RNA修飾分析方法研究進(jìn)展

游雪嬌，袁必鋒，馮鈺锜

(武漢大學(xué) 化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院，生物醫(yī)學(xué)分析化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430072)

核酸表觀遺傳修飾能調(diào)控真核生物的基因表達(dá)，對(duì)遺傳、生長(zhǎng)和疾病發(fā)生等方面有重要影響[1-2]。近年來(lái)，RNA表觀遺傳修飾研究取得了很大進(jìn)展[3]。天然存在的RNA分子含有各種化學(xué)修飾。目前在RNA分子中共鑒定了150多個(gè)結(jié)構(gòu)不同的修飾類(lèi)型[4]。

幾乎所有類(lèi)型的RNA中均含有修飾。目前在轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(Transfer RNA，tRNA)上發(fā)現(xiàn)的修飾種類(lèi)最多[5]。核糖體RNA(Ribosomal RNA，rRNA)是細(xì)胞中含量最豐富的RNA，也含有許多位于不同序列和結(jié)構(gòu)上的修飾類(lèi)型[6]。除了在這些豐富的非編碼RNA(Non-coding RNA，ncRNA)中發(fā)現(xiàn)多種修飾外[7]，近年來(lái)研究者在體內(nèi)豐度較低的RNA類(lèi)型中也發(fā)現(xiàn)越來(lái)越多的修飾，包括信使RNA(Messenger RNA，mRNA)[8]、小核RNA(Small nuclear RNA，snRNA)[9]、核仁小RNA[9]和微小RNA(microRNA，miRNA)[10-11]等。甚至環(huán)狀RNA中也存在RNA修飾，如N6-Methyladenosine(m6A)[12]。研究表明RNA修飾在真核生物的生命調(diào)控中發(fā)揮了重要作用[13]。然而，由于缺乏合適的檢測(cè)方法，目前對(duì)很多RNA修飾，特別是對(duì)低豐度的RNA修飾的功能了解甚少[14]。闡明RNA修飾的生物學(xué)意義需要能特異性檢測(cè)、量化修飾核苷并對(duì)其分布進(jìn)行定位的高靈敏度分析工具。近幾年，用于RNA修飾量化和定位的分析方法已取得了很大進(jìn)展。

RNA修飾的分析方法主要分為RNA修飾的全分析和定位分析兩大類(lèi)。本文總結(jié)了這兩類(lèi)分析方法的最新進(jìn)展，并討論了其優(yōu)點(diǎn)和不足。通過(guò)了解每種分析方法的特性，研究人員可以選擇合適的分析方法。此外，隨著技術(shù)的進(jìn)步，更多新的RNA修飾會(huì)被發(fā)現(xiàn)，RNA修飾的生理功能會(huì)被進(jìn)一步認(rèn)識(shí)。

1 RNA修飾的全分析

用于RNA修飾全分析的方法主要包括毛細(xì)管電泳(CE)、液相色譜(LC)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)、薄層色譜(TLC)、熒光標(biāo)記和免疫檢測(cè)等方法(圖1)。RNA修飾的全分析需要酶/化學(xué)處理釋放RNA組分，例如核苷酸、核苷或核酸堿基，隨后采用各種分析方法進(jìn)行檢測(cè)。

圖1 RNA修飾全分析方法示意圖Fig.1 Schematic diagram of methods for the global detection of RNA modifications

1.1 毛細(xì)管電泳法

毛細(xì)管電泳是一類(lèi)以毛細(xì)管為分離介質(zhì)、以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力的分離技術(shù)，其原理是基于電場(chǎng)中帶電粒子的分離，可與紫外檢測(cè)、質(zhì)譜檢測(cè)和激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)等技術(shù)耦合。

研究表明尿液樣品中的修飾核苷可作為潛在的癌癥生物標(biāo)志物。Jiang等[15]開(kāi)發(fā)了毛細(xì)管電泳結(jié)合紫外檢測(cè)技術(shù)分離和定量尿樣中包括修飾核苷在內(nèi)的10種核苷，檢測(cè)限(LODs)小于2.0 μmol/L。與以往的研究相比，該方法更簡(jiǎn)單、快速，可用于尿樣中修飾核苷的量化。最近，Stephen等[16]提出了一種使用毛細(xì)管電泳結(jié)合激光誘導(dǎo)熒光(CE-LIF)分析腺嘌呤核苷(Adenosine，A)和次黃嘌呤核苷(Inosine，I)的方法。首先使用2，4，6-三硝基苯磺酸衍生A和I，得到三硝基苯基的熒光絡(luò)合物TNP-A和TNP-I。TNP-A和TNP-I進(jìn)一步與γ-環(huán)糊精形成配合物，熒光增強(qiáng)約25倍，最后通過(guò)CE-LIF進(jìn)行檢測(cè)分析。該法可同時(shí)分析和定量大鼠前腦樣品中的A和I，LODs分別為1.6、4 μmol/L。此外，Khan等[17]報(bào)道了一種毛細(xì)管電泳結(jié)合質(zhì)譜(CE-MS)直接分析生物樣品中miRNA的方法。通過(guò)CE-MS方法，不僅能夠檢測(cè)到從B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病血清中分離的兩種內(nèi)源性的循環(huán)miRNA(iso-miR-16-5p和miR-21-5p)，而且能夠?qū)崿F(xiàn)miRNA修飾的無(wú)標(biāo)記定量。已有研究表明miRNA的序列和內(nèi)容與某些癌癥有關(guān)[18]，說(shuō)明CE-MS方法分析miRNA具有臨床診斷的多功能生物檢測(cè)的應(yīng)用潛力。

雖然CE方法可快速分離分析物，且能提供良好的分離度，但穩(wěn)定性和重現(xiàn)性欠缺。此外，CE方法的樣品上樣量有限，限制了其靈敏度，有待進(jìn)一步改進(jìn)。

1.2 液相色譜法

液相色譜技術(shù)發(fā)展比較成熟，被普遍應(yīng)用于核酸修飾的分析。通過(guò)液相色譜技術(shù)檢測(cè)RNA修飾的方法是基于酶或化學(xué)水解產(chǎn)生的RNA組分的色譜分離。若液相色譜對(duì)不同的RNA組分無(wú)法進(jìn)行有效分離，會(huì)造成無(wú)法對(duì)RNA修飾進(jìn)行定性分析。因此，基線(xiàn)分離對(duì)基于液相色譜的分析方法至關(guān)重要。

基于液相色譜的方法常用于核苷的早期研究。Desrosiers等[19]使用二乙氨乙基纖維素色譜法結(jié)合放射性同位素標(biāo)記研究來(lái)自Novikoff肝癌細(xì)胞mRNA中的甲基化。同位素標(biāo)記的RNA被完全酶解成核苷后，通過(guò)液相色譜分析RNA中甲基化修飾核苷的組成，并與標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)，鑒定了mRNA中存在的4種2’-O-甲基核苷，分別為2’-O-Methyladenosine(Am)、2’-O-Methylguanosine(Gm)、2’-O-Methylcytidine(Cm)和2’-O-Methyluridine(Um)。此外，還在mRNA上發(fā)現(xiàn)了m6A。Buck等[20]采用高效液相色譜結(jié)合紫外檢測(cè)(HPLC-UV)對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌和大腸桿菌(E.coli)tRNA中的29個(gè)修飾核苷進(jìn)行了分析。該方法快速、靈敏且色譜分辨率高。Gehrke等[21]系統(tǒng)地介紹了用于分析RNA核苷組成的HPLC-UV方法，并開(kāi)發(fā)了3種優(yōu)化的反相液相色譜系統(tǒng)，其在分辨率、分析速度和靈敏度上均有改善。優(yōu)化的方法可從約1 μg tRNA中定量31種不同的核苷，且檢測(cè)的相對(duì)誤差均小于5%。

基于液相色譜的方法操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好，能用于RNA修飾的定量分析，但其定性能力較弱。為提高對(duì)RNA修飾的定性分析能力，液相色譜常與定性能力較好的質(zhì)譜聯(lián)用，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)RNA修飾的準(zhǔn)確定性和定量分析，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法也是目前RNA修飾全分析的主要研究方法。

1.3 質(zhì)譜分析法

質(zhì)譜分析通過(guò)測(cè)定分子質(zhì)荷比實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的分析。與正常核苷相比，幾乎所有的修飾核苷均有相對(duì)分子質(zhì)量上的增加，因此可運(yùn)用質(zhì)譜鑒定和表征修飾核苷[22]。質(zhì)譜分析法已被廣泛用于核酸堿基、核苷和核苷酸的研究[23-27]。在近10多年中，基于質(zhì)譜的分析方法和軟件開(kāi)發(fā)取得了很大進(jìn)展，能提供有關(guān)RNA修飾的定性和定量信息。基于質(zhì)譜的分析方法已被證明是用于發(fā)現(xiàn)和鑒定新的RNA修飾最有力的工具之一[28-29]。

1.3.1液相色譜-質(zhì)譜分析法由于良好的選擇性和靈敏度，LC-MS被廣泛用于化合物的定性和定量分析[30-35]?；贚C-MS的方法主要是在核苷水平上對(duì)RNA修飾進(jìn)行研究，因此在分析前需將待測(cè)的核酸樣品酶解為核苷[36-41]。修飾核苷的鑒定通?；谂c標(biāo)準(zhǔn)品的比對(duì)或與RNA修飾數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)。

Zhao等[42]開(kāi)發(fā)了一種超高效液相色譜(UHPLC)與飛行時(shí)間質(zhì)譜(Time-of-flight mass spectrometry)聯(lián)用的方法分析尿液中含有順式二羥基結(jié)構(gòu)的核苷和其他代謝物。與HPLC相比，UHPLC的分辨率和靈敏度更高，能檢測(cè)到更多潛在的修飾核苷。Chan等[43]使用LC-MS分析了牛分枝桿菌BCG(Bacille Calmette-Guérin)tRNA中的修飾核苷，將目標(biāo)tRNA酶解成核苷，再通過(guò)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式的LC-MS進(jìn)行分析。通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)鑒定了12個(gè)修飾核苷；并與RNA修飾數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，進(jìn)一步鑒定了5個(gè)修飾核苷。Su等[44]提出了LC-MS結(jié)合動(dòng)態(tài)MRM模式定量分析tRNA中修飾核苷的方法。該方法用HPLC對(duì)tRNA進(jìn)行純化后，再用反相HPLC分離酶解的核苷，最后通過(guò)動(dòng)態(tài)MRM模式的LC-MS對(duì)單個(gè)核苷進(jìn)行鑒定和定量。該方法可在15 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)數(shù)微克tRNA中修飾核苷的相對(duì)定量分析。Magana等[45]通過(guò)液相色譜-離子阱串聯(lián)質(zhì)譜法研究了CuO納米顆粒對(duì)L.sativum中核酸甲基化的影響。通過(guò)將在電噴霧離子化中形成的質(zhì)子結(jié)合的二聚體作為MRM定量的前體離子來(lái)增強(qiáng)對(duì)含胞嘧啶的核苷的選擇性。該研究在DNA和RNA中分別發(fā)現(xiàn)了13.03%和0.92%的甲基化胞嘧啶。

最近，本課題組建立了一種通過(guò)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-ESI-MS/MS)定量分析單細(xì)胞中DNA和RNA甲基化的方法[46]。筆者首先建立了一個(gè)高效的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(Circulating tumor cells，CTCs)捕獲系統(tǒng)，之后在離心管中完成CTCs裂解、核酸酶解、核苷提取一系列步驟，最后通過(guò)LC-ESI-MS/MS進(jìn)行分析。該方法實(shí)現(xiàn)了在單細(xì)胞水平上檢測(cè)5-Methylcytidine(5-mrC)、m6A和5-Methyl-2’-deoxycytidine(5-mdC)。

為進(jìn)一步提高修飾核苷的檢測(cè)靈敏度，特別是低豐度的修飾核苷，需對(duì)樣品前處理過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化[47-48]。本課題組制備了毛細(xì)管整體柱，并將其作為在線(xiàn)固相微萃取柱(SPME)，建立了一種在線(xiàn)SPME-LC-MS/MS分析修飾核苷的方法[49-50]。結(jié)果顯示，所制備的毛細(xì)管整體柱對(duì)含有順式二羥基結(jié)構(gòu)的化合物具有優(yōu)異的選擇性，能成功用于人體尿液中含有順式二羥基結(jié)構(gòu)的修飾核苷類(lèi)化合物和核糖類(lèi)代謝物的系統(tǒng)分析。運(yùn)用此方法對(duì)比了健康人和癌癥患者尿液中含順式二羥基結(jié)構(gòu)的修飾核苷的相對(duì)含量，發(fā)現(xiàn)了幾種潛在的癌癥生物標(biāo)志物，從而為癌癥生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)提供了一個(gè)很好的分析平臺(tái)[51-52]。

1.3.2穩(wěn)定同位素標(biāo)記-質(zhì)譜分析法質(zhì)譜信號(hào)波動(dòng)或基質(zhì)效應(yīng)常引起定量不準(zhǔn)確，可采用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的核苷作為內(nèi)標(biāo)來(lái)校正，以改善定量分析的準(zhǔn)確性。Dalluge等[53]使用同位素稀釋結(jié)合LC-MS定量分析RNA中的二氫尿嘧啶(Dihydrouridine)修飾。首先將RNA樣品酶解成核苷，然后加入[1，3-15N2]-二氫尿嘧啶([1，3-15N2]-Dihydrouridine)和[1，3-15N2]-尿嘧啶([1，3-15N2]-Uridine)作為內(nèi)標(biāo)，最后通過(guò)選擇離子監(jiān)測(cè)模式的LC-MS對(duì)標(biāo)記和未標(biāo)記的核苷的質(zhì)子化分子離子進(jìn)行分析。

然而許多修飾核苷尚無(wú)商品化的穩(wěn)定同位素標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)品[28]。為了解決此問(wèn)題，Deft等[28]采用代謝標(biāo)記的方法獲得穩(wěn)定同位素標(biāo)記的修飾核苷，并將其用作參考標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)非靶向液相色譜-串聯(lián)高分辨質(zhì)譜(LC-MS/HRMS)對(duì)修飾核苷進(jìn)行檢測(cè)。該方法使用在含有D-[13C6]-葡萄糖和氨基酸的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的重標(biāo)記和未標(biāo)記的大腸桿菌分別飼喂秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)(C.elegans)幼蟲(chóng)。從標(biāo)記的或未標(biāo)記的C.elegans中分離總RNA，并進(jìn)行LC-MS/HRMS分析。分別鑒定出C.elegans大RNA片段(大于200 nt)中的21個(gè)修飾和小RNA片段(小于200 nt)中的26個(gè)修飾，并發(fā)現(xiàn)一些RNA修飾對(duì)環(huán)境脅迫具有動(dòng)態(tài)響應(yīng)。Huber等[54]則建立了一種雙穩(wěn)定同位素標(biāo)記結(jié)合LC-MS/HRMS分析RNA修飾的方法，采用含穩(wěn)定同位素標(biāo)記的[甲基-13CD3]-L-甲硫氨酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)人類(lèi)HEK293T細(xì)胞，以代謝產(chǎn)生RNA中13CD3標(biāo)記的5-mrC及其氧化衍生物；用含有未標(biāo)記的L-甲硫氨酸和[1，3-15N2]-胞嘧啶苷([1，3-15N2]-Cytidine)的培養(yǎng)基培養(yǎng)人類(lèi)HEK293T細(xì)胞，以代謝產(chǎn)生RNA中15N2標(biāo)記的5-mrC及其氧化衍生物。隨后對(duì)酶解產(chǎn)生的核苷進(jìn)行LC-MS分析。該方法成功在哺乳動(dòng)物的RNA中發(fā)現(xiàn)了5-mrC的第2個(gè)氧化衍生物2’-O-Methyl-5-hydroxymethylcytidine(hm5Cm)，并定量了其在高等生物體內(nèi)的含量。

1.3.3化學(xué)標(biāo)記-質(zhì)譜分析法不同類(lèi)型的RNA中修飾的類(lèi)型不同，且修飾的豐度也不同。生物體內(nèi)許多RNA修飾的豐度均較低，傳統(tǒng)的LC-MS難以實(shí)現(xiàn)對(duì)低豐度RNA修飾的靈敏檢測(cè)。為提高對(duì)分析物的檢測(cè)靈敏度，研究者建立了化學(xué)標(biāo)記結(jié)合LC-MS的分析方法[30-31，55-59]。Wrobel等[60]提出了一種基于化學(xué)標(biāo)記結(jié)合高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜(HPLC-ICP-MS)高靈敏分析甲基化胞苷和其他核糖核苷的方法，通過(guò)在順式二羥基核糖基團(tuán)、六價(jià)Os(K2OsO2(OH)4)和四甲基乙二胺之間形成三元復(fù)合物使核糖殘基標(biāo)記上六價(jià)Os后，再采用HPLC-ICP-MS檢測(cè)分析Os標(biāo)記的核苷。該方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)Cytidine(C)、Uridine(U)、5-mrC、Guanosine(G)的高靈敏分析。當(dāng)進(jìn)樣量為100 μL時(shí)，上述4種核苷的LODs分別為24、38、21、28 pmol/L。

本課題組建立了一種氧化衍生化結(jié)合LC-MS的新方法檢測(cè)DNA和RNA中的5-Hydroxymethylcytosine(5-hmC)和5-Formylcytosine(5-foC)[61]。該方法用MnO2將5-hmC氧化為5-foC，5-foC進(jìn)一步用丹磺酰肼標(biāo)記。由于丹磺酰肼上的酰肼基團(tuán)易與5-foC上的醛基反應(yīng)，生成含有易帶電的叔胺基團(tuán)的腙衍生物，該衍生基團(tuán)能夠提高5-foC的電離效率，進(jìn)而提高了LC-ESI-MS/MS檢測(cè)5-foC的靈敏度。使用該方法發(fā)現(xiàn)了哺乳動(dòng)物的RNA中存在5-foC。本課題組還建立了化學(xué)標(biāo)記結(jié)合LC-MS同時(shí)測(cè)定RNA中5-Methylcytosine(5-mC)、5-hmC、5-foC和5-Carboxylcytosine(5-caC)的方法[62-63]，通過(guò)使用2-溴-1-(4-二乙基氨基苯基)-乙酮標(biāo)記RNA修飾，檢測(cè)靈敏度增加了70～313倍。通過(guò)此方法，除了在哺乳動(dòng)物RNA中檢出5-caC外，還發(fā)現(xiàn)人的結(jié)直腸癌和肝癌組織中5-hmC含量明顯低于癌旁組織(正常組織)，表明RNA中的5-hmC可能參與了腫瘤形成和發(fā)展過(guò)程的調(diào)控。

此外，使用吉拉德P試劑標(biāo)記核酸修飾，本課題組還建立了化學(xué)標(biāo)記結(jié)合SPME-UHPLC-ESI-MS/MS法同時(shí)靈敏檢測(cè)DNA和RNA中的6種甲?；塑眨?-Formyl-2’-deoxycytidine(5-fodC)、5-Formylcytidine(5-forC)、5-Formyl-2’-deoxyuridine(5-fodU)、5-Formyluridine(5-forU)、2’-O-Methyl-5-formylcytidine(5-forCm)和2’-O-Methyl-5-formyluridine(5-forUm)[64]。該方法對(duì)核苷的檢測(cè)靈敏度提高了307～884倍，并在人的細(xì)胞和組織中檢測(cè)到5-forU、5-forCm和5-forUm。

1.3.4離子遷移譜-質(zhì)譜分析法傳統(tǒng)的定性和定量RNA修飾的分析方法依賴(lài)于液相色譜和毛細(xì)管電泳來(lái)減少背景，在分析前需進(jìn)行RNA酶解產(chǎn)物的分離[65]。為簡(jiǎn)化分析過(guò)程，F(xiàn)abris等[66]提出了離子遷移譜-質(zhì)譜法(IMS-MS)對(duì)核糖核苷酸混合物進(jìn)行直接分析?；贗MS-MS的方法提供了一個(gè)額外的分離維度，以便根據(jù)遷移率和碎片特征區(qū)分分析物。使用IMS-MS，F(xiàn)abris等成功分析了相似或相同元素組成的核苷酸混合物[66]，并繪制了不同細(xì)胞類(lèi)型和代謝狀態(tài)的核苷酸修飾譜圖[65]，為探索修飾的生物學(xué)意義提供了有價(jià)值的信息。

1.4 薄層色譜法(TLC)

TLC用于分析核苷酸、核苷和堿基已有半個(gè)多世紀(jì)的歷史?；赥LC分析RNA修飾是通過(guò)對(duì)比相應(yīng)的對(duì)照物的遷移率進(jìn)行定性，通過(guò)測(cè)定斑點(diǎn)強(qiáng)度進(jìn)行定量。TLC分離可在一維或二維(Two-dimensional thin layer chromatography，2D-TLC)中進(jìn)行，后者可以提供更好的分離度，已被廣泛用于分析各種RNA的修飾[67-68]。由于TLC的方法靈敏度較低，因此需要結(jié)合放射性同位素(如32P)標(biāo)記，通過(guò)放射自顯影檢測(cè)提高其靈敏度。通常用核糖核酸酶A(Ribonuclease A，RNase A)或RNase T1、RNase T2將RNA酶切成寡核苷酸，再通過(guò)T4多核苷酸激酶用[γ32P]ATP標(biāo)記寡核苷酸的5’末端后，使用RNase P1將標(biāo)記的寡核苷酸酶解為核苷酸單磷酸，最后采用TLC分析32P標(biāo)記的核苷酸單磷酸。Zhong等[69]使用32P標(biāo)記的2D-TLC方法在擬南芥mRNA中鑒定了m6A，且證明m6A的含量與文獻(xiàn)報(bào)道的動(dòng)物細(xì)胞中含量相似。TLC方法分析RNA修飾，其特點(diǎn)是成本低、裝置簡(jiǎn)單、無(wú)需昂貴儀器、能實(shí)現(xiàn)快速分離，但由于其分析過(guò)程較繁瑣、涉及放射性標(biāo)記、準(zhǔn)確性有限，因此常用于定性研究。

1.5 熒光標(biāo)記法

除了化學(xué)標(biāo)記外，熒光標(biāo)記也能提高RNA修飾的檢測(cè)靈敏度。Cornelius等[70]使用BODIPY FL EDA標(biāo)記核糖核苷酸的5’-單磷酸，開(kāi)發(fā)了一種靈敏分析RNA組分的CE-LIF方法。RNA或寡核糖核苷酸被RNase P1酶解成核苷酸后，通過(guò)CE-LIF檢測(cè)熒光標(biāo)記的BODIPY偶聯(lián)物。使用該方法檢測(cè)并鑒定了果蠅、人肝、人腎和釀酒酵母RNA中的修飾核苷，包括I、Xanthosine(X)、Pseudouridine(Ψ)和Am，LODs為80～200 pmol/L。該研究表明使用BODIPY FL EDA熒光標(biāo)記核苷酸結(jié)合CE-LIF檢測(cè)具有高精確度和高靈敏度測(cè)定RNA組成的潛力。為提高液相色譜檢測(cè)DNA甲基化的分析靈敏度，Torres等[71]開(kāi)發(fā)了一種使用2-溴苯乙酮選擇性衍生化胞嘧啶并結(jié)合反相HPLC熒光分光光度法檢測(cè)DNA甲基化的方法，也適用于RNA甲基化修飾的測(cè)定。采用2-溴苯乙酮標(biāo)記后，5-mrC的LOD可達(dá)16.6 fmol，與LC-MS方法相當(dāng)。使用該方法，Barrientos等[72]分析了L.sativumRNA中的總體甲基化水平，并進(jìn)一步評(píng)估了Cd(Ⅱ)和Se(Ⅳ)脅迫對(duì)L.sativumRNA甲基化的影響。

1.6 免疫檢測(cè)法

免疫檢測(cè)法的基本原理是抗體-抗原的特異性結(jié)合。1992年，Reynaud等[73]利用單克隆抗體檢測(cè)了尿液中5-mrC、N4-Acetylcytidine(ac4C)、1-Methylinosine(m1I)、1-Methyladenosine(m1A)、7-Methylguanosine(m7G)和Ψ 6種修飾核苷。通過(guò)特異性的單克隆抗體對(duì)修飾核苷進(jìn)行定性分析；通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性的固相酶聯(lián)免疫測(cè)定法進(jìn)行定量分析。使用這種基于免疫的方法，尿液無(wú)需處理可直接分析，且修飾核苷的檢測(cè)靈敏度在pmol范圍內(nèi)。使用相同的免疫學(xué)方法，Sasco等[74]對(duì)68例乳腺癌患者尿液中的這6種修飾核苷進(jìn)行了評(píng)估，發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者尿液中的m1I和m1A顯著高于正常人。Miao等[75]建立了使用斑點(diǎn)雜交技術(shù)分析RNA羥甲基修飾的方法，提出5-hmC存在于小鼠大腦組織的RNA中，并發(fā)現(xiàn)其在1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶誘導(dǎo)的帕金森疾病小鼠模型中含量降低，暗示RNA中的5-hmC在神經(jīng)系統(tǒng)疾病上可能發(fā)揮著與DNA中的5-hmC相似的作用。Fakruddin等[76]通過(guò)基于免疫的檢測(cè)方法證明了Cdk5rap1 酶介導(dǎo)的修飾核苷2-Methylthio-N6-isopentenyladenosine(ms2i6A)只存在線(xiàn)粒體tRNA中，而不存在于細(xì)胞核RNA中。

基于免疫的檢測(cè)方法簡(jiǎn)化了樣品前處理過(guò)程，縮短了樣品前處理時(shí)間，但抗體的高度特異性是此方法用于準(zhǔn)確分析修飾核苷的前提條件。

2 RNA修飾的定位分析

前述的RNA修飾全分析只能提供RNA修飾的整體含量信息，不能提供相關(guān)的序列位點(diǎn)信息。RNA修飾的定位分析對(duì)于了解其生物學(xué)功能至關(guān)重要。測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步，特別是高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)，加速了RNA修飾的全轉(zhuǎn)錄組分布的研究。目前已經(jīng)建立了多種用于系統(tǒng)分析RNA修飾位置的方法，包括核酸內(nèi)切酶酶解法、基于質(zhì)譜分析的方法以及基于測(cè)序的方法等。

2.1 核酸內(nèi)切酶酶解法

限制性核酸內(nèi)切酶方法的原理是基于一些特殊的酶能特異性識(shí)別特定的RNA修飾。因此，通過(guò)某些核酸內(nèi)切酶酶解的模式結(jié)合凝膠電泳、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、TLC和MS等檢測(cè)方法能實(shí)現(xiàn)RNA修飾的定位分析。

Morse等[77]利用乙二醛處理結(jié)合RNase T1酶解，開(kāi)發(fā)了一種通過(guò)特異性酶解結(jié)合PCR擴(kuò)增定位RNA中I修飾的方法。首先用乙二醛處理RNA，乙二醛能同時(shí)與G和I反應(yīng)，但只有G能與乙二醛形成穩(wěn)定的加合物，且能進(jìn)一步與硼酸鹽形成更穩(wěn)定的復(fù)合物。隨后使用RNase T1酶解乙二醛化的RNA，G-乙二醛-硼酸鹽復(fù)合物對(duì)RNase T1酶解具有抗性，因此RNase T1能特異性切割I(lǐng)位點(diǎn)。最后通過(guò)RT-PCR進(jìn)一步分析由RNase T1酶解產(chǎn)生的含I的片段。使用此方法，在小鼠大腦mRNA中鑒定了兩個(gè)已知的A至I的編輯位點(diǎn)，提供了這些位點(diǎn)I存在的直接證據(jù)。該方法可以促進(jìn)RNA中I的定位分析，也為鑒定新的脫氨酶底物提供了一種新方法。Yu等[78]提出了一種基于RNase H酶解準(zhǔn)確靈敏定位RNA中2’-O-甲基化修飾的方法。使用此方法鑒定出兩個(gè)2’-O-甲基化修飾位點(diǎn)，分別為非洲爪蟾18S rRNA中的G1448和非洲爪蟾28S rRNA中的A394位點(diǎn)。此外，還能利用RNase H的位點(diǎn)特異性切割結(jié)合[γ-32P]ATP 標(biāo)記的TLC方法對(duì)Ψ修飾進(jìn)行定位分析[79]。此方法不僅能確定RNA中是否含有Ψ修飾，還能確定Ψ修飾的位點(diǎn)。

利用核酸內(nèi)切酶酶解對(duì)RNA修飾進(jìn)行定位分析需先將待研究的某一種RNA進(jìn)行分離，因此該類(lèi)方法不適用于對(duì)豐度很低的 mRNA 或者長(zhǎng)非編碼RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)上修飾的研究。芝加哥大學(xué)的 Pan 研究組開(kāi)發(fā)了一種在單核苷酸分辨率下確定mRNA和lncRNA中m6A修飾位置的新方法[80]。該方法將傳統(tǒng)的RNase H位點(diǎn)特異性酶切與連接酶連接法相結(jié)合(SCARLET)，利用SCARLET方法無(wú)需提前進(jìn)行RNA純化便可實(shí)現(xiàn)對(duì)待研究RNA的分離。該方法能精確確定mRNA/lncRNA中m6A修飾狀態(tài)，且操作簡(jiǎn)單、無(wú)需復(fù)雜儀器，為研究人員提供了一個(gè)快速、有效檢測(cè)RNA修飾的平臺(tái)。

2.2 質(zhì)譜分析法

近年來(lái)，隨著質(zhì)譜技術(shù)的快速發(fā)展以及數(shù)據(jù)分析軟件的開(kāi)發(fā)，質(zhì)譜技術(shù)在生物大分子研究方面得到了很好的應(yīng)用。近10年來(lái)，質(zhì)譜在RNA研究方面取得了顯著的進(jìn)展，研究人員開(kāi)發(fā)了一系列用于RNA修飾定位分析和RNA序列分析的方法(圖2)[81]。

2.2.1基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜分析法2000年，Kirpekar等[82]建立了基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜法(MALDI-MS)用于5S rRNA序列分析以及其中修飾的定位分析。使用特異性酶酶解RNA產(chǎn)生寡核糖核苷酸片段后，通過(guò)MALDI-MS直接分析寡核糖核苷酸片段。通過(guò)比較實(shí)驗(yàn)獲得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)與從基因序列預(yù)測(cè)的數(shù)據(jù)來(lái)鑒定帶有修飾的寡核糖核苷酸片段。為了更快速、靈敏、精確地繪制RNA修飾譜圖，采用兩種RNase同時(shí)酶解RNA，在3種細(xì)菌的5S rRNA中成功定位了甲基化胞嘧啶。隨后該研究組建立了一系列用于定位RNA修飾的MALDI-MS/MS方法[83-84]。該方法靈敏度高、對(duì)雜質(zhì)的耐受性好，適用于引物延伸或色譜分析技術(shù)不適用的情況。

2.2.2液相色譜-質(zhì)譜分析法基于LC-MS的方法用于RNA修飾定位分析，通常需RNase酶解以獲得RNA短片段[29]。對(duì)相應(yīng)的寡核糖核苷酸片段進(jìn)行LC-MS/MS分析，可得到確切的堿基組成和序列信息，通過(guò)與基因序列數(shù)據(jù)比對(duì)能確定RNA片段上修飾的序列位點(diǎn)。McCloskey課題組在1993年建立了一種LC-ESI-MS方法用于RNA修飾的定位分析[85]，成功定位了E.coli23S rRNA中的3-Methylpseudouridine(m3Ψ)[86]，超嗜熱古細(xì)菌P.occultum5S rRNA中的ac4C和N4-acetyl-2’-O-methylcytidine(ac4Cm)[87]，以及E.colitmRNA中的5-Methyluridine(m5U)和Ψ[88]等。

為提高檢測(cè)靈敏度和改善RNA修飾片段的覆蓋度，Cao等[89]通過(guò)LC-MS/MS開(kāi)發(fā)了質(zhì)量排除列表方法用于RNA修飾譜圖的建立。通過(guò)質(zhì)量排除列表去除未修飾的序列，只分析含有修飾的酶解產(chǎn)物以產(chǎn)生MS/MS譜圖。結(jié)果顯示，基于DNA的排除列表可檢測(cè)的RNA修飾酶解產(chǎn)物的數(shù)量增加約20%，從而有效擴(kuò)大了酶解產(chǎn)物的MS/MS覆蓋范圍，簡(jiǎn)化了LC-MS/MS譜圖。Yamauchi等[90]開(kāi)發(fā)了一種基于MS直接測(cè)定RNA中Ψ修飾的方法。通過(guò)精確測(cè)量由碰撞誘導(dǎo)解離質(zhì)譜產(chǎn)生的特征性雙脫水核苷陰離子([C9H7N2O4]1-，m/z207.04)來(lái)確定含Ψ的RNA片段，使用Pseudo-MS3確定含Ψ的核苷酸序列。采用此方法鑒定了人類(lèi)剪接體snRNA中所有已知的Ψ位點(diǎn)，并在U5和U6 snRNA中新發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)Ψ位點(diǎn)。

圖2 基于質(zhì)譜分析的RNA修飾定位分析方法示意圖[81]Fig.2 Schematic diagram of methods for the MS-based location analysis of RNA modifications[81]

2.2.3Top-down質(zhì)譜分析法大多數(shù)基于MS方法的研究對(duì)象僅限于RNA寡核苷酸片段，難以獲得完整的RNA片段分析。采用Top-down質(zhì)譜分析法可解決此問(wèn)題。該方法無(wú)需使用核酸酶酶解，避免了繁瑣的酶切和寡核糖核苷酸的分離步驟。通過(guò)結(jié)合高分辨質(zhì)譜儀與多種核糖核苷酸的碎裂方式，如電子脫離解離(EDD)、碰撞活化解離(CAD)、碰撞誘導(dǎo)解離(CID)等，可對(duì)完整的RNA分子直接進(jìn)行質(zhì)譜分析，能提供RNA的序列信息，并能對(duì)RNA轉(zhuǎn)錄后修飾進(jìn)行鑒定、相對(duì)定量和定位分析[81，91]。

2009年，McLuckey等[92]通過(guò)離子阱CID的碎裂方式實(shí)現(xiàn)了tRNA的Top-down質(zhì)譜分析，序列覆蓋率達(dá)60%。此方法減少了光譜重疊和電荷態(tài)模糊的產(chǎn)生，簡(jiǎn)化了產(chǎn)物離子譜的解譜過(guò)程，更易于產(chǎn)物離子的鑒定。由于U到Ψ的轉(zhuǎn)化未發(fā)生相對(duì)分子質(zhì)量變化，因此通過(guò)對(duì)RNA或其片段的簡(jiǎn)單質(zhì)譜分析無(wú)法區(qū)分異構(gòu)體U和Ψ。根據(jù)CAD解離RNA時(shí)U(N-糖苷鍵)和Ψ(C-糖苷鍵)的不同碎裂行為，Taucher等[93]將Top-down質(zhì)譜分析法用于RNA中Ψ修飾的定位分析。然而，此方法只能用于標(biāo)準(zhǔn)RNA樣品中Ψ的分析，對(duì)于實(shí)際樣品中Ψ的分析尚需進(jìn)一步改善。2012年，Breuker實(shí)驗(yàn)室[94]建立了結(jié)合EDD與CAD 兩種碎裂方式的Top-down質(zhì)譜分析法鑒定了RNA修飾的類(lèi)型和位置。該法對(duì)22 nt和34 nt長(zhǎng)度的RNA分析的覆蓋率分別為100%和97%，對(duì)轉(zhuǎn)錄后高度修飾的tRNA 分析的覆蓋率亦可達(dá)到 89% 以上。這表明結(jié)合多種解離數(shù)據(jù)可以提供用于分析RNA修飾的更廣泛的序列信息，能更加精確地確定修飾的類(lèi)型和位置。近期，Glasner等[91]使用類(lèi)似的方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)RNA中異構(gòu)體或非異構(gòu)形式的甲基化修飾(m6A，5-mrC，m5U和3-Methyluridine(m3U))的相對(duì)定量和直接定位分析。

盡管Top-down質(zhì)譜分析法對(duì)于儀器和樣品的要求很高，但其諸多優(yōu)點(diǎn)使之成為RNA修飾研究中頗有前景的方法之一[91]。

2.2.4穩(wěn)定同位素標(biāo)記-質(zhì)譜分析法代謝組學(xué)中的穩(wěn)定同位素標(biāo)記法也可用于RNA修飾研究中。Li等[95]提出了一種基于兩個(gè)RNA樣本的差異標(biāo)記的RNA酶解物比較分析法(Comparative analysis of RNA digests，CARD)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)RNA修飾的簡(jiǎn)單快速定位。在RNase T1酶解RNA過(guò)程中，使用16O標(biāo)記參考RNA樣品(已知其完整序列及修飾信息)，18O標(biāo)記待測(cè)RNA樣品(其序列及修飾信息未知)。通過(guò)組合兩個(gè)酶解物進(jìn)行LC-MS分析，當(dāng)參考物和待測(cè)物之間共享相同序列或轉(zhuǎn)錄后修飾時(shí)，將顯示為以2 Da分開(kāi)的二重聯(lián)物；當(dāng)兩者之間的序列或修飾有差異時(shí)，將產(chǎn)生可用于進(jìn)一步表征的序列。通過(guò)直接比較待測(cè)RNA與參考RNA的序列和修飾信息可鑒定RNA修飾的序列特異性差異。Li等[96]應(yīng)用CARD方法對(duì)E.coli的tRNA進(jìn)行了序列分析。然而，由于RNase酶解后的tRNA樣品中存在天然同位素13C和15N引起的譜圖卷積，使得數(shù)據(jù)分析具有挑戰(zhàn)性。為解決此問(wèn)題，Wetzel等[97]通過(guò)使用富含12C不含13C的培養(yǎng)基，顯著降低了在CARD實(shí)驗(yàn)過(guò)程的同位素效應(yīng)，使tRNA酶解產(chǎn)物的檢測(cè)得到了35%的改善。Taoka等[98]提出了穩(wěn)定同位素標(biāo)記結(jié)合LC-MS的分析方法，用于RNA轉(zhuǎn)錄后修飾的系統(tǒng)檢測(cè)。該方法將體外轉(zhuǎn)錄的重同位素標(biāo)記的參考RNA等量摻入樣品RNA溶液中，使用RNase酶解混合物后進(jìn)行LC-MS分析。通過(guò)分析保留時(shí)間的移位和MS信號(hào)定量檢測(cè)轉(zhuǎn)錄后修飾的寡核苷酸；通過(guò)檢測(cè)僅包含輕鏈片段的色譜峰鑒定修飾位點(diǎn)。利用這種方法，在粟酒裂殖酵母的rRNA中鑒定了122個(gè)修飾位點(diǎn)，并獲得單核苷酸分辨率的真核生物rRNA轉(zhuǎn)錄后修飾譜圖。隨后Taoka研究小組[99]運(yùn)用該法研究了釀酒酵母rRNA的完整化學(xué)結(jié)構(gòu)，并在25S rRNA中第2 345位檢測(cè)到以前未發(fā)現(xiàn)的Ψ。

這種以穩(wěn)定同位素標(biāo)記為基礎(chǔ)的LC-MS方法已被證明是一種有價(jià)值的工具，被廣泛用于不同RNA種類(lèi)的修飾研究。

2.2.5化學(xué)標(biāo)記-質(zhì)譜分析法由于有些轉(zhuǎn)錄后修飾核苷(例如Ψ)與正常核苷相比相對(duì)分子質(zhì)量不變，因此采用正常的MS分析方法無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)這種特定修飾的檢測(cè)。為解決此問(wèn)題，Patteson等[100]開(kāi)發(fā)了一種化學(xué)標(biāo)記結(jié)合MALDI-MS對(duì)RNA中Ψ修飾進(jìn)行定位分析的方法。該方法利用N-環(huán)己基-N’-(2-嗎啉乙基)碳二亞胺對(duì)甲苯磺酸鹽(CMC)選擇性標(biāo)記Ψ，通過(guò)比較標(biāo)記前后的質(zhì)譜圖可在完整的RNA中鑒定Ψ及其個(gè)數(shù)；進(jìn)一步對(duì)RNase T1酶切產(chǎn)物進(jìn)行MALDI-MS分析，能確定Ψ修飾的序列位置。該方法能直接測(cè)定RNA中的Ψ修飾，還可與其他定位方法聯(lián)用以完全表征存在于RNA中的轉(zhuǎn)錄后修飾。此外，Mengel-Jorgensen等[101]使用類(lèi)似的化學(xué)標(biāo)記質(zhì)譜法分析了tRNA中的Ψ修飾和其他修飾。該方法首先使用丙烯腈將tRNA氰乙基化，隨后用RNase A或RNase T1酶解tRNA以進(jìn)行MALDI-MS分析。氰乙基化的寡核苷酸會(huì)產(chǎn)生1個(gè)53.0 Da的質(zhì)量增加，通過(guò)比較未處理和丙烯腈處理的樣品的質(zhì)譜圖可以確定Ψ修飾的位點(diǎn)。使用該方法，成功地在E.coli的tRNATyrII中鑒定了1個(gè)4-Thiouridine(s4U)位點(diǎn)和1個(gè)Ψ位點(diǎn)。

2.3 高通量測(cè)序分析法

近年來(lái)，高通量測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步極大地推動(dòng)了表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展?；诟咄繙y(cè)序技術(shù)的分析方法是目前定位分析RNA修飾的重要方法(圖3)。

2.3.1逆轉(zhuǎn)錄-測(cè)序分析當(dāng)RNA中修飾的堿基影響Watson-Crick堿基互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，會(huì)導(dǎo)致該修飾位點(diǎn)的逆轉(zhuǎn)錄停止或非互補(bǔ)性堿基的錯(cuò)誤摻入[102]。通過(guò)高通量測(cè)序?qū)τ纱水a(chǎn)生的提前終止的互補(bǔ)脫氧核糖核酸(Complementary DNA，cDNA)或含錯(cuò)配堿基的cDNA進(jìn)行分析，可以提供全面的RNA修飾的位置信息。

RNA中普遍存在的A至I的編輯在轉(zhuǎn)錄組中發(fā)揮著重要作用[103]。已知I在逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中會(huì)與C發(fā)生錯(cuò)配，在后續(xù)的測(cè)序中該位點(diǎn)以G作為輸出信號(hào)，通過(guò)與基因組DNA比較，可以辨別實(shí)際基因組中突變的錯(cuò)誤摻入信號(hào)[102]。Alon等[104]利用這一特性結(jié)合高通量測(cè)序并輔以生物信息學(xué)分析，系統(tǒng)地鑒定了人腦組織的成熟miRNA中的A至I編輯。通過(guò)該方法，成功鑒定了許多已知的成熟miRNA中的I編輯位點(diǎn)，并揭示了17個(gè)新的位點(diǎn)，其中12個(gè)是位于miRNA的識(shí)別位點(diǎn)。

m1A、1-Methylguanosine(m1G)和3-Methylcytidine(m3C)是tRNA中的普遍修飾，在tRNA的生物合成、穩(wěn)定性和功能活性中起重要作用[105]。Cozen等[105]利用這些修飾會(huì)引起逆轉(zhuǎn)錄終止的性質(zhì)在tRNA中鑒定其位點(diǎn)，提出了一種AlkB促進(jìn)的RNA甲基化測(cè)序方法(AlkB-facilitated RNA methylation sequencing，ARM-seq)。在ARM-seq中，通過(guò)AlkB處理RNA去除m1A、m1G和m3C的甲基化修飾以獲得全長(zhǎng)的cDNA；然而，未經(jīng)處理的RNA將產(chǎn)生提前終止的cDNA。因此，通過(guò)比較處理樣品和未處理樣品的cDNA可以鑒定RNA中的這些甲基化修飾位點(diǎn)。使用這種比較甲基化分析法，該研究提供了m1A、m1G和m3C的全轉(zhuǎn)錄組譜圖，并揭示了大量未曾檢測(cè)到的來(lái)源于tRNA的甲基化小RNA。

逆轉(zhuǎn)錄-測(cè)序分析法無(wú)需復(fù)雜的樣品前處理，但仍存在一些問(wèn)題。RNA的多級(jí)結(jié)構(gòu)以及修飾本身的固有性質(zhì)易產(chǎn)生假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果。另外，RNA的易降解性也可能使數(shù)據(jù)分析變得復(fù)雜。因此，需要多種方法確認(rèn)基于逆轉(zhuǎn)錄方法的分析結(jié)果。

圖3 基于測(cè)序分析的RNA修飾定位分析方法示意圖Fig.3 Schematic diagram of methods for the sequencing-based location analysis of RNA modifications

2.3.2化學(xué)標(biāo)記-測(cè)序分析化學(xué)標(biāo)記后的RNA修飾會(huì)改變其逆轉(zhuǎn)錄特征，如逆轉(zhuǎn)錄終止或逆轉(zhuǎn)錄堿基錯(cuò)配。結(jié)合高通量測(cè)序，研究者開(kāi)發(fā)了一系列化學(xué)標(biāo)記-測(cè)序分析法用于核酸修飾的定位研究。Suzuki等[106]開(kāi)發(fā)了化學(xué)標(biāo)記結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄-測(cè)序的肌苷定位分析方法(Inosine chemical erasing followed by sequencing，ICE-seq)。該方法用丙烯腈處理RNA，通過(guò)邁克爾加成特異性氰乙基化肌苷形成N1-氰乙基肌苷。N1-氰乙基可以破壞I與C的Watson-Crick堿基配對(duì)，導(dǎo)致逆轉(zhuǎn)錄終止，隨后可通過(guò)測(cè)序鑒定I。該研究確定了5 072個(gè)I編輯位點(diǎn)，其中包括4 395個(gè)新位點(diǎn)。

此外，Ψ是RNA中最豐富的修飾之一[102]。Ψ的全轉(zhuǎn)錄組位點(diǎn)的測(cè)定依賴(lài)于用化學(xué)試劑CMC標(biāo)記Ψ，形成的CMC-Ψ加合物能導(dǎo)致逆轉(zhuǎn)錄終止，從而實(shí)現(xiàn)Ψ的單堿基分辨率檢測(cè)。CMC可?；疪NA中G的N1位置處，U的N3位置處，以及Ψ的N1和N3位置處，在堿性條件下(pH 10.4)CMC-G和CMC-U的加合物會(huì)水解，Ψ上只保留N3位置的CMC加合物[107]。利用類(lèi)似的原理，已開(kāi)發(fā)了3種基于CMC標(biāo)記分析Ψ修飾位點(diǎn)的方法，分別為Pseudo-seq[108]、Ψ-seq[109]和PSI-seq(Pseudouridine site identification sequencing)[110]。研究人員以單堿基分辨率成功鑒定了酵母mRNA中約50～100個(gè)Ψ修飾位點(diǎn)和人類(lèi)mRNA中約100～400個(gè)Ψ修飾位點(diǎn)[108-110]。但上述方法不能預(yù)先富集含Ψ的RNA片段。Yi課題組[111]利用“點(diǎn)擊”化學(xué)開(kāi)發(fā)了一種CeU-seq(N3-CMC-enriched pseudouridine sequencing)分析方法，可對(duì)含有Ψ的RNA片段預(yù)富集，能實(shí)現(xiàn)在單堿基分辨率下的Ψ檢測(cè)。在CeU-seq中，使用疊氮基化的CMC衍生物標(biāo)記Ψ，借助“點(diǎn)擊”化學(xué)使N3-CMC-Ψ加合物與生物素偶聯(lián)，通過(guò)生物素預(yù)富集含Ψ的RNA片段并進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)CeU-seq，研究者在1 929個(gè)人類(lèi)轉(zhuǎn)錄本中鑒定了2 084個(gè)Ψ修飾位點(diǎn)。該方法為Ψ介導(dǎo)的表觀遺傳調(diào)控的功能研究提供了有力工具。

2.3.3化學(xué)轉(zhuǎn)化-測(cè)序分析法亞硫酸氫鹽測(cè)序法已被廣泛用于DNA中的5-mC定位分析。同樣的方法也能應(yīng)用于RNA中的5-mC定位分析，由于RNA易降解，因此需對(duì)該方法進(jìn)行改良。目前，基于亞硫酸氫鹽測(cè)序的方法已被用于不同物種RNA中5-mC的定位分析，包括果蠅[112]、人類(lèi)[113]、古細(xì)菌[114]、布氏錐蟲(chóng)[115]和植物[116]等。

Squires等[113]將亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化與高通量測(cè)序技術(shù)相結(jié)合，在人類(lèi)的mRNA和ncRNA中鑒定了10 275個(gè)5-mC位點(diǎn)，表明這種修飾在細(xì)胞轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控中起著潛在的作用。Burgess等[116]使用RNA亞硫酸氫鹽測(cè)序法以單核苷酸分辨率鑒定了6種不同植物中3種亞細(xì)胞(細(xì)胞核、線(xiàn)粒體、葉綠體)轉(zhuǎn)錄組中的tRNA和rRNA的5-mC位點(diǎn)。但RNA的亞硫酸氫鹽測(cè)序法存在局限，需要不斷優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。如未修飾的胞嘧啶的不完全脫氨，可能產(chǎn)生假陽(yáng)性；過(guò)度的脫氨和RNA的降解會(huì)導(dǎo)致低豐度RNA物種的覆蓋率不足[102]。此外，在該反應(yīng)條件下DNA比RNA穩(wěn)定，因此必須嚴(yán)格排除DNA的污染[102]。另外，因RNA在高pH值環(huán)境下易水解，所以需在低堿性的條件下進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化。

2’-O-甲基化是rRNA上最豐富的修飾，對(duì)核糖體生物合成、mRNA選擇性和翻譯保真度至關(guān)重要。Birkedal等[117]開(kāi)發(fā)了一種堿性水解結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)，用于定位酵母核糖體中2’-O-甲基化(Ribose methylation sequencing，RiboMeth-seq)。該方法在rRNA中不僅鑒定了已知的2’-O-甲基化修飾位點(diǎn)，而且發(fā)現(xiàn)了一些新的2’-O-甲基化修飾位點(diǎn)。隨后，Krogh等[118]將RiboMeth-seq應(yīng)用于分析HeLa細(xì)胞rRNA中的2’-O-甲基化，鑒定了包括兩個(gè)新位點(diǎn)在內(nèi)的106個(gè)修飾位點(diǎn)。此研究使用高通量測(cè)序方法繪制了人類(lèi)rRNA中2’-O-甲基化修飾的譜圖，可為研究不同生理或病理環(huán)境下rRNA甲基化的作用提供平臺(tái)。

RiboMeth-seq方法能達(dá)到單堿基分辨率，且能用于甲基化率的相對(duì)定量[102]。然而，該方法僅適用于高豐度RNA，對(duì)于低豐度RNA(如mRNA)中存在的2’-O-甲基化位點(diǎn)的分析不適用。最近，He課題組[119]利用2’-OH和2’-O-甲基化核苷的不同化學(xué)性質(zhì)，基于氧化裂解開(kāi)發(fā)了用于人類(lèi)mRNA中2’-O-甲基化修飾的分析方法Nm-seq。該方法通過(guò)氧化-消除-去磷酸化的循環(huán)將RNA片段從3’端到5’端無(wú)2’-O-甲基化修飾的核苷均去除，直至暴露出2’-O-甲基化修飾的核苷。在最后一個(gè)循環(huán)中不進(jìn)行去磷酸化，導(dǎo)致2’端不含修飾的核苷的3’-磷酸不能進(jìn)行下一步的連接，而2’-O-甲基化修飾的核苷的3’-OH可以進(jìn)一步連接3’-適配體并通過(guò)PCR擴(kuò)增進(jìn)行富集，隨后進(jìn)行高通量測(cè)序。利用此方法在哺乳動(dòng)物mRNA中發(fā)現(xiàn)了數(shù)千個(gè)2’-O-甲基化位點(diǎn)，其中2’-O-甲基化位點(diǎn)主要富集在編碼序列中，并有一個(gè)高度富集的AGAUC序列特征。

2.3.4免疫沉淀-測(cè)序分析大多數(shù)RNA修飾以低豐度存在，因此在分析前有必要對(duì)含某些修飾的RNA片段進(jìn)行富集。基于抗體的親和富集通過(guò)抗體-抗原的特異性結(jié)合而實(shí)現(xiàn)。

由于缺乏區(qū)分m6A與A的化學(xué)方法，使用m6A特異性抗體預(yù)富集含m6A的RNA片段結(jié)合高通量測(cè)序可實(shí)現(xiàn)對(duì)m6A的特異性檢測(cè)。2012年，有兩個(gè)課題組基于m6A特異性抗體結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)建立了m6A免疫沉淀測(cè)序方法(m6A-specific methyled RNA immunoprecipitation coupled with next-generation sequencing，MeRIP-seq/m6A-seq)，生成了分辨率為100～200 nt的全轉(zhuǎn)錄組范圍的m6A譜圖[120-121]。研究顯示，源自7 000多個(gè)人類(lèi)基因的轉(zhuǎn)錄本中有12 000多個(gè)m6A甲基化修飾位點(diǎn)，且位點(diǎn)一般富集在終止密碼子附近和3’非翻譯區(qū)。

除了哺乳動(dòng)物，其他物種的mRNA中也廣泛存在m6A修飾。Schwartz等[122]使用MeRIP-seq在近似單核苷酸水平上鑒定了酵母減數(shù)分裂1 183個(gè)轉(zhuǎn)錄本中的1 308個(gè)m6A位點(diǎn)，并提出m6A在酵母減數(shù)分裂期間是一種動(dòng)態(tài)調(diào)控的甲基化修飾。此外，在植物中，m6A是mRNA中一個(gè)高度保守的修飾，不僅在終止密碼子附近和3’非翻譯區(qū)內(nèi)富集，而且在起始密碼子周?chē)控S富(16%)[123]，顯示了m6A在植物基因表達(dá)中的重要調(diào)控作用。然而由于免疫沉淀的固有缺陷，MeRIP-seq/m6A-seq的方法無(wú)法在全轉(zhuǎn)錄組水平上鑒定m6A的精確位置。為實(shí)現(xiàn)m6A甲基化的單堿基分辨率檢測(cè)，基于MeRIP-seq的優(yōu)化方法被開(kāi)發(fā)：在m6A-CLIP(m6A-cross-linking immunoprecipitation)方法[124]和miCLIP(m6A individual-nucleotide-resolution cross-linking and immunoprecipitation)方法[125]中，使用254 nm UV照射誘導(dǎo)抗體與含m6A的RNA之間形成共價(jià)交聯(lián)。在逆轉(zhuǎn)錄中，抗體-RNA交聯(lián)位點(diǎn)會(huì)引起cDNA突變或提前終止，可通過(guò)高通量測(cè)序以單堿基分辨率識(shí)別m6A位點(diǎn)。

類(lèi)似地，Chen等[126]開(kāi)發(fā)了PA-m6A-seq方法(Photo-crosslinking-assisted m6A sequencing)，將可以提高交聯(lián)效率的光反應(yīng)性核苷類(lèi)似物s4U加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，使之摻入新合成的RNA分子中；免疫沉淀后，在365 nm的UV照射下，抗體和含m6A的RNA之間形成共價(jià)交聯(lián)，結(jié)合的s4U可在交聯(lián)位點(diǎn)導(dǎo)致T到C的轉(zhuǎn)變。因此，該方法可以實(shí)現(xiàn)單堿基分辨率識(shí)別m6A修飾位點(diǎn)。除m6A外，m1A是RNA中另一種普遍的動(dòng)態(tài)修飾。Li等[127]基于m1A能造成逆轉(zhuǎn)錄終止的固有特性，結(jié)合免疫沉淀測(cè)序開(kāi)發(fā)了新技術(shù)m1A-ID-seq。利用這一技術(shù)，成功實(shí)現(xiàn)了人類(lèi)細(xì)胞全轉(zhuǎn)錄組水平上m1A修飾位點(diǎn)的鑒定，在mRNA和ncRNA中鑒定出901個(gè)m1A位點(diǎn)，并發(fā)現(xiàn)m1A主要位于mRNA的5’非翻譯區(qū)。該研究揭示了m1A是哺乳動(dòng)物mRNA中的一種新的、動(dòng)態(tài)的、可逆的表觀轉(zhuǎn)錄組標(biāo)志物，為m1A修飾參與基因表達(dá)調(diào)控的研究提供了重要工具。

Dominissini等[128]建立了m1A-seq(m1A-specific methyled RNA immunoprecipitation coupled with next-generation sequencing)方法鑒定不同真核生物mRNA中的m1A修飾。研究發(fā)現(xiàn)m1A修飾發(fā)生在真核細(xì)胞中的數(shù)千個(gè)不同基因轉(zhuǎn)錄本上。此外，Delatte等[129]利用hMeRIP-seq(Hydroxymethylated RNA immunoprecipitation followed by sequencing)方法在果蠅轉(zhuǎn)錄組中鑒定了超過(guò)3 000個(gè)5-hmC的峰，繪制了5-hmC在全轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)的修飾譜圖，揭示了這一修飾的分布、位置和功能。研究發(fā)現(xiàn)5-hmC優(yōu)先呈現(xiàn)在聚腺苷酸化的RNA中，且RNA的羥甲基化有利于mRNA翻譯。

基于免疫沉淀的方法分析RNA修飾的位置也存在問(wèn)題，如由于抗體的特異性差導(dǎo)致與其他修飾交叉反應(yīng)。因此，科研人員有必要使用兩種以上的抗體進(jìn)行交叉驗(yàn)證。此外，商品化的RNA修飾抗體種類(lèi)較少[102]。

2.4 單分子測(cè)序

高通量技術(shù)能實(shí)現(xiàn)快速高通量的測(cè)序，但涉及樣品擴(kuò)增，可能引入錯(cuò)誤堿基或?qū)е聣A基修飾信息的丟失[130]。第三代測(cè)序技術(shù)無(wú)需樣品擴(kuò)增，可進(jìn)行單分子測(cè)序，以實(shí)現(xiàn)RNA修飾的直接定位分析，該技術(shù)包括單分子實(shí)時(shí)(Single-molecule real-time，SMRT)測(cè)序、單分子納米孔測(cè)序等。

Flusberg等[131]在2010年建立了SMRT測(cè)序進(jìn)行DNA甲基化分析，通過(guò)對(duì)DNA聚合酶的工作狀態(tài)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，根據(jù)聚合酶對(duì)模板鏈上正常堿基和修飾堿基的不同動(dòng)力學(xué)信號(hào)，可直接檢測(cè)DNA甲基化。Korlach等[132]對(duì)該方法進(jìn)行了改進(jìn)，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄結(jié)合SMRT的方法成功定位了RNA中m6A的修飾位點(diǎn)。將DNA 聚合酶替換為源自 HIV 的逆轉(zhuǎn)錄酶，隨后實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)逆轉(zhuǎn)錄酶的信號(hào)。在RT-SMRT分析中，逆轉(zhuǎn)錄酶通過(guò)m6A時(shí)的動(dòng)力學(xué)信號(hào)明顯不同于對(duì)照RNA中A的動(dòng)力學(xué)信號(hào)，與天然的A相比，在m6A位置的脈沖頻率明顯降低。除了m6A外，該方法也適用于許多其他修飾的定位分析。然而，SMRT對(duì)RNA修飾的定位分析目前主要用于合成的RNA，用于實(shí)際樣品的RNA修飾分析仍需進(jìn)一步完善。

除了SMRT測(cè)序外，納米孔測(cè)序技術(shù)也被用于修飾核苷的單分子檢測(cè)。納米孔技術(shù)利用電壓驅(qū)動(dòng)分子穿過(guò)納米孔，不同的核苷通過(guò)納米孔會(huì)產(chǎn)生不同的阻斷電流，根據(jù)阻斷電流的變化可以區(qū)分正常核苷與修飾核苷[133]。由于納米孔技術(shù)能實(shí)現(xiàn)單個(gè)核酸分子的分析，且不需對(duì)核苷酸進(jìn)行標(biāo)記，因此基于納米孔的技術(shù)具有分析RNA修飾的潛力。Ayub等[134]建立了使用α-溶血素納米孔識(shí)別寡核苷酸中RNA堿基的方法。通過(guò)特征化的電流監(jiān)測(cè)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)RNA中4種核堿基(包括鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶)的區(qū)分。另外，還可區(qū)分包括I、m6A和5-mrC在內(nèi)的修飾的核堿基。2016年，英國(guó)牛津納米孔技術(shù)公司的科研人員利用一個(gè)納米孔陣列成功地將DNA納米孔測(cè)序技術(shù)拓展成RNA納米孔測(cè)序技術(shù)[135]。

納米孔測(cè)序技術(shù)是不依賴(lài)逆轉(zhuǎn)錄和PCR直接測(cè)序RNA的技術(shù)，與其他RNA測(cè)序方法相比有許多優(yōu)勢(shì)：無(wú)需擴(kuò)增，不存在PCR或逆轉(zhuǎn)錄的偏倚；直接測(cè)定RNA，能檢測(cè)核苷類(lèi)似物；能產(chǎn)生全長(zhǎng)的、特定的RNA序列，對(duì)剪接變體的研究特別有用[135]。這將提高RNA分析的易用性和速度，同時(shí)產(chǎn)生更豐富的生物信息。

由于RNA分子自身易發(fā)生折疊，易高度結(jié)構(gòu)化，需在納米孔測(cè)序之前消除RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，因此RNA的單分子直接測(cè)序更具挑戰(zhàn)。此外，RNA比DNA更易降解，在測(cè)序較長(zhǎng)RNA鏈時(shí)，可能會(huì)造成分析結(jié)果的不準(zhǔn)確。因此，還需不斷改進(jìn)技術(shù)以實(shí)現(xiàn)RNA單分子測(cè)序的廣泛應(yīng)用。不難預(yù)料，單分子測(cè)序未來(lái)將成為研究RNA修飾的強(qiáng)有力工具。

2.5 冷凍電鏡分析

冷凍電鏡技術(shù)是應(yīng)用冷凍固定技術(shù)和透射電子顯微鏡觀察樣品的顯微技術(shù)，能實(shí)現(xiàn)物質(zhì)在近原子水平的高分辨率上的三維立體成像，已被有效地用于生物大分子的分析。

2015年，Khatter等[136]運(yùn)用冷凍電鏡技術(shù)確定了平均分辨率為3.6?的人類(lèi)80S核糖體結(jié)構(gòu)，提供了核苷酸堿基的位置信息，為研究人類(lèi)核糖體與抗生素的配體復(fù)合物奠定了基礎(chǔ)。最近，Natchiar等[137]使用高分辨率的單顆粒冷凍電鏡觀察到了人類(lèi)80S核糖體RNA上的化學(xué)修飾，并討論了rRNA修飾位點(diǎn)的三維定位和結(jié)構(gòu)意義。該研究在人類(lèi)80S核糖體RNA上鑒定了136個(gè)修飾位點(diǎn)，其中新發(fā)現(xiàn)了52 個(gè)位點(diǎn)，同時(shí)也有一些之前鑒定的位點(diǎn)消失，這可能是由于細(xì)胞類(lèi)型的差異所致。為研究rRNA在藥物結(jié)合的特異性中的作用，該研究還觀察了人類(lèi)核糖體與3種抑制劑相互作用時(shí)的大分子結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明rRNA存在特定的修飾位點(diǎn)，可作為選擇性配體相互作用的靶點(diǎn)，為新藥的設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)提供了一個(gè)新思路。此項(xiàng)研究是冷凍電鏡技術(shù)進(jìn)入表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的重要一步，為RNA修飾的分析提供了一種高分辨率的新方法。

3 結(jié)論與展望

分析技術(shù)的革新推動(dòng)了RNA修飾研究的進(jìn)展，系統(tǒng)研究這些修飾的功能將有助于增強(qiáng)對(duì)細(xì)胞發(fā)育過(guò)程和疾病形成等基本問(wèn)題的理解。破譯RNA修飾的生物學(xué)功能需要高靈敏度、高準(zhǔn)確度的方法，這也將促進(jìn)相關(guān)技術(shù)和軟件的開(kāi)發(fā)。

檢測(cè)RNA修飾的主要挑戰(zhàn)是高通量檢測(cè)方法的精度、靈敏度、定量能力和分辨率，以及待解決的諸多問(wèn)題。如，目前技術(shù)的靈敏度尚有不足，無(wú)法對(duì)少量稀有樣本開(kāi)展研究；無(wú)法對(duì)所有RNA修飾進(jìn)行精確定量研究；無(wú)法確定1個(gè)RNA分子上不同修飾的數(shù)量；無(wú)法通過(guò)一次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)多種不同的修飾等。對(duì)于RNA修飾的定位研究、測(cè)序深度和所使用的生物信息學(xué)軟件也會(huì)影響RNA修飾的位點(diǎn)分析。

未來(lái)RNA修飾的研究可從以下方面努力：①通過(guò)優(yōu)化檢測(cè)方法以實(shí)現(xiàn)單堿基分辨率并量化RNA修飾。②高通量的測(cè)序方法對(duì)于全面定位RNA修飾是必要的，但目前僅限于少數(shù)修飾的研究。③現(xiàn)有的RNA修飾測(cè)序方法不能直接應(yīng)用于單細(xì)胞，RNA修飾的單細(xì)胞測(cè)序?qū)沂綬NA修飾在細(xì)胞發(fā)育和分化過(guò)程中的作用至關(guān)重要。④不同修飾之間的豐度差異很大，因此，開(kāi)發(fā)可在同一個(gè)分子上同時(shí)識(shí)別多個(gè)修飾的高通量技術(shù)將非常有用。此外，質(zhì)譜技術(shù)的進(jìn)步和測(cè)序技術(shù)的革新也會(huì)促進(jìn)RNA修飾的功能研究。新修飾的數(shù)目仍在增加，已知的修飾也可能發(fā)生在新的位點(diǎn)和不同的RNA類(lèi)型中。隨著技術(shù)的不斷改進(jìn)，對(duì)RNA修飾的研究將會(huì)促進(jìn)對(duì)其功能的深入認(rèn)識(shí)。