，電荷不匹配產(chǎn)生捕獲位點(diǎn)以及交換不完全引入雜質(zhì)而產(chǎn)生捕獲態(tài)，會(huì)導(dǎo)致off態(tài)變得更加普遍。盡管熒光閃爍具有隨機(jī)性，但仍然可以建立量子點(diǎn)熒光閃爍行為與其化學(xué)/結(jié)構(gòu)狀態(tài)之間的關(guān)系。因此，可以利用量子點(diǎn)熒光閃爍行為指示量子點(diǎn)化學(xué)/結(jié)構(gòu)的質(zhì)量。

半導(dǎo)體量子點(diǎn)的熒光閃爍現(xiàn)象本質(zhì)上是隨機(jī)動(dòng)態(tài)的載流子行為在量子效率上的反映。這一行為在引起間歇性的載流子復(fù)合過(guò)程(即熒光)的同時(shí)，可能導(dǎo)致界面上電子或空穴轉(zhuǎn)移(即光化學(xué)反應(yīng))的不連續(xù)性[61]。基于此，本課題組近期利用表面等離激元共振顯微鏡[62]和熒光顯微鏡[63]分別測(cè)量了單個(gè)CdS納米顆粒在連續(xù)光激發(fā)下的催化產(chǎn)氫效率，發(fā)現(xiàn)了顯著的光化學(xué)間歇特性。這些結(jié)果在單顆粒水平上建立了半導(dǎo)體光物理過(guò)程與光化學(xué)反應(yīng)之間的內(nèi)在關(guān)聯(lián)。

4 總結(jié)與展望

本文簡(jiǎn)要介紹了單顆粒熒光閃爍的現(xiàn)象、機(jī)理與應(yīng)用等方面的研究進(jìn)展。熒光閃爍現(xiàn)象具有隨機(jī)性、顯著性、頻繁性等典型特征，且其在熒光納米材料中普遍存在。目前，盡管對(duì)單顆粒熒光閃爍的光物理機(jī)制已有較多認(rèn)識(shí)和理解，但許多細(xì)節(jié)仍有很大爭(zhēng)議。熒光閃爍尚不能被完全消除，只能在一定程度上加以抑制，如何獲得不閃爍的量子點(diǎn)仍是許多科學(xué)家努力的方向。然而，熒光閃爍并非完全有害無(wú)益，它不僅為超分辨熒光成像技術(shù)的發(fā)展提供了原始的啟發(fā)，近年來(lái)更為半導(dǎo)體異質(zhì)結(jié)、光化學(xué)反應(yīng)和分析傳感等領(lǐng)域帶來(lái)了許多新的潛力和機(jī)遇。比如，通過(guò)利用熒光閃爍的相關(guān)動(dòng)力學(xué)規(guī)律作為生物化學(xué)傳感器的檢測(cè)信號(hào)，有望發(fā)展出可用于單細(xì)胞等微納尺度復(fù)雜體系的新型單顆粒傳感方法。相信隨著研究的不斷深入，科研工作者們能夠調(diào)控?zé)晒忾W爍，并利用熒光閃爍特性研究單納米晶更多方面的性質(zhì)和應(yīng)用。