聚集誘導(dǎo)發(fā)光分子在光動力治療中的研究進展

許 敏,龍 資,易小慶*,婁筱叮,夏 帆,2*

(1.中國地質(zhì)大學(xué)(武漢)納米礦物材料及應(yīng)用教育部工程研究中心,材料與化學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430074；2.華中科技大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，湖北 武漢 430074)

光動力療法[1]是目前獲得臨床認可的一種較新穎的微創(chuàng)治療方法，其作用機理通常是利用光敏劑所制備的納米顆粒能選擇性地聚集在腫瘤部位，并通過特定波長的光照射使腫瘤部位的光敏劑活化，將能量傳遞給周圍的氧使其生成具有細胞毒性的活性氧(主要為單線態(tài)氧，ROS)，從而破壞腫瘤組織，達到治療效果。

臨床研究表明，光動力療法[2]適用于腫瘤尤其是早期腫瘤的治療，一些無法進行腫瘤切除手術(shù)患者的生命因此得到延長，其生活質(zhì)量也得到顯著提高。近年來，隨著科學(xué)技術(shù)的進步，光動力療法有望成為治療腫瘤[2-3]的主流手段。而光敏劑在光動力治療中起著至關(guān)重要的作用，其性能的優(yōu)越直接影響治療的效果。目前臨床上應(yīng)用的光敏劑(如卟啉類)[4]存在選擇性差和聚集誘導(dǎo)猝滅(ACQ)等問題，在很大程度上限制了其臨床應(yīng)用。其中，選擇性差導(dǎo)致傳統(tǒng)光敏劑富集在正常細胞組織，從而誘發(fā)一系列副反應(yīng)，如光過敏反應(yīng)，在殺死腫瘤細胞的同時也將正常細胞破壞。此外，大多數(shù)傳統(tǒng)熒光分子在分散狀態(tài)下能夠發(fā)出強熒光，但在高濃度或處于聚集狀態(tài)時，光敏劑的光化學(xué)效率急劇下降。這是由于分子間形成了π-π堆積或熒光分子自吸收等，從而導(dǎo)致熒光降低或猝滅，即ACQ效應(yīng)。這是傳統(tǒng)光敏劑的內(nèi)在特性，較難改善。

2001年，香港科技大學(xué)唐本忠教授[5]領(lǐng)導(dǎo)的研究小組觀察到siloles熒光體系中的“異?！爆F(xiàn)象，該現(xiàn)象與ACQ效應(yīng)相反，此類分子在聚集態(tài)時發(fā)射強熒光，即聚集誘導(dǎo)發(fā)光(AIE)。隨后，眾多國內(nèi)外研究小組對AIE現(xiàn)象的產(chǎn)生機制進行了深入研究，并產(chǎn)生了分子內(nèi)共平面構(gòu)象、分子間非緊密堆積、形成J-聚集體(J-aggregrate formation)以及扭曲的分子間電荷轉(zhuǎn)移等多種解釋。其中最具影響力和說服力的是Tang等[6-7]提出的“分子內(nèi)旋受限(RIM)假說”。自此，AIE現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)為有機發(fā)光分子帶來了一個新的“春天”。國內(nèi)外學(xué)者開始關(guān)注并研究這一反常的熒光現(xiàn)象，同時設(shè)計并合成了眾多具有 AIE 性質(zhì)的分子并將其廣泛應(yīng)用于生物傳感[8-9]、生物成像[10-12]、有機發(fā)光二極管及生物分子檢測[13-15]等領(lǐng)域。

具有AIE特性的分子在使用過程中無需控制濃度，也不會在將其包裹入納米載體后發(fā)生聚集，因此該分子在此狀態(tài)下可發(fā)出更強的熒光。而且，有些AIEgens同時具有光敏效應(yīng)，在光照條件下既能發(fā)光，也能產(chǎn)生活性氧殺死腫瘤細胞。因此，具有AIE特性的光敏劑在實際應(yīng)用中更具優(yōu)勢，具有潛在的醫(yī)學(xué)應(yīng)用價值?；贏IEgens的光動力治療由于對正常組織的低毒性和可忽略的系統(tǒng)效應(yīng)，很大程度上降低了發(fā)病率并具有良好的修復(fù)能力和器官功能保護作用，有望成為一種有價值的治療選擇。本綜述基于AIEgens并探討其在光動力治療中的研究進展，從兩親性高分子聚合物負載 AIEgens，AIEgens偶聯(lián)多肽、靶向小分子以及藥物兩方面探討了其在光動力治療領(lǐng)域中的應(yīng)用，并進一步對其潛在的應(yīng)用價值進行了展望。

1 基于AIEgens的光動力治療的應(yīng)用研究

與其他傳統(tǒng)診斷材料相比，AIEgens由于具有易制備和特異性修飾結(jié)合位點，熒光特性優(yōu)異，生物相容性好以及EPR效應(yīng)等優(yōu)點，極大程度上促進了光動力療法的效率。而成像和治療病變的高度特異性，因可以最大限度地提高治療效果，同時將副作用降至最低而對圖像指導(dǎo)的光動力治療至關(guān)重要。

1.1 兩親性高分子聚合物負載 AIEgens

被動靶向效應(yīng)(EPR效應(yīng))通過腫瘤周圍血管的通透性使大分子和納米材料累積在腫瘤組織，是目前靶標成像和治療中使用最廣泛的驅(qū)動力之一。而AIE光敏劑被納米顆粒載體負載后能夠極大增加其腫瘤的EPR效應(yīng)。此方法能夠增加藥物在腫瘤部位的富集，提高腫瘤治療效果、降低毒副作用。為了增加納米顆粒的親水性，研究者引入一些生物相容性好的高分子，以更好地提高其性能。而聚乙二醇(PEG)是生物相容性良好的親水高分子，可通過物理或化學(xué)修飾在納米顆粒的表面形成一層親水層，以增加納米顆粒在血液中的循環(huán)時間，使其充分到達腫瘤部位。

2017年，Liu等[16]利用具有光敏效應(yīng)的AIE分子(TTD)作為光敏劑(圖1A)，以二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇(DSPE-PEG2000)為載體，并在載體表面修飾環(huán)狀精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)短肽(cRGD)作為細胞表面整合素和納米探針相互作用的識別位點，成功合成了T-TTD量子點。合成的T-TTD納米顆粒的粒徑約為30 nm，最佳激發(fā)和發(fā)射波長為分別502 nm和660 nm，具有優(yōu)異的光學(xué)特性和活性氧產(chǎn)率。該研究組還進行了小鼠體內(nèi)實驗，結(jié)果表明在適當波長光的激發(fā)下，AIE納米顆粒能發(fā)出紅色熒光而顯示腫瘤輪廓。在腫瘤熒光圖像的引導(dǎo)下，繼續(xù)光照會激發(fā)AIE納米顆粒發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生活性氧從而誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，達到治療效果。此外，體內(nèi)和體外實驗均證實該探針具有良好的光毒性和效應(yīng)可控性。

Li 等[17]同樣采用DSPE-PEG負載光敏AIEgens TTD并在表面修飾siVEGF，使AIE納米顆粒具有靶向整合素過表達細胞并遞送siRNA的能力。該納米顆粒主要以光動力治療和RNA干擾治療為目標。該工作將siRNA的AIE納米載體，用于聯(lián)合靶向腫瘤細胞的成像光動力治療和RNA干擾治療，發(fā)現(xiàn)該探針顯示出明亮的熒光，并可在光照射下有效產(chǎn)生活性氧(ROS)。細胞活性研究顯示，siVEGF-TTD 納米顆粒可選擇性且有效地殺死αvβ3整合素過表達的腫瘤細胞，并具有PDT和RNA干擾治療之間的協(xié)同作用。此外，作者通過在DSPE-PEG和siVEGF之間引入谷胱甘肽(GSH)可切割的二硫鍵，從而使納米顆粒表面釋放siVEGF，而內(nèi)化的納米顆?？膳cPDT和siRNA療法聯(lián)合治療并且協(xié)同作用以提高對MDA-MB-231細胞的整體殺傷效率(圖1D)。該研究制備的AIEgens多功能納米顆粒實現(xiàn)了圖像引導(dǎo)光動力治療和RNA干擾所需的功能。

圖1 T-TTD量子點形成的示意圖(A)，TTD的結(jié)構(gòu)(B)，T-TTD引導(dǎo)的光動力治療(C)[16]，DSPE-PEG-NH2與siVEGF的結(jié)合以及cRGD結(jié)合的siVEGF-TTD納米顆粒(cRGD-siVEGF-TTD NPs)的形成(D)[17]Fig.1 Schematic illustration of T-TTD dots formation(A),structure of TTD(B),PDT guided by T-TTD dots(C)[16],illustration of conjugation of DSPE-PEG-NH2 with siVEGF and cRGD conjugated siVEGF-TTD nanoparticles(cRGD-siVEGF-TTD NPs)(D)[17]

另外，對于其他AIEgens(如BTPEAQ、TPETCAQ等)，可同樣采用DSPE-PEG兩親性聚合物的方法對其進行負載。Liu等[18]于2016年報道了一種具有供體-受體-供體結(jié)構(gòu)的AIEgen BTPEAQ，研究發(fā)現(xiàn)該納米顆粒在固態(tài)下顯示明亮的遠/近紅外熒光，而BTPEAQ在水溶液中幾乎不產(chǎn)生單線態(tài)氧(1O2)，也不發(fā)出熒光。經(jīng)DSPE-PEG聚合物負載，并與cRGD肽結(jié)合后，BTPEAQ亮度得到明顯增強，且具有3.9%的熒光量子產(chǎn)率和38%的1O2量子產(chǎn)率，對整合素過表達的MDA-MB-231細胞顯示出高效的光動力治療效果。另一種具有較長波長吸收的近紅外熒光分子AIEgen——TPETCAQ[19](結(jié)構(gòu)如圖2A)，同樣可采用兩親性聚合物DSPE-PEG進行負載。為提高細胞內(nèi)化效率，研究組在TPETCAQ納米顆粒表面接枝了一類細胞膜穿透肽(RKKRRQRRRC)，組裝的TPETCAQ納米顆粒可以染色4T1-luc腫瘤細胞，并基于EPR效應(yīng)聚集在小鼠的腫瘤組織，具有良好的成像效果(圖2C)。此外，4T1-luc腫瘤小鼠的體內(nèi)抗腫瘤實驗顯示，TPETCAQ 納米顆粒能夠顯著減小腫瘤大小，表明光動力治療的療效較高。

圖2 TPETCAQ的合成路線(A),TPETCAQ-1 NPs和TPETCAQ NPs的合成(B)，4T1-luc腫瘤小鼠的熒光成像(C),對小鼠進行瘤內(nèi)注射TPETCAQ NPs或生理鹽水后，4T1-luc腫瘤熒光成像，體現(xiàn)光動力治療的效果(D)[19]Fig.2 Synthetic route to TPETCAQ(A); synthesis of TPETCAQ-1 NPs and TPETCAQ NPs(B); fluorescence imaging of 4T1-luc tumor bearing mice(C); time-dependent bioluminescent 4T1-luc tumor imaging of mice after intratumoral administration of TPETCAQ NPs or saline with light irradiation(D)[19]

腫瘤細胞表面特異性表達的抗原或受體很多，如葉酸受體(FR)是一種非酶促蛋白，在許多類型的腫瘤細胞中過表達;葉酸(FA)與FR的結(jié)合親和力很高，已被用于FR靶向載藥?；诖耍琓ang等[20]以腫瘤細胞的線粒體為靶向，設(shè)計了一種生物探針FA-AIE-TPP,利用葉酸和三苯基膦分別作為腫瘤細胞和線粒體的靶向功能基團，修飾具有紅色熒光的AIEgen(DPBA量子點)，采用PEG進行負載，水合粒徑為34 nm。該雙靶向性功能基團能顯示出更低的細胞半抑制濃度值(10 μg/ mL)。此外，線粒體直接產(chǎn)生的活性氧可使線粒體膜迅速去極化，誘導(dǎo)細胞凋亡并有效影響腫瘤細胞遷移，從而進一步提高其抗腫瘤效果。

基于AIEgens的熒光納米顆粒因具有良好的光動力效應(yīng)而受到廣泛關(guān)注。同時，關(guān)于如何控制和優(yōu)化其熒光和ROS生成能力也引起了人們的關(guān)注。Ding等[21]發(fā)現(xiàn)加強顆粒內(nèi)封閉的微環(huán)境可以設(shè)計出具有高度放大熒光和ROS產(chǎn)生的優(yōu)異AIE量子點，能夠很好地改善體內(nèi)癌癥光學(xué)治療學(xué)。該研究組自主合成了一種新型近紅外發(fā)光分子AIEgen——TPP-TPA，通過采用不同的聚合物DSPE-PEG或Cor-PEG進行負載，得到具有不同顆粒內(nèi)剛性微環(huán)境的DSPE-AIE點或Cor-AIE量子點。研究發(fā)現(xiàn)，與DSPE-AIE量子點相比，Cor-AIE量子點有4.0倍的熒光量子產(chǎn)率和5.4倍增強的ROS產(chǎn)率。核磁共振測定結(jié)果顯示，內(nèi)核中的微環(huán)境限制了包封的TPP-TPA的分子內(nèi)旋轉(zhuǎn)，并高度抑制了其非輻射衰變，從而導(dǎo)致激發(fā)態(tài)同時也為熒光通道和系間竄躍過程提供了能量，該結(jié)果與理論計算的結(jié)果一致(圖3)。這種強的近紅外發(fā)光和ROS產(chǎn)生，促進了近紅外圖像引導(dǎo)的癌癥手術(shù)和帶有腹膜癌病小鼠模型的光療效果?？傊?，這是一種用于制備增強熒光和ROS生成能力的AIEgens 探針的獨特方法。

圖3 納米沉淀法制備Cor-AIE量子點和DSPE-AIE量子點(A)；顯示柔性(DSPE-AIE量子點)(B)和剛性(Cor-AIE量子點)矩陣中非輻射性、輻射性的ISC過程的熒光雅布倫斯基圖(C)[21]Fig.3 Scheme for the preparation of Cor-AIE dots and DSPE-AIE dots using nanoprecipitation method(A);Jablonski diagram showing the nonradiative,radiative crossing(ISC)processes for AIEgens in flexible(DSPE-AIE dots)(B)and rigid(Cor-AIE dots)matrixes(C)[21]

與以上單光子激發(fā)的光動力治療方法不同，雙光子激發(fā)的光動力治療方法可對空間選擇性和高穿透深度的治療體積進行精確的3D操作，能夠克服生物組織中熒光穿透深度低的問題。受益于高穿透深度和空間選擇性，該法可實現(xiàn)對較深腫瘤和微小病理區(qū)域的治療，而對周圍正常組織的光損傷最少。 2017年，Liu[22]和Qian[23]等報道了兩個基于AIEgens的雙光子光動力治療診療一體化體系。通過簡單的方法制備細胞膜穿透肽修飾的AIE量子點(T-TPEDC量子點,圖4A)[22]，其雙光子吸收(TPA)橫截面在850 nm處為3 500 GM(圖4B)。為評估T-TPEDC量子點的TP-PDT功效，通過Calcein-AM/碘化丙錠(PI)雙染色評估了材料對細胞的影響。結(jié)果表明在黑暗條件下T-TPEDC量子點具有良好的生物相容性和可忽略的細胞毒性。然而，隨著掃描區(qū)域中掃描數(shù)量的增加，PI陽性壞死細胞群體普遍上升(圖4C～E)。而且，TPEDC量子點還提供了特定血管的選擇性體內(nèi)閉合，其中深度為200 μm的深直徑動脈可以成功關(guān)閉。研究發(fā)現(xiàn)雙光子光照射使掃描區(qū)域表現(xiàn)出非常弱的熒光，而在整個照射期間周圍血管的熒光強度恒定(圖4F、G)，表明TP在體內(nèi)實驗中對三維空間具有高選擇性以及良好的ROS產(chǎn)率[22]。以上這些結(jié)果表明，AIE分子對于雙光子光動力療法在治療腫瘤疾病和精確殺傷腫瘤細胞方面具有巨大的潛力。

化學(xué)發(fā)光是一種在室溫下將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為光能的化學(xué)現(xiàn)象，其反應(yīng)體系多以草酸酯、過氧化氫以及熒光染料為主要組成部分，自發(fā)光波長通常由所采用的熒光染料性質(zhì)決定。由于可以受過氧化氫激發(fā)產(chǎn)生自發(fā)熒光，而實體瘤內(nèi)H2O2的濃度通常高于正常組織，這種發(fā)光體系逐漸引起疾病診斷領(lǐng)域研究人員的極大關(guān)注。Liu等[24]設(shè)計了一種新穎的基于AIE光敏劑的化學(xué)發(fā)光納米材料，并首次實現(xiàn)了動物體內(nèi)腫瘤的自發(fā)光成像和藥物協(xié)同治療。該研究發(fā)現(xiàn)，此光敏劑受到化學(xué)能激發(fā)同樣可以產(chǎn)生ROS，殺傷腫瘤細胞。因此，合成了一種具有聚集誘導(dǎo)發(fā)光性質(zhì)的化學(xué)發(fā)光納米顆粒(C-TBD)。該納米顆粒由AIE光敏劑(TBD)、化學(xué)染料分子(CPPO)、F127聚合物以及豆油組成，不但可克服自發(fā)光納米顆粒中熒光染料ACQ的缺點，而且可通過化學(xué)能(過氧化氫)激發(fā)產(chǎn)生ROS及近紅外自發(fā)熒光。同時，作者通過尾靜脈注射將這種納米顆粒注入實驗動物體內(nèi)。結(jié)果表明C-TBD納米顆粒自發(fā)光成像打破了傳統(tǒng)熒光腫瘤成像組織深度的限制，能夠精確地將腹腔轉(zhuǎn)移微小腫瘤通過活體成像顯影出來。可以預(yù)見，這種基于AIE分子的自發(fā)光納米材料可為臨床上的腫瘤精確定位、抗腫瘤治療提供一種強有效的工具，同時也為疾病診斷示蹤材料的設(shè)計提供了新思路。

圖4 T-TPEDC的制備過程(A)；用T-TPEDC孵育的HeLa細胞，用不同波長的雙光子掃描的吸收橫截面(B)；30次掃描(C)；90次掃描(D)；120次掃描(E)；用T-TPEDC孵育后雙光子激發(fā)得到預(yù)照射和輻照后小鼠腦血管的圖像(F，G)[22]Fig.4 The preparation of T-TPEDC dots(A); two-photon absorption cross section of T-TPEDC dots at different wavelengths;HeLa cells incubated with T-TPEDC dots were irradiated for different two-photon scans(B);30 scans(C),90 scans(D),and 120scans(E); pre-irradiation(F)and post-irradiation(G)images of the brain blood vessels of mouse treated with T-TPEDC dots and two-photon excitation [22]

Tang等[25]于2018年首次報道了通過兩親性聚合物負載DTE-TPECM，形成一種將光動力與光聲相結(jié)合的功能可轉(zhuǎn)換的納米顆粒。此納米顆粒通過外部光觸發(fā)，光敏分子從用于光聲成像的閉環(huán)狀態(tài)變?yōu)橛糜跓晒夂凸鈩恿W(xué)效應(yīng)的開環(huán)狀態(tài)(圖5)。通過光聲成像和光動力治療的聯(lián)合，高效率切除了腫瘤。這一涉及癌癥診斷的光驅(qū)動可切換探針，為探索一種基于AIEgens的高效率精確醫(yī)學(xué)治療途徑提供了一種新思路。表1對以上兩親性高分子聚合物負載 AIEgens 進行了總結(jié)。

表1 兩親性高分子聚合物負載 AIEgens 總結(jié)Table 1 Summary of AIEgens in amphiphilic polymer matrix

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1.2 AIEgens偶聯(lián)多肽、靶向小分子以及藥物

蛋白質(zhì)是生物體中不可或缺的生物大分子，其異常表達通常與疾病有關(guān)。一系列蛋白包括組織蛋白酶B、MMP-14、NQO1、DT-心肌炎、半胱天冬酶-3和TfR等在腫瘤細胞中會過表達，從而可作為響應(yīng)性的生物標志物用于癌癥治療的監(jiān)測[26]。通過設(shè)計使特定生物探針偶聯(lián)多肽[27]等，有效地激活酶，確保探針能夠?qū)崟r、有針對性地監(jiān)測成像腫瘤細胞凋亡，對腫瘤診療一體化非常有必要。2014年，Ding等設(shè)計并合成了半胱天冬酶特異性Asp-Glu-Val-Asp(DEVD)和環(huán)狀A(yù)rg-Gly-Asp(cRGD)兩種不同的親水肽修飾于典型AIEgen的四苯基硅(T光敏劑)單元上[28]，研究發(fā)現(xiàn)，不對稱探針在水溶液中幾乎不發(fā)光，而在半胱天冬酶-3存在下明顯發(fā)熒光。由于半胱天冬酶-3對DEVD部分的切割，從而釋放T光敏劑-cRGD殘基，殘基的聚集限制了T光敏劑苯環(huán)的分子內(nèi)旋轉(zhuǎn)并填充了輻射衰變通道(圖6A)。該探針通過cRGD和整合素αvβ3受體之間的有效結(jié)合，顯示出對U87MG人成膠質(zhì)腫瘤細胞的特異性靶向能力，并能以特定的方式實時監(jiān)測和成像腫瘤細胞凋亡。

組織蛋白酶B是一種在多類型腫瘤細胞中過表達的溶酶體蛋白酶，能夠特異性地切割-Gly-Phe-Leu-Gly-(GFLG)肽序列。Liu等[29]充分利用組織蛋白酶B和αvβ3整合素的特性，設(shè)計并合成了一種雙靶向酶響應(yīng)性的生物探針(圖6B)。該探針由用于成像和光動力治療的AIEgen TPECM、組織蛋白酶B響應(yīng)性GFLG肽、cRGD組和親水單位組成。該生物探針具有的良好親水性使其能夠很好地溶于水溶液中，在水性環(huán)境中保持熒光“關(guān)閉”狀態(tài)和少量ROS生成。研究發(fā)現(xiàn)，該雙靶向功能探針可在腫瘤細胞中有選擇地積累，而GFLG的原位切割引起TPECM的釋放、聚集，從而發(fā)出熒光，提供高實時腫瘤細胞成像信噪比。此外，在癌癥細胞中聚集的TPECM同時產(chǎn)生ROS，為有選擇性的高效光動力治療提供了一種更精確的手段。

三肽谷胱甘肽(GSH)同樣是進行腫瘤細胞診斷成像的重要推動力。GSH是多種細胞過程中的重要生物分子，包括細胞代謝、分化以及平衡許多細胞解毒功能和抗氧化作用等。由于GSH對二硫鍵有響應(yīng)性，GSH在許多腫瘤細胞中的量超過正常細胞[30]，可用二硫鍵作為AIEgens和腫瘤細胞靶向劑之間的連接體。因此，若設(shè)計出一種新型生物探針[31]，其二硫鍵可被腫瘤細胞內(nèi)GSH裂解，同時釋放的AIEgens聚集并成像腫瘤細胞，從而實現(xiàn)對光敏劑活化的實時監(jiān)測，并顯著促進ROS的產(chǎn)生，可以實現(xiàn)有選擇性的腫瘤細胞的光動力治療?；诖?Liu課題組[32]報道了一種TPETF-NQ-cRGD生物探針。該探針由具有AIE特征的紅色發(fā)光生色團光敏劑(TPETF)、靶向腫瘤細胞的cRGD三肽和2,4-二硝基苯磺酰氯(NQ)熒光猝滅劑組成(圖6C)。研究發(fā)現(xiàn)，該探針在生理pH范圍內(nèi)不發(fā)光，而在過表達的腫瘤細胞中用GSH原位處理后，由于NQ猝滅劑的斷裂，探針發(fā)出明亮的熒光且保持恒定。此外，作者發(fā)現(xiàn)用功率密度為0.25 W·cm-2白光照射3 min時，僅用32 μmol/L的探針即可完全消除腫瘤細胞，通過使用雙靶向生物探針實現(xiàn)了對腫瘤細胞的識別和消除。

圖6 Ac-DEVD-TPS-cRGD的結(jié)構(gòu)及其靶向腫瘤細胞成像凋亡的原理(A)[27]；TPECM-2GFLGD3-cRGD的結(jié)構(gòu)及探針對組織蛋白酶B響應(yīng)性的示意圖(B)[29]；TPETF-NQ-cRGD的結(jié)構(gòu)及其在GSH作用下發(fā)出熒光的示意圖(C)[32]； TPETP-AA-Rho-cRGD的結(jié)構(gòu)及通過ROS激活探針的示意圖(D)[34]Fig.6 The structure of Ac-DEVD-TPS-cRGD and the principle of apoptosis imaging in target cancer cell based on the probe(A)[27]; the structure of TPECM-2GFLGD3-cRGD and schematic illustration of probe activation by Cathepsin B(B)[29]; the structure of TPETF-NQ-cRGD and schematic illustration of probe activation by GSH(C)[32]; the structure of TPETP-AA-Rho-cRGD and schematic illustration of probe activation by ROS(D)[34]

一般來講，ROS過量可能通過蛋白質(zhì)功能的失調(diào)、細胞大分子的氧化修飾來觸發(fā)細胞凋亡或死亡[33]。實際上，正常生理狀態(tài)下低水平的ROS對于各種生物過程(包括細胞穩(wěn)態(tài)、增殖、信號傳導(dǎo)和衰老)至關(guān)重要。而由于線粒體功能障礙、致癌刺激和代謝活性增加等因素，腫瘤細胞的ROS水平高于正常細胞。ROS水平的差異有利于腫瘤靶向成像和治療的發(fā)展。例如，Liu等[34]于2016年構(gòu)建了含有紅色熒光的AIEgen，1O2可切割接頭AA，綠色熒光的1O2響應(yīng)性rhodol片段和cRGD的超分子化合物(命名為TPETP-AA-Rho-cRGD)(圖6D)。一方面，該研究組利用TPETP化合物在水溶液中發(fā)出的紅色熒光，實現(xiàn)了其自我跟蹤。另一方面，在cRGD的協(xié)助下，TPETP-AA-Rho-cRGD可特異性靶向αvβ3過表達的腫瘤細胞。此外，由TPETP在光照射下有效產(chǎn)生的ROS使得DA-MB-231細胞活力迅速下降，其半抑制濃度(IC50)為8.3 μmol/L。而黑暗條件下探針的IC50為219.1 μmol/L，表明其光動力治療效果顯著。作者通過利用這一超分子平臺，實現(xiàn)了在光動力治療腫瘤細胞期間活性氧的實時原位監(jiān)測[34]。

在聯(lián)合治療的趨勢下，光動力治療和化療聯(lián)合也引起關(guān)注，兩者聯(lián)合可達到滿意的抗癌療效，提高治療效率并使副作用最小化。而運用AIEgens和化療藥物的聯(lián)合療法具有巨大潛力，AIEgens能夠?qū)χ委燇w系起到示蹤的作用。Yuan等[35]通過將AIE活性光敏劑和鉑前藥與cRGD結(jié)合制備了TPECB-Pt-D5-cRGD探針，用于實時監(jiān)測腫瘤細胞藥物釋放以及光動力治療和化療相結(jié)合的治療。此探針在水性介質(zhì)中幾乎不發(fā)光，而當其進入腫瘤細胞后，被腫瘤細胞內(nèi)高濃度的谷胱甘肽還原后而被點亮，且該探針能夠選擇性染色αvβ3整合素過表達的腫瘤細胞。作者通過使用MTT評估TPECB-PtD5-cRGD對不同細胞的抗增殖性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)MDA-MB-231細胞耐順鉑，IC50值為33.4 μmol/L，光照不影響療效。這種聯(lián)合治療法顯示了基于AIEgens材料在癌癥治療領(lǐng)域的巨大潛力，并為降低化學(xué)治療抗性開辟了新途徑。

其他可以治療癌癥的藥物也吸引著人們的關(guān)注。青蒿素(Artemisinin，ART)是從一年生蒿(Artemisia annua)中分離出的一種天然產(chǎn)物，被公認為抗瘧藥。ART衍生物具有抗癌特性，可抑制細胞增殖，血管生成，增加細胞氧化應(yīng)激性和誘導(dǎo)細胞凋亡，但它們只對某些腫瘤細胞顯示低而有限的損傷。最近，一項研究證明血紅素能夠響應(yīng)性結(jié)合ART靶向多種蛋白質(zhì)以殺死寄生蟲和腫瘤細胞[36]，并將ART遞送至腫瘤細胞線粒體以大大提高療效。然而，由于ART本身不具有發(fā)光性，設(shè)計具有線粒體靶向功能的熒光ART類似物，可以實時監(jiān)測而不影響其活性。因此，Zhang等[37]設(shè)計了一種線粒體靶向熒光探針(TPETH-Mito-1ART)，它可將青蒿素(ART)和AIE光敏劑共同傳遞至線粒體以進行圖像化化療和光動力聯(lián)合治療。該探針含有1個AIEgen核心——TPETH，兩個線粒體靶向臂作為熒光響應(yīng)性部分和光敏劑，在1個臂上具有ART，可以選擇性內(nèi)化到腫瘤細胞中，并可顯著地在線粒體中積累和發(fā)出熒光。線粒體中產(chǎn)生的新鮮血紅素迅速激活A(yù)RT，生成的活性氧直接促進了光動力治療。ART和光動力治療的結(jié)合使得療效顯著改善，并具有協(xié)同作用，可使線粒體膜迅速去極化，并大大減少癌癥轉(zhuǎn)移。這種共同傳遞方法在亞細胞器靶向和圖像引導(dǎo)聯(lián)合治療方面顯示出巨大的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用潛力。

另外，紫杉醇被認為是使用廣泛的抗腫瘤藥物之一，而輔助劑的合理使用可以極大提高治療效果，從而成為一種新穎的聯(lián)合治療方法。Ding等[38]于2017年制備了一種可實現(xiàn)診療一體化的熒光探針TPE-Py-FFGYSA，該探針不僅是一種輔助劑，可以增強紫杉醇的抗腫瘤功效，而且還可以瞄準靶標，將其轉(zhuǎn)化為EphA2蛋白。由于EphA2是一種跨膜受體酪氨酸激酶，在許多類型的癌癥中過度表達，而肽序列YSAYPDSVPMMS(YSA)可以選擇性靶向EphA2，TPE-Py作為AIE性質(zhì)的熒光分子，在聚集狀態(tài)下發(fā)出明亮熒光且能有效產(chǎn)生ROS，探針在FFG三肽序列誘導(dǎo)下，在疾病部位實現(xiàn)有序自組裝，而在同一化療藥物紫杉醇的聯(lián)合使用下能夠極大地放大紫杉醇的抗癌效果，將紫杉醇殺傷腫瘤細胞的半致死濃度從75.9 nmol/L降至7.8 nmol/L，顯示出極高的臨床應(yīng)用價值。

另一方面，活性氧因壽命短和傷害范圍小使光動力治療對周圍健康組織的損害最小化，但也需要精確的光敏劑定位以用于有效治療。同時，用于腫瘤靶向、成像和治療的亞細胞器特異性材料在腫瘤治療中吸引了眾多研究者的興趣。其中，線粒體靶向系統(tǒng)的設(shè)計對于提高光動力療法功效最具意義。Gao等[39]通過將具有遠紅外(FR)熒光的AIE分子與線粒體靶向功能基團TPP相結(jié)合，設(shè)計了聚集誘導(dǎo)發(fā)射-活性熒光探針(AIE-FR-TPP)用于線粒體成像和光動力治療。該AIE-FR-TPP探針工作濃度低，染色時間短，生物相容性好，能夠?qū)毎€粒體進行選擇性的點亮，同時產(chǎn)生ROS，使細胞凋亡。作者通過AIE效應(yīng)監(jiān)測線粒體的形態(tài)變化，并首次利用其特性實現(xiàn)了活斑馬魚胚胎中細胞器水平的實時圖像引導(dǎo)光動力治療。隨后，Yu等[40]設(shè)計了一種新的線粒體靶向光敏劑探針DPA-SCP,其光敏部分采用了AIEgen，修飾吡啶鹽為靶向線粒體。DPA-SCP在水相中熒光信號很弱，而當靶向到腫瘤細胞的線粒體之后能夠被點亮。該探針在白光照射下能有效產(chǎn)生ROS，在線粒體中形成氧化環(huán)境，從而有效增強對腫瘤細胞的治療效果。2017年，Chao等[41]將AIE分子與無機納米顆粒結(jié)合，首次報道了具有雙光子性能的3種線粒體靶向的AIE-活性銥(Ⅲ)配合物，此納米顆粒能夠有效富集在線粒體上，并在光照條件下產(chǎn)生對細胞有害的ROS，進而達到治療效果。

研究結(jié)果證實腫瘤細胞的線粒體膜電位高于正常細胞，這種差異可用于腫瘤細胞鑒別和選擇性治療。一些帶正電荷的AIEgens被制備，如AIE-mito-TPP[42]和TPE-IQ-2O[43]等，并用作選擇性染色腫瘤細胞線粒體的顯像劑。Tang等[43]制備了AIE活性的TPE-IQ-2O，其由吡啶鎓和TPE單元組成且?guī)д?。由于線粒體膜電位的差異，雖然TPE-IQ-2O在培養(yǎng)基中不發(fā)光，但能選擇性地在腫瘤細胞中累積并點亮腫瘤細胞中的線粒體。此外，TPE-IQ-2O還具有較高的ROS生成能力，是一個有效的腫瘤診斷成像和治療體系。

AIEgens探針不僅可以靶向線粒體，還可通過調(diào)整分子結(jié)構(gòu)和取代基，制備出其他特異性靶向的AIEgens。如Wang等[44]利用一步法制備了一系列紅/近紅外AIE分子，這些AIE分子不僅能在可見光照射下有效地產(chǎn)生活性氧，而且對脂滴(LD)有良好的靶向性，具有光穩(wěn)定性高、亮度高和工作濃度低等優(yōu)點，優(yōu)于商業(yè)上可獲得的脂滴特異性染料。2016年，Zhang等[45]報道了一種將具有AIE特征的紅光熒光光敏劑與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體靶向肽T7結(jié)合的新型探針TPETH-2T7，其可定位于細胞膜上。由于轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)是一種跨膜糖蛋白[46]，存在于正常細胞和腫瘤細胞中，其表達水平隨著細胞增殖速度的增加而增加，因此其在腫瘤細胞中的數(shù)量遠高于正常細胞。游離的TPETH-2T7幾乎不發(fā)光，但在與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體特異性結(jié)合后，由于限制了TPETH的分子內(nèi)運動，實時發(fā)出紅色熒光。該探針可以選擇性地點亮TfR過表達的腫瘤細胞同時實時跟蹤TfR。通過實時成像研究發(fā)現(xiàn)，該探針可在30 min內(nèi)將MDA-MB-231細胞的細胞膜染色，并在短時間光照射下，可觀察到細胞形態(tài)變化和膜崩解，細胞膜崩解可以快速殺死MDA-MB-231細胞。TPETH的高ROS產(chǎn)生效率使得光照射對MDA-MB-231腫瘤細胞的光動力治療取得顯著效果。

此外，Liu等[47]報道了一種新穎的水溶性具有紅色熒光的AIEgen生物響應(yīng)性探針，可與細胞膜上的聚糖反應(yīng)。該探針為水溶性的非熒光探針，但與腫瘤細胞表面上的疊氮官能化聚糖發(fā)生點擊反應(yīng)后，AIEgen的分子運動受到限制，填充了輻射衰變通道，從而發(fā)出熒光。而且，AIEgen可在可見光照射下產(chǎn)生ROS，證明其作為成像和光治療劑的雙重作用。表2對以上AIEgens偶聯(lián)多肽、靶向小分子以及藥物進行了總結(jié)。

表2 AIEgens偶聯(lián)多肽、靶向小分子以及藥物匯總Table 2 Summary of AIEgens conjugated with polypeptide,target or drug

(續(xù)表2)

Cell lineTargetBioprobesApplicationsAbsorption/emission(nm)ReferencePC-3YSATPE-Py-FFGYSA肽序列YSA選擇性靶向EphA2,TPE-Py在聚集狀態(tài)下發(fā)出明亮熒光且有效產(chǎn)生ROS,FFG三肽序列誘導(dǎo)探針在疾病部位從而實現(xiàn)有序自組裝,可增強紫杉醇的抗腫瘤功效405/595[38]A549TPPAIE-FR-TPP通過AIE效應(yīng)監(jiān)測線粒體的形態(tài)變化,并首次利用其特性實現(xiàn)了活斑馬魚胚胎中細胞器水平的實時圖像引導(dǎo)光動力治療-/660[39]A549吡啶鹽DPA-SCP修飾吡啶鹽為線粒體靶向,靶向到腫瘤細胞的線粒體后被點亮460/620[40]HeLa,COS-7正電TPE-IQ-2O由于線粒體膜電位的差異,TPE-IQ-2O能夠選擇性地在腫瘤細胞中累積并點亮腫瘤細胞中的線粒體430/620[43]MDA-MB-231,NIH 3T3T7TPETH-2T7選擇性地點亮TfR過表達的腫瘤細胞同時實時跟蹤TfR,可實時監(jiān)測細胞形態(tài)變化和膜崩解360,430/635[45]MDA-MB-231,HeLa-TPETSAl水溶性AIEgen生物響應(yīng)性探針,與腫瘤細胞表面上的疊氮官能化聚糖發(fā)生點擊反應(yīng)后發(fā)出熒光,成像和光治療劑的雙重作用480/650[47]

-：no data

2 結(jié)論與展望

本文總結(jié)了近5年有關(guān)兩親性高分子聚合物負載 AIEgens，AIEgens偶聯(lián)多肽、靶向小分子以及藥物等用于光動力治療的研究進展。研究者們根據(jù)實際應(yīng)用對AIEgens的屬性和功能進行修飾、調(diào)整，以彰顯出其與傳統(tǒng)熒光團或光敏劑相比具有的顯著優(yōu)勢。隨著AIE機制的不斷發(fā)展，人們設(shè)計出不同方法、不同策略制備和修飾AIEgens以應(yīng)用于光動力治療。由于AIEgens具有熒光特性優(yōu)異、納米顆粒負載量高、生物相容性好及光動力治療功能高效等優(yōu)點，在生物過程監(jiān)測和圖像引導(dǎo)手術(shù)中具有巨大的應(yīng)用潛力。

盡管基于AIEgens的光動力治療取得了顯著的進展，但仍然存在許多未解決的問題。具有AIE特征的光敏劑有自身的局限性，由于其特有的轉(zhuǎn)子結(jié)構(gòu)和有限的共軛長度，大多數(shù)AIE PS具有390～550 nm的短激發(fā)波長，這嚴重限制了其組織穿透深度，因此不利于體內(nèi)應(yīng)用。從分子設(shè)計開始，引入強的供體-受體對能夠誘導(dǎo)長波吸收，解決激發(fā)波長短的問題。并且，雙光子或多光子激發(fā)的PDT也能提供更深層的穿透深度和更局部的圖像引導(dǎo)治療。實際上，不僅AIE光敏劑的性能會決定PDT效應(yīng)，光穿透能力、氧濃度和微環(huán)境(例如GSH濃度)也在PDT中起重要作用。研究者已采用幾種優(yōu)秀的方法來克服AIE PS的有限穿透深度、氧濃度和微環(huán)境因素[21-24]，但目前AIE PSs與這些方法的整合尚未臨床應(yīng)用。此外，為推動AIE PS進行轉(zhuǎn)化研究，需對其體內(nèi)毒性、生物分布和機體清除等進行系統(tǒng)評估，相關(guān)工作有待于進一步深入。目前AIE PSs在PDT中的應(yīng)用僅限于動物和臨床前研究。

總之，基于AIEgens的光動力治療是一個快速發(fā)展的全新領(lǐng)域，也面臨著許多挑戰(zhàn)。例如，一方面，對AIEgens的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)關(guān)系等仍需進行詳細的推理研究，以設(shè)計出具有期望功能的分子；另一方面，擴大多模式診斷成像和聯(lián)合治療的多樣性仍處于“嬰兒期”；此外，未來AIEgens有望用于多光子成像和治療。雖然目前光動力治療僅在動物上實現(xiàn)，但隨著這一領(lǐng)域的快速發(fā)展，基于AIEgens的光動力治療必會在臨床應(yīng)用中實現(xiàn)，同時也將激發(fā)人們對生命科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究興趣。