熒光金屬納米簇的合成及其在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用研究進(jìn)展

孫歡歡，卿太平，步鴻昌，何曉曉*，王柯敏,2*

(1.湖南大學(xué) 生物學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410082；2.湖南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，湖南省生物納米與分子工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410082)

熒光金屬納米簇(Metal nanoclusters)是一類由幾個(gè)至數(shù)百個(gè)金屬原子堆積而成的納米材料，處于單個(gè)金屬原子和較大的金屬納米顆粒之間的過渡狀態(tài)[1]。金屬納米簇的尺寸接近費(fèi)米波長(zhǎng)(< 2 nm)，與較大的納米顆粒相比，具有更為獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)，因而表現(xiàn)出優(yōu)異的光學(xué)特性，如熒光發(fā)射可調(diào)、斯托克斯位移大、熒光穩(wěn)定性高、量子產(chǎn)率較高等[2-3]。熒光金屬納米簇的合成一般采用模板法，以生物分子(蛋白質(zhì)、DNA、氨基酸和多肽等)作為合成的配體，金屬離子在還原劑的作用下被還原成原子團(tuán)簇。與傳統(tǒng)的熒光染料和量子點(diǎn)相比，熒光金屬納米簇的毒性大大降低，生物相容性顯著提高。因此，它們作為一種新型的納米熒光探針，在生化分析、環(huán)境檢測(cè)、醫(yī)學(xué)成像和腫瘤治療等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[4-8]。

目前，有關(guān)金屬納米簇的綜述已有不少報(bào)道[9-13]，但大多側(cè)重于金屬納米簇的生化應(yīng)用研究進(jìn)展，或僅圍繞一種金屬納米簇展開論述。本文將對(duì)各種金屬納米簇的合成與性質(zhì)進(jìn)行概述，進(jìn)而對(duì)其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域包括生物傳感、生物成像及腫瘤治療中的應(yīng)用進(jìn)行闡述，并對(duì)金屬納米簇在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域面臨的挑戰(zhàn)和發(fā)展機(jī)遇進(jìn)行了探討。

1 熒光金屬納米簇的合成

熒光金屬納米簇的合成根據(jù)路徑可分為“自下而上”和“自上而下”兩種方法，如圖1所示[14]。前者使金屬離子(Mn+)在還原劑存在下被還原為零價(jià)金屬(M)，零價(jià)金屬再在配體分子上成核生長(zhǎng)為納米簇。目前常用的配體分子有脫氧核酸(DNA)、多肽、蛋白質(zhì)、巰基小分子或聚合物等?！白陨隙隆狈ㄊ峭ㄟ^配體對(duì)大尺寸納米粒子的刻蝕作用進(jìn)而獲得小尺寸的納米簇，按還原方法不同又可分為化學(xué)還原法、光還原法、超聲還原法、微波還原法和電化學(xué)還原法等。為獲得性質(zhì)優(yōu)良的金屬納米簇，上述方法通常需考慮以下因素：(1)配體與金屬原子間較強(qiáng)的相互作用力；(2)適宜的還原條件；(3)足夠的老化時(shí)間。以下針對(duì)不同金屬納米簇的特點(diǎn)，分別對(duì)其常用的合成方法進(jìn)行了介紹。

圖1 金屬納米簇的不同制備方法[14]
Fig.1 Various routes for the synthesis of metal nanoclusters[14]

圖2 BSA-Au NCs的“綠色”合成方法[19]Fig.2 Green synthesis of BSA-Au NCs [19]

1.1 熒光金納米簇的合成

熒光金納米簇(Au NCs)是金屬納米簇中穩(wěn)定性最好的納米材料之一，相關(guān)研究開展最早。通常利用HAuCl4作為金屬前驅(qū)體，由于Au原子與S原子之間存在較強(qiáng)的共價(jià)結(jié)合力，因此一般選擇含巰基的生物分子作為配體，在適當(dāng)?shù)倪€原條件下一步合成具有熒光發(fā)射的Au NCs[15-17]。該方法一方面利于簇的形成，獲得光學(xué)性質(zhì)優(yōu)良的Au NCs；另一方面可降低材料的毒性，使Au NCs具有良好的生物學(xué)應(yīng)用價(jià)值。Negishi等[18]利用谷胱甘肽(GSH)作為配體，在NaBH4還原下合成了含不同Au原子個(gè)數(shù)的Au NCs，結(jié)果表明其光學(xué)性質(zhì)普遍具有配體濃度和金核原子個(gè)數(shù)依賴性；Xie等[19]利用牛血清蛋白(BSA)為配體和還原劑發(fā)展了一種“綠色”方法制備了量子產(chǎn)率為6%的Au NCs，它在一定激發(fā)光照射下發(fā)出紅色熒光(圖2)。采用相似的化學(xué)還原方法，以胃蛋白酶[20]、乳鐵蛋白[21]、胰蛋白酶[22]、溶菌酶[23]和木瓜蛋白酶[24]等蛋白質(zhì)為配體的Au NCs也相繼被合成。另外，還可通過“自上而下”法即利用含巰基的配體對(duì)尺寸較大的金納米顆粒(Au NPs)進(jìn)行刻蝕作用合成Au NCs?？涛g途徑分為配體誘導(dǎo)的刻蝕和對(duì)金屬核的直接刻蝕兩種途徑。前者是利用過量的配體對(duì)Au NPs表面的Au原子進(jìn)行“剝離”，形成配體-Au+復(fù)合物，復(fù)合物之間再通過親金作用(Au+- Au+)相互結(jié)合形成Au NCs[25]；后者是利用過量配體對(duì)Au NPs的金核直接進(jìn)行刻蝕，使其粒徑逐漸減少，形成具有熒光發(fā)射的Au NCs[26]。

除了上述以Au—S的共價(jià)結(jié)合作用制備Au NCs外，樹枝狀的大分子內(nèi)部空腔中豐富的表面官能團(tuán)也可以絡(luò)合Au3+形成復(fù)合物用于Au NCs的制備。利用聚酰胺-胺型樹枝狀高分子(PAMAM)為配體，Bao等[27]發(fā)展了兩種制備Au NCs的方法：一種是在生理溫度下緩慢合成具有綠色熒光發(fā)射的Au NCs；另一種是以抗壞血酸為還原劑，通過緩慢還原Au3+合成具有多種熒光發(fā)射的Au NCs。為縮短合成時(shí)間，Jao等[28]發(fā)展了微波還原法用于PAMAM-Au NCs的快速合成，合成時(shí)間由4 d縮短至0.5 h；Liu等[29]利用超聲還原法制備了近紅外發(fā)射的BSA-Au NCs；Zhang等[30]利用光還原法制備了以巰基化的聚合物為配體的Au NCs。這3種物理還原方法均不需其他還原劑的參與，制備過程簡(jiǎn)易并提高了量子產(chǎn)率。研究表明，Au還能與含氮堿基腺嘌呤和胞嘧啶相互作用而結(jié)合[31]，因此DNA也能作為配體合成Au NCs[32-33]。

1.2 熒光銀納米簇的合成

與金納米簇類似，Ag原子與S原子之間也存在較強(qiáng)的共價(jià)結(jié)合力。因此，含巰基的化合物亦可作為配體合成銀納米簇(Ag NCs)。Adhikari等[34]以二氫硫辛酸(DPA)為配體，利用NaBH4還原Ag+，合成了具有近紅外熒光發(fā)射的Ag NCs，該Ag NCs的斯托克斯位移大于200 nm，具有應(yīng)用于細(xì)胞成像的潛力。在此基礎(chǔ)上，Yuan等[35]發(fā)展了以巰基化合物為配體的反向轉(zhuǎn)移法，即在水相中經(jīng)化學(xué)還原后，再將體系轉(zhuǎn)移至乙醇中進(jìn)行緩慢刻蝕，所合成的Ag NCs具有更好的分散性，超高的穩(wěn)定性和超小的尺寸。Zhu等[36]用該方法合成了具有藍(lán)色和紅色雙發(fā)射熒光的GSH-Ag NCs，合成過程中GSH和Ag+的濃度比值發(fā)生改變，雙發(fā)射峰的熒光強(qiáng)度也隨之改變。

PAMAM等聚合物由于帶大量的官能團(tuán)也可作為合成Ag NCs的一類配體。Zheng等[37]在該方面做了開創(chuàng)性的研究，首次以羥基封端的PAMAM為配體合成了穩(wěn)定的Ag NCs。Yuan等[38]以超支化聚乙烯亞胺(hPEI)為配體，抗壞血酸為還原劑合成了藍(lán)綠色熒光發(fā)射的hPEI-Ag NCs，該納米簇具有很好的pH值穩(wěn)定性，可用于Cu2+的檢測(cè)。

2004年，Petty等[39]首次以單鏈DNA為模板，在NaBH4還原下合成了具有熒光性質(zhì)的Ag NCs，且證明了Ag+和胞嘧啶之間具有強(qiáng)烈結(jié)合力。此后，Ritchie等[40]發(fā)現(xiàn)Ag NCs的發(fā)射波長(zhǎng)與DNA上Ag+的還原狀態(tài)有關(guān)，完全還原與非完全還原的Ag NCs表現(xiàn)出不同的發(fā)射波長(zhǎng)，不同程度的非完全還原Ag NCs的發(fā)射波長(zhǎng)也不同。由于Ag+與4種堿基(A,T,C,G)的親和力不同，可通過改變DNA的序列調(diào)節(jié)Ag NCs的熒光性質(zhì)。Richards等[41]利用基因芯片技術(shù)優(yōu)化出5條單鏈DNA序列，可用于合成不同熒光發(fā)射的Ag NCs，其發(fā)射波長(zhǎng)從可見區(qū)到近紅外區(qū)。此外，雙鏈DNA也可用于Ag NCs的合成。Guo等[42]發(fā)現(xiàn)在雙鏈DNA上外加1個(gè)胞嘧啶小環(huán)，并以此為模板合成的Ag NCs具有較強(qiáng)的模板依賴性。隨后，Ma等[43]發(fā)現(xiàn)雙鏈DNA的錯(cuò)配堿基位點(diǎn)可以特異性生長(zhǎng)銀簇。Gwinn等[44]發(fā)現(xiàn)Ag NCs的光學(xué)性質(zhì)還可通過DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)調(diào)控，并首次以發(fā)卡DNA為模板，通過調(diào)節(jié)環(huán)部胞嘧啶的數(shù)目合成了4種Ag NCs。

1.3 熒光銅納米簇的合成

相比于貴金屬納米簇Au NCs與Ag NCs，有關(guān)銅納米簇(Cu NCs)的報(bào)道相對(duì)較少，主要是由于Cu NCs更易被氧化且制備過程中尺寸難以控制。硫醇類化合物中的巰基與Cu2+之間能形成Cu—S共價(jià)鍵，因此硫醇類化合物也能作為合成Cu NCs的配體。Wei等[45]利用2-巰基-5-丙烷基嘧啶為配體，在NaBH4還原下合成了具有雙發(fā)射的Cu NCs，在氧氣的電還原反應(yīng)中表現(xiàn)出很高的電催化活性。由于某些聚合物在水溶液中能與Cu2+螯合，Zhao等[46]以含有叔胺的羥基封端的PAMAM為配體，利用叔胺與Cu2+的絡(luò)合作用，在NaBH4的還原下成功合成了Cu NCs。多肽和蛋白質(zhì)等生物大分子也能作為配體為Cu2+提供結(jié)合位點(diǎn)，Huang等[47]以多肽作為配體，在抗壞血酸的還原下制備了量子產(chǎn)率為7.3%的Cu NCs，其熒光具有溫度敏感性。Wang等[48]以BSA為配體，在水合肼的還原下制備了發(fā)射紅色熒光的Cu NCs，其熒光具有pH值響應(yīng)性，可應(yīng)用于細(xì)胞成像。

DNA分子中富含各種官能基團(tuán)，如雜環(huán)氮、氨基、磷酸基等，能與不同的金屬離子結(jié)合，因而可用于各種金屬納米簇的合成。Rotaru 等[49]首次以雙鏈DNA為模板合成了具有熒光性質(zhì)的Cu NCs，發(fā)現(xiàn)通過控制雙鏈DNA的長(zhǎng)度可以調(diào)節(jié)Cu NCs的尺寸和熒光(圖3A)。隨后，本課題組[50]系統(tǒng)地篩選了能夠作為配體分子穩(wěn)定合成Cu NCs的單鏈DNA，研究結(jié)果表明，在還原劑抗壞血酸鈉的存在下，只有聚胸腺嘧啶寡核苷酸Poly(thymine)能夠快速有效地穩(wěn)定合成熒光Cu NCs(圖3B)。

1.4 其他金屬納米簇的合成

除上述3種常見的金屬納米簇外，一些熒光金屬納米簇也被相繼合成。例如，Kawasaki等[51]將H2PtCl6加入N,N-二甲酰胺(DMF)溶液中，在140 ℃下油浴8 h，利用DMF的還原能力首次合成了鉑納米簇(Pt NCs)；Hyotanishi等[52]以PdCl2為金屬前驅(qū)體采用相同方法合成了鈀納米簇(Pd NCs)；Tanaka等[53]以巰基乙酸為配體合成了藍(lán)光發(fā)射的Pt5NCs，其量子產(chǎn)率達(dá)18%；以樹枝狀大分子[54]、GSH[55]等為配體制備的Pt NCs也相繼被報(bào)道。此外，為得到性質(zhì)更優(yōu)良的金屬納米簇，通過摻雜或偶聯(lián)的雙金屬或多金屬納米簇也被逐漸發(fā)展。它們一般以單金屬納米簇的制備方法為基礎(chǔ)，發(fā)展簡(jiǎn)單的一步法或二步法進(jìn)行合成，如Su等[56]以DNA為配體，加入前驅(qū)體Cu(NO3)2和AgNO3，在NaBH4還原下一步合成了DNA-Cu/Ag NCs，該納米簇的量子產(chǎn)率高達(dá)47%；依據(jù)此方法隨后又合成了DNA-Au/Ag NCs[57]。以BSA-Au NCs的合成方法為基礎(chǔ)，還合成了具有雙發(fā)射的BSA-Ce/Au NCs[58]。Zhang等[59]利用微波還原法快速簡(jiǎn)便地制備了GSH-Au/Ag NCs，其量子產(chǎn)率相對(duì)于GSH-Au NCs也明顯提高。

圖4 尺寸對(duì)金屬材料的能級(jí)結(jié)構(gòu)影響[61]Fig.4 Effect of size on metal materials structure[61]

2 金屬納米簇的光學(xué)性質(zhì)

1961年，Kubo等[60]提出了著名的久保理論和納米粒子所具有的獨(dú)特的量子限域效應(yīng)。進(jìn)一步研究表明，當(dāng)金屬粒子粒徑不斷減小時(shí)，能級(jí)間隔逐漸增大，當(dāng)減小至與電子的費(fèi)米波長(zhǎng)相當(dāng)時(shí)，電子能級(jí)由連續(xù)能級(jí)分裂成分立能級(jí)(圖4)[61]。因此，1～2 nm的金屬納米簇并不具備表面等離子共振(SPR)吸收性質(zhì)，但在一定波長(zhǎng)的光作用下，金屬納米簇可實(shí)現(xiàn)能級(jí)之間的電子躍遷，從而表現(xiàn)出一定的光吸收和從可見到近紅外光區(qū)域的熒光發(fā)射性質(zhì)。金屬納米簇產(chǎn)生熒光的主要機(jī)理有兩種：與固有的量子尺寸效應(yīng)相關(guān)的金屬內(nèi)核；由金屬核與表面配體間相互作用控制的納米簇表面[62]。此外，結(jié)構(gòu)、表面配體、氧化狀態(tài)、溫度、pH值、離子強(qiáng)度等因素也會(huì)影響金屬納米簇的光學(xué)性質(zhì)，其中表面配體的給電子能力是決定金屬納米簇量子產(chǎn)率的重要因素，配體給電子的能力越強(qiáng)，金屬納米簇的熒光越強(qiáng)。所以通過增加配體的給電子能力、增加金屬核所帶正電荷和使用富含給電子的原子或基團(tuán)的配體可在一定程度上提高金屬納米簇的量子產(chǎn)率。

近年來，金屬納米簇的電化學(xué)發(fā)光(ECL)性質(zhì)不斷被開發(fā)和利用。金屬納米簇的ECL是電化學(xué)反應(yīng)和化學(xué)反應(yīng)的結(jié)合，通常具有熒光性質(zhì)的金屬納米簇均有電化學(xué)發(fā)光特性，但兩者發(fā)光的原理不同，電化學(xué)發(fā)光是自由基離子在外加電壓的激發(fā)下產(chǎn)生于電極表面，繼而形成激發(fā)態(tài)，當(dāng)激發(fā)態(tài)向基態(tài)能級(jí)躍遷時(shí)伴隨光子產(chǎn)生，因而在基于金屬納米簇的ECL體系中，往往表現(xiàn)出更強(qiáng)的信號(hào)。

3 金屬納米簇在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用研究

熒光金屬納米簇作為一種新型的熒光納米材料，相較于傳統(tǒng)的熒光染料和量子點(diǎn)，具有易制備、易修飾、尺寸超小、斯托克斯位移大、生物相容性良好，以及熒光光譜可調(diào)等優(yōu)勢(shì)，在生化分析、環(huán)境檢測(cè)、醫(yī)學(xué)成像和腫瘤治療方面具有廣泛的應(yīng)用。

3.1 金屬納米簇在生物傳感中的應(yīng)用

金屬離子廣泛存在于生物體中，參與生物體內(nèi)各種復(fù)雜的生化過程，以維持生命體系的一切正?；顒?dòng)，但許多金屬離子(如Cu2+、Fe3+等)超過一定濃度時(shí)均具有毒性作用?；诮饘偌{米簇較高的物化活性，目前已構(gòu)建了多種簡(jiǎn)便的傳感平臺(tái)用于金屬離子的高靈敏檢測(cè)[63-64]。其中Cu2+的檢測(cè)大多是基于Cu2+對(duì)熒光猝滅的原理，如Yuan等[65]利用hPEI合成了高穩(wěn)定的Ag NCs，Cu2+通過結(jié)合hPEI的氨基形成銅氨絡(luò)合物，與Ag NCs發(fā)生能量轉(zhuǎn)移導(dǎo)致熒光猝滅，將該材料包埋于水凝膠中，進(jìn)而發(fā)展了一種Cu2+的可視化檢測(cè)方法，檢出限達(dá)10 nmol/L。但熒光猝滅型傳感器易受外界環(huán)境的干擾，產(chǎn)生“假陽(yáng)性”信號(hào)，Lan等[66]針對(duì)這一缺陷發(fā)展了基于DNA-Ag NCs的熒光增強(qiáng)型Cu2+傳感器，Cu2+加入DNA-Ag NCs后形成了結(jié)構(gòu)緊密、熒光更強(qiáng)的DNA-Cu/Ag NCs，該方法具有很好的選擇性，檢出限為8 nmol/L。為提高Cu2+檢測(cè)的靈敏度，Yan等[67]合成了組氨酸(His)穩(wěn)定的Au NCs，并首次利用其過氧化物酶活性實(shí)現(xiàn)了Cu2+的比色檢測(cè)，His-Au NCs在H2O2的存在下可催化四甲基聯(lián)苯胺(TMB)發(fā)生顯色反應(yīng)，Cu2+加入后與His的氨基、羧基及咪唑環(huán)結(jié)合會(huì)抑制該Au NCs的酶活性，該方法的線性范圍為1～100 nmol/L，檢出限可達(dá)0.1 nmol/L。近年來，利用金屬納米簇還實(shí)現(xiàn)了血清和活細(xì)胞中Fe3+的分析檢測(cè)，F(xiàn)eng等[68]利用hPEI為配體合成了Fe3+響應(yīng)的Cu NCs，并實(shí)現(xiàn)了在血清等復(fù)雜樣品中對(duì)Fe3+的靈敏檢測(cè)；Huang等[69]發(fā)現(xiàn)以硫辛酸為配體合成的Au/Ag NCs對(duì)Fe3+具有較好的響應(yīng)，基于團(tuán)聚導(dǎo)致熒光猝滅原理構(gòu)建了Fe3+熒光傳感方法并成功應(yīng)用于活細(xì)胞成像。此外，金屬納米簇也被應(yīng)用于其他離子如Ag+、As3+、Cd2+、Cr3+、Cr6+、Hg2+和Pb2+[3,11,70-71]等的檢測(cè)。

生物分子作為生物體特有的物質(zhì)，其含量水平與生命活動(dòng)息息相關(guān)。其中生物巰基分子(GSH)、半胱氨酸(Cys)和同型半胱氨酸(Hcy)是許多多肽和蛋白質(zhì)的重要組成部分，在細(xì)胞的氧化還原平衡、癌癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，且三者之間緊密聯(lián)系。Huang等[72]構(gòu)建了基于DNA-Ag NCs的熒光增強(qiáng)型傳感器用于生物巰基化合物的檢測(cè)，由于DNA-Ag NCs具有很強(qiáng)的DNA序列及DNA結(jié)構(gòu)依賴性，通過優(yōu)化合成Ag NCs的DNA序列，得到了具有GSH、Cys和Hcy響應(yīng)的熒光探針。Xu等[73]以巰基十一酸和甲硫氨酸為配體一步法合成了橘黃色發(fā)射的Au NCs，利用Au NCs和GSH競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Cu2+誘導(dǎo)熒光變化而實(shí)現(xiàn)了GSH的檢測(cè)，檢出限為9.7 nmol/L，并成功應(yīng)用于活細(xì)胞內(nèi)GSH的監(jiān)測(cè)。Zhang等[74]利用聚胸腺嘧啶寡核苷酸(Poly(thymine))為模板合成的Cu NCs構(gòu)建了一種免標(biāo)的納米傳感器，結(jié)合Thymine-Hg2+-Thymine的作用機(jī)制，實(shí)現(xiàn)了對(duì)GSH、Cys和Hcy的快速檢測(cè)。三磷酸腺苷(ATP)作為生物體新陳代謝的能量物質(zhì)，其能量和消耗速率與許多疾病的發(fā)生有關(guān)，Zhang等[75]首次發(fā)現(xiàn)相鄰的DNA-Ag NCs與G四聚體/氯化血紅素(Hemin)復(fù)合物之間存在的光致電子轉(zhuǎn)移現(xiàn)象(PET)可用于ATP的特異性檢測(cè)，設(shè)計(jì)了含ATP的核酸適配體(Aptamer)、富G序列及Ag NCs模板序列的DNA序列。當(dāng)ATP和Hemin存在時(shí)，Aptamer構(gòu)象發(fā)生改變，G四聚體/Hemin隨之形成，并與DNA-Ag NCs產(chǎn)生PET效應(yīng)導(dǎo)致熒光猝滅，ATP的檢出限為8 nmol/L。除了熒光猝滅型傳感器，Xu等[76]和Zhou等[77]發(fā)展了基于DNA-Ag NCs和DNA-CuNCs的熒光增強(qiáng)型探針用于ATP的檢測(cè)。此外，熒光金屬納米簇還被廣泛應(yīng)用于生物大分子核酸和蛋白質(zhì)的檢測(cè)，核酸的定量檢測(cè)有利于對(duì)生理狀態(tài)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，并對(duì)臨床診斷起到很好的指導(dǎo)作用。Liu等[78]構(gòu)建了DNA-Ag NCs/氧化石墨烯(GO)體系，利用GO可以吸附單鏈DNA并猝滅熒光的原理，通過設(shè)計(jì)DNA序列實(shí)現(xiàn)了多種目標(biāo)物的檢測(cè)，包括乙型病毒(HBV)等病原DNA以及ATP、凝血酶等生物分子。Miao等[79]建立了一種基于DNA-Ag NCs和金納米顆粒熒光猝滅作用的miRNA檢測(cè)方法，通過對(duì)DNA-Ag NCs的DNA進(jìn)行功能化，即設(shè)計(jì)其中一端用于合成Ag NCs，另一端與miRNA互補(bǔ)用于捕獲靶標(biāo)和吸附帶正電的Au NPs以猝滅Ag NCs的熒光，在雙聯(lián)特異性核酸酶(DSN酶)的作用下，DNA/RNA雜交鏈中的DNA鏈被水解，Ag NCs遠(yuǎn)離Au NPs表面，熒光得到恢復(fù)，該方法的miRNA檢出限為33.4 fmol/L。目前，以不同的金屬納米簇為敏感探針構(gòu)建的化學(xué)傳感平臺(tái)也被應(yīng)用于可卡因[80]、H2O2[81]、活性氧(ROS)[82]等的檢測(cè)。

pH值和溫度是生物體內(nèi)最基本的生理參數(shù)，它們調(diào)控著大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)生物分子的活性，對(duì)于衡量生命活動(dòng)正常與否至關(guān)重要，監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)的pH值和溫度對(duì)分析細(xì)胞行為和疾病診斷及治療有重要意義[83-84]。Chen等[58]利用一步法合成的雙發(fā)射BSA-Ce/Au NCs作為pH值敏感探針，構(gòu)建了一種比率型pH傳感器，在pH 6.0～9.0范圍內(nèi)，該探針的熒光信號(hào)比率I410/I650與pH值存在良好的線性關(guān)系，且具有良好的穩(wěn)定性和生物相容性，已成功應(yīng)用于HeLa細(xì)胞內(nèi)的pH值監(jiān)測(cè)。近年來發(fā)現(xiàn)Cu NCs也可作為pH值指示材料，Zhang等[85]利用絲蛋白為配體合成了具有藍(lán)光發(fā)射的Cu NCs，在一定范圍內(nèi)，其熒光信號(hào)與pH值變化成正比。Wu等[86]將pH值敏感的異硫氰酸熒光素(FITC)染料交聯(lián)到BSA-Au NCs表面，發(fā)展了一種可用于pH值和溫度傳感的熒光探針，并實(shí)現(xiàn)了對(duì)活細(xì)胞內(nèi)pH值和溫度的監(jiān)測(cè)。Zhou等[87]報(bào)道了一種雙熒光DNA-Ag NCs探針用于溫度傳感，該探針由兩條含Ag NCs單鏈DNA通過堿基互補(bǔ)配對(duì)雜交組成，傳感機(jī)制是基于溫度的升高導(dǎo)致兩條DNA逐漸解鏈，從而使銀簇對(duì)分開，熒光隨之發(fā)生變化。除了利用金屬納米簇的熒光強(qiáng)度作為信號(hào)對(duì)溫度進(jìn)行傳感外，Shang等[88]還利用Au NCs的熒光壽命作為信號(hào)實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞內(nèi)的溫度傳感。

3.2 金屬納米簇在生物成像中的應(yīng)用

除了在生物傳感中的應(yīng)用，許多金屬納米簇也被應(yīng)用于生物成像領(lǐng)域，尤其是以蛋白質(zhì)、多肽等生物內(nèi)源性分子為配體合成的金屬納米簇，它們往往具有生物相容性好、易功能化修飾的特點(diǎn)，在生物成像應(yīng)用中表現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)越性。Wang等[89]以GSH-Ag NCs前體為配體，利用電化學(xué)還原法合成了具有紅光發(fā)射的Au NCs，量子產(chǎn)率為10%，該Au NCs在癌細(xì)胞和正常細(xì)胞的成像中均表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性和生物相容性。由于癌細(xì)胞中GSH的濃度遠(yuǎn)高于正常細(xì)胞的濃度[90]，Chen等[91]將此特性應(yīng)用于Pt NCs在癌細(xì)胞內(nèi)的原位合成并實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞成像(圖5A)。此外，金屬納米簇通過表面功能化后用于靶向腫瘤細(xì)胞的成像研究也相繼報(bào)道，葉酸[92]、TAT肽段[93]、RGD肽段[94]、Aptamer[95]等生物分子的靶向功能化修飾在生物成像中發(fā)揮著越來越重要的作用。為避免細(xì)胞成像時(shí)的自發(fā)熒光和背景熒光的干擾，許多研究者基于材料的特性引入了雙光子成像技術(shù)并得到了更深層次的細(xì)胞成像效果。Shang等[96]發(fā)展了新型的DPA-Au NCs，利用雙光子成像技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)HeLa細(xì)胞橫截面的3D成像。隨后，功能化的BSA-Au NCs[97-98]利用雙光子成像技術(shù)在腫瘤細(xì)胞中也得到了應(yīng)用。此外，熒光壽命成像技術(shù)也能弱化成像時(shí)生物組織自發(fā)熒光和背景熒光的缺點(diǎn)，Shang等[88]以硫辛酸-Au NCs作為熒光探針，利用其熒光壽命的溫度敏感性，發(fā)展了一種活細(xì)胞中溫度響應(yīng)的熒光壽命成像方法(FLIM)，在生理溫度范圍內(nèi)，Au NCs的熒光壽命變化范圍為970～670 ns(圖5B)。利用Ag NCs對(duì)細(xì)胞進(jìn)行熒光壽命成像的研究也早有報(bào)道[99]。

除了上述利用金屬納米簇?zé)晒庑再|(zhì)進(jìn)行單一模式的細(xì)胞成像，多模式的成像技術(shù)在細(xì)胞及活體層面也得到了發(fā)展和應(yīng)用。Wang等[100]采用聲波還原法合成了GSH-Cu NCs，利用該Cu NCs近紅外熒光發(fā)射和順磁性質(zhì)的特性，將近紅外熒光(NIRF)/核磁共振(MRI)雙模式成像技術(shù)成功應(yīng)用于HeLa細(xì)胞內(nèi)。目前，基于鑭系元素離子Gd3+的造影劑廣泛應(yīng)用于腫瘤的成像，Hou等[101]發(fā)展了由Gd3+介導(dǎo)Au NCs自組裝形成的納米顆粒(GNCNs)用于癌癥多模式成像的方法，Gd3+的加入使復(fù)合納米顆粒的熒光大大增強(qiáng)，利用該材料實(shí)現(xiàn)了在A549細(xì)胞和活體內(nèi)的NIRF/CT/MRI多模式成像。

3.3 金屬納米簇在腫瘤治療中的應(yīng)用

基因治療在腫瘤治療中表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景，其面臨的挑戰(zhàn)之一是需引入安全、靶向、高效的載體系統(tǒng)。金屬納米簇作為一種新型的熒光納米材料，具有生物相容性好、穩(wěn)定性高、易于合成與修飾等(基因治療載體系統(tǒng)所必需的)諸多優(yōu)點(diǎn)，可在一定程度上提高該治療模式的應(yīng)用價(jià)值。Tao等[102]合成了聚乙烯亞胺(PEI)-Au NCs，利用PEI的“質(zhì)子海綿效應(yīng)”，將PEI-Au NCs作為一種安全有效的基因載體實(shí)現(xiàn)了HepG2中pDNA的高效轉(zhuǎn)運(yùn)與轉(zhuǎn)染。高分子量的PEI具有高效的轉(zhuǎn)染效率，而Au NCs在很大程度上降低了高分子量PEI的毒性，因此PEI-Au NCs在基因治療中表現(xiàn)出很好的應(yīng)用前景?；陬愃圃恚琖ang等[103]發(fā)現(xiàn)PEI-Cu NCs也可作為載體且表現(xiàn)出基因轉(zhuǎn)運(yùn)的潛力。Vankayala等[104]利用細(xì)胞核定位肽(TAT)對(duì)Au NCs進(jìn)行靶向功能化，Au NCs的熒光和核染料在細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了共定位，結(jié)果表明TAT-Au NCs在HeLa細(xì)胞和斑馬魚中的轉(zhuǎn)染效率達(dá)81%，是常用脂質(zhì)體載體的3.2倍。Dutta等[105]將自殺基因整合到pDNA內(nèi)，然后通過靜電作用吸附到BSA-AuAg NCs上，根據(jù)AuAg NCs的熒光信號(hào)可對(duì)基因轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)行成像，Caspase 3活性檢測(cè)表明該基因治療體系對(duì)腫瘤細(xì)胞起到了較好的凋亡作用。Lei等[106]發(fā)現(xiàn)GSH-Au NCs結(jié)合神經(jīng)生長(zhǎng)因子NGF的siRNA(GNC-siRNA)可使NGF基因沉默并提高胰腺癌治療效率，GNC-siRNA復(fù)合物增加了siRNA在血清中的穩(wěn)定性，延長(zhǎng)了siRNA在血液中的循環(huán)壽命，增強(qiáng)了siRNA的細(xì)胞攝取和腫瘤積累。另外，將功能化的Ag NCs作為載體轉(zhuǎn)運(yùn)siRNA也有報(bào)道[107]。

隨著生物納米材料的發(fā)展及其向醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的不斷滲透，熒光納米材料和腫瘤化學(xué)治療相結(jié)合逐漸成為當(dāng)前攻克腫瘤研究的重要手段，其中金屬納米簇所具有的光學(xué)性質(zhì)和生物相容性使其在該領(lǐng)域中表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。Khandelia等[98]構(gòu)建了一種裝載Au NCs和阿霉素(Dox)的納米診療復(fù)合粒子，該復(fù)合粒子既可對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行雙光子成像，又可對(duì)癌細(xì)胞達(dá)到化學(xué)治療的作用。Chen等[108]對(duì)Au NCs@His進(jìn)行癌細(xì)胞內(nèi)外的雙靶向修飾和藥物交聯(lián)，發(fā)展了基于Au NCs-Dox-cRGD-Aptamer的診療一體化納米平臺(tái)，提高了藥物對(duì)腫瘤組織的親和力與滲透率，實(shí)現(xiàn)了腫瘤部位的成像及藥物的靶向遞送。Zhou等[109]制備了BSA-Au NCs連接順鉑和葉酸的納米藥物復(fù)合物，結(jié)果表明基于Au NCs的納米平臺(tái)在腫瘤的成像和治療方面具備良好的發(fā)展前景。另外，Cu NCs也具有此方面的潛力，如圖6所示，Goswami等[110]直接以具有癌細(xì)胞靶向性的轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)作為配體合成了Tf-Cu NCs，并利用靜電相互作用力裝載Dox制備了Tf-Cu NCs-Dox NPs，Dox與Cu NCs之間存在熒光共振能力轉(zhuǎn)移(FRET)效應(yīng)，當(dāng)該靶向型納米顆粒進(jìn)入癌細(xì)胞后，Cu NCs的熒光隨著Dox的釋放而恢復(fù)，利用FRET策略對(duì)腫瘤組織達(dá)到了診療一體化的目的。

腫瘤的物理治療主要是利用光對(duì)癌變組織進(jìn)行放療及光動(dòng)力學(xué)治療。首先，X射線可以離子化DNA分子，或與H2O作用生成活性氧物質(zhì)，其中·OH可誘導(dǎo)細(xì)胞DNA發(fā)生損傷達(dá)到治療腫瘤的目的[111]；另一方面，高原子序數(shù)的金屬元素在X射線誘導(dǎo)下發(fā)生生化反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物與癌細(xì)胞內(nèi)水分子反應(yīng)生成自由基，可使DNA發(fā)生電子轉(zhuǎn)移而被氧化，因此某些金屬納米簇有放療增敏的作用[112]。Zhang等[113]在利用Au NCs作為放療增敏劑提高腫瘤放療效果的研究中做了先導(dǎo)性的工作，研究結(jié)果表明超小尺寸的Au NCs可以避免網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬，有效提高腫瘤的放療療效?；诖耍琇iang等[114]采用c(RGDyC)肽為配體，結(jié)合其癌細(xì)胞靶向功能制備了具有腫瘤靶向及放療增敏作用的Au NCs?；诮饘偌{米簇表面官能團(tuán)與光敏劑交聯(lián)可應(yīng)用于腫瘤的光動(dòng)力學(xué)治療(PDT)，Nair 等[115]將原卟啉(PPIX)與葉酸修飾的硫辛酸-Au NCs共價(jià)交聯(lián)，利用該材料實(shí)現(xiàn)了活體中腫瘤部位的光動(dòng)力學(xué)治療的實(shí)時(shí)成像。PPIX還可與近紅外發(fā)射的Aptamer(AS1411)-Ag NCs通過G四聚體相連，基于此方法，Ai等[116]構(gòu)建了基于DNA-Ag NCs的診療一體化平臺(tái)。研究表明，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)會(huì)產(chǎn)生抗氧化防御機(jī)制以應(yīng)對(duì)持久的PDT治療，例如過度表達(dá)硫環(huán)蛋白還原酶(TrxR)可以抵抗細(xì)胞內(nèi)增加的ROS水平[117]，Gao等[118]發(fā)現(xiàn)Au NCs能有效抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)TrxR，將Au NCs和光敏劑二氫卟吩e6(Ce6)同時(shí)負(fù)載到pH敏感性脂質(zhì)體中，在細(xì)胞內(nèi)溶酶體酸性環(huán)境下，Au NCs和Ce6被快速釋放到胞漿，金簇有效抑制了胞漿內(nèi)的TrxR，使得細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS不能被及時(shí)清除，提高了Ce6介導(dǎo)的光動(dòng)力學(xué)誘發(fā)的細(xì)胞內(nèi)ROS水平，改善了PDT的治療效應(yīng)。而且，某些金屬納米簇可直接作為光敏劑用于光動(dòng)力學(xué)治療。Kawasaki等[119]研究發(fā)現(xiàn)以苯乙硫醇或卡托普利為配體合成的Au NCs具有光敏劑特性，在可見/近紅外光激發(fā)下能夠有效地產(chǎn)生單線態(tài)氧，并基于以上獨(dú)特的性質(zhì)，使用卡托普利-Au NCs作為生物相容性光敏劑實(shí)現(xiàn)了對(duì)癌細(xì)胞的光動(dòng)力學(xué)治療。Vankayala等[104]利用TAT肽段對(duì)Au NCs進(jìn)行靶向功能化，以TAT-Au NCs作光敏劑實(shí)現(xiàn)了HeLa細(xì)胞的光動(dòng)力學(xué)治療。

圖5 Pt NCs在癌細(xì)胞內(nèi)的原位生物合成及熒光成像(A)[91]，以及硫辛酸-Au NCs作為熒光探針在不同溫度下對(duì)HeLa細(xì)胞進(jìn)行熒光壽命成像(B)[88]Fig.5 In situ biosynthesis of Pt NCs and cell imaging(A)[91],and FLIM images of HeLa cells with internalized Au NCs at different temperatures(B)[88]

圖6 與Tf-Cu NCs-Dox NPs孵育不同時(shí)間后HeLa細(xì)胞的熒光共焦顯微鏡圖像(A)，及Tf-Cu NCs-Dox NPs對(duì)小鼠的腫瘤抑制能力監(jiān)測(cè)(B)[110]
Fig.6 Fluorescence confocal microscopy images of HeLa cells at different time of treatment(A),and experimental scheme representing the effect of Tf-Cu NCs-Dox NPs in tumor bearing Swiss albino mice monitored for 50 days(B)[110]

4 結(jié)論與展望

本文系統(tǒng)地介紹了不同金屬納米簇的合成方法和熒光性質(zhì)，并從生物傳感、生物成像和腫瘤治療三方面總結(jié)了近年來它們?cè)谏镝t(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究進(jìn)展。熒光金屬納米簇作為一種新型的熒光納米材料，不僅擁有良好的熒光性質(zhì)，還有更好的生物相容性。此外，配體合成的熒光金屬納米簇通常還有易于修飾的特點(diǎn)，從而可對(duì)其熒光性質(zhì)、靶向識(shí)別等進(jìn)行調(diào)整和優(yōu)化。這些優(yōu)良特性，使金屬納米簇在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域展現(xiàn)出更多的應(yīng)用潛能。

盡管金屬納米簇在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已取得一定成果，但進(jìn)一步的發(fā)展還面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。首要解決的問題是如何制備純度和量子產(chǎn)率更高的金屬納米簇。與量子點(diǎn)和有機(jī)染料相比，目前所合成的金屬納米簇量子產(chǎn)率偏低，實(shí)現(xiàn)金屬納米簇中金屬核組分與尺寸可控合成、增加表面配體的給電子能力等是解決該問題的突破口。其次，由于金屬納米簇本身具有較高的物化活性，而在生物成像或治療應(yīng)用時(shí)往往需要更為準(zhǔn)確且穩(wěn)定的熒光信號(hào)，因此如何在細(xì)胞或活體等復(fù)雜生物環(huán)境中提升該熒光材料的抗干擾能力是非常重要的。最后，金屬納米簇的表面功能化對(duì)于其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用研究十分關(guān)鍵，一方面，金屬納米簇作為傳感器、熒光染料、基因載體或藥物載體等角色，高效率的表面功能化修飾有利于其更好的發(fā)揮作用；另一方面，功能化修飾會(huì)使金屬納米簇表面的化學(xué)基團(tuán)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致材料本身的熒光性質(zhì)發(fā)生變化。許多研究表明，以熒光金屬納米簇為基礎(chǔ)構(gòu)建的生物標(biāo)記、生物傳感、生物成像以及靶向的腫瘤治療平臺(tái)具有十分廣闊的前景，但將其應(yīng)用于臨床實(shí)踐尚需結(jié)合其他功能性材料進(jìn)行更多深入、系統(tǒng)的研究。通過將金屬納米簇的優(yōu)良性質(zhì)與其他造影劑或治療藥物相結(jié)合，有望實(shí)現(xiàn)多功能金屬納米復(fù)合材料的合成及多模態(tài)成像與治療的應(yīng)用，為臨床實(shí)踐提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持?？傊S著理論基礎(chǔ)、合成技術(shù)以及各方面技術(shù)的綜合發(fā)展，熒光金屬納米簇將為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究提供新的契機(jī)，為細(xì)胞內(nèi)傳感、成像以及治療開拓新的途徑。