響應(yīng)面法優(yōu)化精制沙丁魚油乙酯化工藝

張蒙娜,宋恭帥,彭 茜,薛 靜,戴志遠(yuǎn),2

(1.浙江工商大學(xué) 海洋食品研究院,浙江杭州 310000；2.浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江杭州 310000)

沙丁魚(Sardinellasp.)是一種小型集群性洄游魚類,富含蛋白質(zhì)、多不飽和脂肪酸、維生素、微量元素等營養(yǎng)成分,分布于東北大西洋、地中海等海域,具有生長快、繁殖能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),被大量捕獲和消費(fèi)。除小部分流通于零售市場外,其主要作為進(jìn)一步加工的原材料,如加工成油浸罐頭、冷凍魚丸、油炸魚丸、魚香腸等多種方便食品[1]。此外,黃嘉成等[2]以沙丁魚為原料,制備沙丁魚ACE抑制肽,通過工藝優(yōu)化,最終使水解蛋白肽的ACE抑制率達(dá)到73.44%,實(shí)現(xiàn)了對低值沙丁魚的高效利用。沙丁魚含油量較高,其中多不飽和脂肪酸含量高,故將沙丁魚作為生產(chǎn)精制魚油的原料具有較大的經(jīng)濟(jì)價值[3]。魚油中的n-3系列多不飽和脂肪酸,對人類的健康和營養(yǎng)具有重要作用[4]。其中,二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid,EPA)、二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA)是存在于大腦、視網(wǎng)膜、精子及神經(jīng)組織中的重要生物活性物質(zhì),具有預(yù)防動脈硬化和心腦血管疾病、調(diào)節(jié)機(jī)體脂質(zhì)代謝、預(yù)防癌癥、防止大腦衰老、抗炎作用等生理保健功能[5-10]。

魚油產(chǎn)品按存在形式的不同,可分為甘油三酯型和乙酯型。甘油三酯型的EPA和DHA含量較低[11],而乙酯型魚油具有易富集不飽和脂肪酸、沸點(diǎn)低、無毒副作用、能耗低及便于包裝和運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)[12],因此,將精制魚油經(jīng)乙酯化工藝處理,獲得乙酯型魚油從而更有效地富集n-3系列不飽和脂肪酸,滿足消費(fèi)者的需求,是當(dāng)今魚油行業(yè)值得研究的一個方面[13-15]。魚油乙酯化的方法主要有3種:酶催化法、酸催化法和堿催化法[16]。酶催化法所需酶制劑價格昂貴,不適合規(guī)?；a(chǎn)[17],而酸催化法多應(yīng)用于酸價高的甘油酯且反應(yīng)速率慢[18]。堿催化法一般采用低成本的NaOH或KOH作為催化劑[19],其催化速率快且在較低溫度條件下操作,可有效避免魚油中營養(yǎng)成分的流失[20-21]。

因此,本研究以精制沙丁魚油為原料,采用堿催化法對其進(jìn)行乙酯化工藝優(yōu)化的探究,研究無水乙醇使用量、NaOH使用量、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度對乙酯率的影響,并通過響應(yīng)面法確定最佳乙酯化工藝參數(shù),以期為精制沙丁魚油大規(guī)模生產(chǎn)利用提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

精制沙丁魚油(酸價0.76%±0.05%) 浙江舟山奧旭魚油制品有限公司;無水乙醇 分析純,杭州雙林化工試劑有限公司;氫氧化鈉、正戊烷 分析純,西隴化工股份有限公司;其他試劑均為分析純。

RCT B S025型加熱磁力攪拌器 艾卡(廣州)儀器設(shè)備有限公司;AL204型電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;RE-3000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乙酯化工藝 稱取100 g精制沙丁魚油于三口燒瓶中,置于加熱磁力攪拌器中,預(yù)熱達(dá)到一定的反應(yīng)溫度,將已完全溶解的一定量的NaOH-無水乙醇混合液緩慢加入魚油中,在密閉條件下反應(yīng)一定時間后,把反應(yīng)溶液倒至分液漏斗中,分別加入100、50、50 mL的5%氯化鈉熱溶液清洗三次,靜置2.0 h后,去除下層濁液,將上層清液置于圓底燒瓶中,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)脫去乙醇和水,即得到粗乙酯化魚油。將粗乙酯魚油與同等體積的正戊烷混合完全,放置于-20 ℃冰箱中12 h;減壓抽濾去除未反應(yīng)的甘油三酯,濾液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去正戊烷,即得到脂肪酸乙酯產(chǎn)品m[11]。按照以下公式計算乙酯率。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計 以無水乙醇用量、NaOH用量、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度為單因素,以乙酯得率為指標(biāo),通過單因素實(shí)驗(yàn)選出魚油乙酯化的最佳工藝范圍。在溫度為60 ℃,反應(yīng)時間為60 min,NaOH用量為1.0 g條件下,研究不同的無水乙醇用量(30、40、50、60、70 g)對乙酯率的影響;在無水乙醇用量60 g,反應(yīng)溫度60 ℃條件下反應(yīng)60 min,研究不同用量的NaOH催化劑(0.2、0.6、1.0、1.4、1.8 g)對乙酯率的影響;在無水乙醇用量60 g,NaOH用量1.0 g,反應(yīng)溫度60 ℃的條件下,研究不同反應(yīng)時間(30、50、90、120、180 min)對乙酯率的影響;在無水乙醇用量60 g,NaOH用量1.0 g的條件下反應(yīng)60 min,研究不同反應(yīng)溫度(40、50、60、70、80 ℃)對乙酯率的影響。

1.2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,對無水乙醇用量、NaOH用量、反應(yīng)時間與反應(yīng)溫度4因素3水平的29個組合進(jìn)行魚油乙酯化響應(yīng)面試驗(yàn),以乙酯率為響應(yīng)值,試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面因素水平Table 1 Factors and levels of response surface design

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Origin Pro 8作圖分析并借助Design-Expert.8.0進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)及數(shù)據(jù)分析。對樣品進(jìn)行三次平行測定,取平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)分析

2.1.1 無水乙醇用量對魚油乙酯率的影響 由圖1可以看出,魚油乙酯率隨著無水乙醇用量的增加,先增加后有稍微的降低。當(dāng)無水乙醇用量為60 g時,乙酯率達(dá)到最大值,繼續(xù)增加無水乙醇用量,對乙酯率的提高作用不大。乙酯化反應(yīng)是一個可逆過程,過量的無水乙醇用量能推動反應(yīng)向正反應(yīng)方向進(jìn)行,從而提高乙酯率[22],因此醇油摩爾比至少大于3∶1。但無水乙醇用量過大時,對于酯化效果的影響不明顯,而且會稀釋反應(yīng)體系。趨于對乙酯化效果以及無水乙醇用量成本等因素的考量,無水乙醇用量應(yīng)選取60 g。

圖1 無水乙醇用量對乙酯率的影響Fig.1 Effect of C2H5OH content on the yield of ethyl esters

2.1.2 NaOH用量對魚油乙酯率的影響 由圖2可見,乙酯率隨NaOH用量的增加,先提高后降低,且影響較大,在用量1.0 g時達(dá)到最大值。初始階段,增加催化劑用量能促進(jìn)反應(yīng)向正反應(yīng)方向進(jìn)行,從而提高乙酯率。但催化劑添加量過多時,使得NaOH與甘油三酯發(fā)生皂化反應(yīng),反而降低了乙酯率[11]。因此,確定NaOH的最佳添加量為1.0 g。

圖2 NaOH用量對乙酯率的影響Fig.2 Effect of NaOH content on the yield of ethyl esters

2.1.3 反應(yīng)時間對魚油乙酯率的影響 由圖3可知,隨著反應(yīng)時間的增加,乙酯率先增加后降低,在反應(yīng)時間60 min時達(dá)到最高峰。反應(yīng)時間較短時,反應(yīng)進(jìn)行不充分,乙酯率較低。但隨著時間的推移,反應(yīng)體系中水和甘油的生成量逐漸增加,乙酯率達(dá)到一定值后,會促使反應(yīng)向著逆方向進(jìn)行,且若反應(yīng)時間過長,可能會引起水解反應(yīng)等副反應(yīng)的發(fā)生,從而降低乙酯率?？紤]到反應(yīng)時間對乙酯率的影響,本試驗(yàn)選擇60 min作為最佳反應(yīng)時間。

圖3 反應(yīng)時間對乙酯率的影響Fig.3 Effect of reaction time on the yield of ethyl esters

2.1.4 反應(yīng)溫度對魚油乙酯率的影響 乙醇的沸點(diǎn)是78.3 ℃,且魚油在較高溫度下易發(fā)生氧化,因此溫度的選擇應(yīng)低于80 ℃。由圖4可見,乙酯率在反應(yīng)溫度為50 ℃時達(dá)到最大值。溫度升高,乙醇從液相中揮發(fā)的就越多,與反應(yīng)物、催化劑的接觸面減少,使得乙酯率下降。因此,在既節(jié)省能耗,又能使乙酯化反應(yīng)充分的情況下,選擇最佳反應(yīng)溫度50 ℃。

圖4 反應(yīng)溫度對乙酯率的影響Fig.4 Effect of reaction temperature on the yield of ethyl esters

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)分析

本實(shí)驗(yàn)以乙酯率為最終響應(yīng)值,無水乙醇用量、NaOH用量、反應(yīng)時間與反應(yīng)溫度4因素3水平的29個組合及相應(yīng)的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果如表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計和結(jié)果Table 2 Experimental design and results of response surface

2.2.1 模型建立及顯著性分析 應(yīng)用Design Expert對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,得到精制沙丁魚油乙酯率與各因素變量的回歸方程為:

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析 根據(jù)回歸方程,利用Design Expert軟件繪制各因素間交互作用的響應(yīng)面及等高線,如圖5～圖10所示。

圖5 無水乙醇用量和NaOH用量對乙酯率影響的響應(yīng)面及等高線Fig.5 Response surface and contour of C2H5OH and NaOH content influenced the yield of ethyl esters

圖6 無水乙醇用量和反應(yīng)時間對乙酯率影響的響應(yīng)面及等高線Fig.6 Response surface and contour of C2H5OH content and reaction time influenced the yield of ethyl esters

圖7 無水乙醇用量和反應(yīng)溫度對乙酯率影響的響應(yīng)面及等高線Fig.7 Response surface and contour of C2H5OH content and reaction temperature influenced the yield of ethyl esters

圖8 NaOH用量和反應(yīng)時間對乙酯率影響的響應(yīng)面及等高線Fig.8 Response surface and contour of NaOH content and reaction time influenced the yield of ethyl esters

圖9 NaOH用量和反應(yīng)溫度對乙酯率影響的響應(yīng)面及等高線Fig.9 Response surface and contour of NaOH content and reaction temperature influenced the yield of ethyl esters

圖10 反應(yīng)時間和反應(yīng)溫度對乙酯率影響的響應(yīng)面及等高線Fig.10 Response surface and contour of reaction time and temperature influenced the yield of ethyl esters

圖5為反應(yīng)時間60 min、反應(yīng)溫度50 ℃時,無水乙醇用量與NaOH用量及兩者的交互作用對乙酯率的影響。NaOH用量相較于無水乙醇用量曲面更陡,且軸向等高線更密集,說明對乙酯率的影響更顯著。由等高線圖可知,兩者的交互作用不強(qiáng)。

圖6為NaOH用量1.0 g、反應(yīng)溫度50 ℃時,無水乙醇用量與反應(yīng)時間及兩者的交互作用對乙酯率的影響。反應(yīng)時間的曲面坡度更陡,等高線沿軸向更密集,說明其對于乙酯率的影響較無水乙醇用量更顯著。等高線圖趨于橢圓形,表明兩者的交互作用具有顯著性影響(p<0.05)。

圖7為NaOH用量1.0 g、反應(yīng)時間60 min時,無水乙醇用量與反應(yīng)溫度及兩者的交互作用對乙酯率的影響。當(dāng)無水乙醇用量不變時,乙酯率隨反應(yīng)溫度的升高先增大后減小;當(dāng)保持反應(yīng)溫度不變時,亦有類似的趨勢,其中增大趨勢更為明顯。根據(jù)等高線圖可以看出,沿?zé)o水乙醇用量軸向更為密集,說明無水乙醇用量對乙酯率的影響較反應(yīng)溫度大。而等高線圖趨于圓形,說明兩者的交互作用不強(qiáng),影響不顯著。

圖8為無水乙醇用量60 g、反應(yīng)溫度50 ℃時,NaOH用量與反應(yīng)時間及兩者的交互作用對乙酯率的影響。當(dāng)NaOH用量不變時,乙酯率隨反應(yīng)時間的延長不斷增大,但增幅逐漸減小;當(dāng)反應(yīng)時間不變時,乙酯率隨NaOH用量的增加亦有同樣的變化趨勢,但其曲面更陡,說明NaOH用量對乙酯率的影響較反應(yīng)時間更大,且NaOH用量與反應(yīng)時間的交互作用對乙酯率的影響極顯著(p<0.01)。

圖9為無水乙醇用量60 g、反應(yīng)時間60 min時,NaOH用量與反應(yīng)溫度及兩者的交互作用對乙酯率的影響。當(dāng)NaOH用量不變時,乙酯率隨反應(yīng)溫度的升高,先增大后減小,曲面較緩;當(dāng)反應(yīng)溫度保持不變時,乙酯率隨NaOH用量的增加不斷增大,增幅逐漸減小。等高線沿NaOH用量軸向較反應(yīng)溫度軸向更為密集,且趨于橢圓形,說明兩者的交互作用較強(qiáng)(p<0.05)。

圖10為無水乙醇用量60 g、NaOH用量1.0 g時,反應(yīng)時間與反應(yīng)溫度及兩者的交互作用對乙酯率的影響。當(dāng)保持反應(yīng)時間不變時,乙酯率隨反應(yīng)溫度的升高先增大后減小,曲面比較緩和;當(dāng)反應(yīng)溫度不變時,乙酯率隨反應(yīng)時間的加長而不斷增大。等高線沿反應(yīng)時間軸向較密集,而沿反應(yīng)溫度軸向較稀疏,說明反應(yīng)時間對于乙酯率的影響更為顯著,但反應(yīng)時間與反應(yīng)溫度的交互作用對乙酯率的影響并不顯著。

2.2.3 精制沙丁魚油乙酯化工藝的優(yōu)化與驗(yàn)證 根據(jù)回歸模型,通過Design-Expert軟件分析得到的精制沙丁魚油乙酯化最優(yōu)工藝為:無水乙醇用量61.10 g、NaOH用量1.20 g、反應(yīng)時間75.00 min、反應(yīng)溫度50.32 ℃。在此工藝條件下,乙酯率的預(yù)測值為88.08%?？紤]到實(shí)際操作的便利,將工藝條件修正為:無水乙醇用量60 g、NaOH用量1.2 g、反應(yīng)時間75 min、反應(yīng)溫度50 ℃。以修正過的最優(yōu)乙酯化工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),平行三次取平均值,得到乙酯率88.12%±0.08%,近似預(yù)測值。

3 結(jié)論

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面分析法得到精制沙丁魚油乙酯化最優(yōu)工藝條件:無水乙醇用量60 g、NaOH用量1.2 g、反應(yīng)時間75 min、反應(yīng)溫度50 ℃,乙酯率為88.12%±0.08%,與預(yù)測值相近。各因素對乙酯率的影響依次為:NaOH用量>反應(yīng)時間>無水乙醇用量>反應(yīng)溫度。