香蕉低聚糖對鼠李糖乳桿菌增殖條件的優(yōu)化

范媛媛,羅詩泳,鄭 冰,蘇雪群,王 娟

(1.順德出入境檢驗檢疫局綜合技術(shù)服務中心,廣東順德 528303;2.華南理工大學食品學院,廣東廣州 510641)

低聚糖是指由3～10個單糖分子通過糖苷鍵聚合而成的糖類化合物,是一類重要的生物信息分子,有多方面的生物功能,如增強免疫力、促進益生菌增殖、改善腸道微生態(tài)環(huán)境、抗氧化、增加某些必需礦質(zhì)元素的吸收等等[1-3]。在健康人體消化道中的500多種細菌中,鼠李糖乳桿菌是有益菌,是人類研究最廣泛的益生菌之一。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),低聚糖與益生菌協(xié)同作用,可以更好的發(fā)揮二者在改善腸道微生態(tài)環(huán)境、預防和治療腹瀉及便秘等方面的生理功能[4-15]。

目前功能性低聚糖已成為生物技術(shù)方面研究亮點,而國內(nèi)研究主要集中在殼低聚糖、果低聚糖、魔芋低聚糖及一些中藥提取物中的低聚糖,針對香蕉中低聚糖的研究卻相對匱乏,而香蕉低聚糖屬于功能性低聚糖,不僅是雙歧桿菌、乳酸菌等一些益生菌的增殖因子,而且它是替代蔗糖的新型功能性糖源[16-19]。目前，關于香蕉低聚糖、香蕉抗性淀粉、膳食纖維的潤腸通便功能，已有相關報道[20-23]，但有關香蕉低聚糖對乳桿菌增殖效果的研究卻較少。

本研究以香蕉低聚糖為碳源,以純度大于95%的低聚果糖為陽性對照,探尋香蕉低聚糖是否對鼠李糖乳桿菌有增殖作用,以及鼠李糖乳桿菌的最佳增殖條件及增殖規(guī)律?？蔀槲⑸鷳B(tài)制劑的研制、微膠囊保健品的開發(fā)、以及集營養(yǎng)、保健、食療于一體的功效食品的生產(chǎn)提供基礎數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

香蕉低聚糖 (低聚糖含量:79.28%)華南理工大學食品科學與工程學院實驗室自制;鼠李糖乳桿菌(ATCC 7469) 美國菌種保藏中心;低聚果糖 (純度>95%)廣州菲博生物科技有限公司;MRS液體培養(yǎng)基(不含葡萄糖) 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

SANYO MIR-153多功能培養(yǎng)箱 日本三洋公司;ESCO CLASSⅡ Type A2生物安全柜 新加坡藝思高科技有限公司;Synbiosis Acolyte 菌落計數(shù)儀 英國Synbiosis公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 香蕉低聚糖的提取、純化及含量測定 用超聲波法提取香蕉低聚糖,粗提液經(jīng)過凝膠柱層析純化后,采用蒽酮-硫酸法測定低聚糖含量[24-26]。

1.2.2 基礎培養(yǎng)基的配制 用不同質(zhì)量的香蕉低聚糖代替MRS液體培養(yǎng)基中的葡萄糖,其成分為[9]:胰蛋白胨10.0 g,酵母膏5.0 g,牛肉膏10.0 g,磷酸二氫鉀2.0 g,磷酸氫二鉀2.0 g,檸檬酸2.0 g,乙酸鈉5.0 g,硫酸鎂(含七水)0.58 g,硫酸錳(含四水)0.25 g,吐溫80 1.0 mL,香蕉低聚糖(2、4、6、8、10 g),蒸餾水1000 mL,pH調(diào)至一定范圍內(nèi)(5.0～7.5)。

1.2.3 菌懸液制備 無菌條件下,將標準菌株活化,即將鼠李糖乳桿菌的標準菌株劃線接種于MRS平板,于36 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,從培養(yǎng)后的平板中挑取適量的菌落,接種于無菌生理鹽水,攪拌均勻后,進行梯度稀釋,再用無菌吸頭吸取0.1 mL涂布于相應的MRS平板,于36 ℃培養(yǎng)48 h,然后計數(shù)[23-29]。根據(jù)計數(shù)結(jié)果,選取濃度在104～108CFU/mL的菌懸液備用。

1.2.4 單因素實驗

1.2.4.1 培養(yǎng)時間對鼠李糖乳桿菌增殖數(shù)量的影響 將不同質(zhì)量濃度的香蕉低聚糖(2、4、6、8、10 g/L)和1 mL 4.1×106CFU/mL的菌懸液,分別加入10 mL pH為7.0的基礎培養(yǎng)基中;將1 mL 4.1×106CFU/mL的菌懸液,加入10 mL基礎培養(yǎng)基中,作為陰性對照組;將6 g/L的低聚果糖和1 mL 4.1×106CFU/mL的菌懸液,加入10 mL基礎培養(yǎng)基中,作為陽性對照組?；靹?于(36±1) ℃厭氧培養(yǎng)48 h,培養(yǎng)期間,選取不同的時間點計數(shù)(12、24、28、32、36、40、44、48 h),每個時間點做三個平行,取平均值。

1.2.4.2 香蕉低聚糖的添加量對鼠李糖乳桿菌增殖數(shù)量的影響 在pH為7.0、接種量為1 mL 4.1×106CFU/mL的鼠李糖乳桿菌菌懸液的基礎培養(yǎng)基中,添加濃度為2、4、6、8、10 g/L的香蕉低聚糖,培養(yǎng)36 h時后,分別測定鼠李糖乳桿菌的菌落數(shù),取對數(shù)后與添加量作圖,比較不同香蕉低聚糖添加量對鼠李糖乳桿菌增殖數(shù)量的差異,得出最佳低聚糖的添加量。

1.2.4.3 初始菌液濃度對鼠李糖乳桿菌增殖數(shù)量的影響 將1 mL不同濃度的鼠李糖乳桿菌菌懸液(104、105、106、107、108CFU/mL)和6 g/L 的香蕉低聚糖加入10 mL pH為7.0的基礎培養(yǎng)基中,混勻,培養(yǎng)至36 h,分別測定不同濃度的菌懸液中鼠李糖乳桿菌的菌落數(shù)。每個濃度做三個平行,取平均值?？芍罄钐侨闂U菌菌落數(shù)最高時的初始菌液濃度。

1.2.4.4 基礎培養(yǎng)基的初始pH對鼠李糖乳桿菌增殖數(shù)量的影響 將6 g/L的香蕉低聚糖和1 mL 4.1×106CFU/mL的菌懸液,分別加入10 mL pH為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的基礎培養(yǎng)基中,混勻,于36 ℃培養(yǎng)培養(yǎng)36 h,分別測定不同pH 菌懸液中鼠李糖乳桿菌的數(shù)量。每個pH做三個平行,取平均值?？芍耸罄钐侨闂U菌菌落數(shù)最高時的基礎培養(yǎng)基初始pH。

1.2.5 Box-Behnken中心組合試驗設計 按照Box-Behnken的中心組合試驗設計原理,選擇對鼠李糖乳桿菌增殖有影響的四個因素:培養(yǎng)時間(A)、低聚糖添加量(B)、初始菌液濃度(C)和pH(D),進行四因素三水平的響應面分析試驗,每個處理測定3次,取平均值。實驗設計的因素、水平見表1。

表1 因素水平編碼表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用統(tǒng)計分析軟件Design Expert建立回歸模型,確定鼠李糖乳桿菌最佳增殖數(shù)量的條件及各因素與響應值之間的真實關系,并對鼠李糖乳桿菌增殖規(guī)律的數(shù)學模型進行方差分析,以驗證真實值與預測值之間及檢驗方程的有效性。建立各因素間的回歸優(yōu)化響應曲面圖,并對各因素間的交互作用進行方差分析與優(yōu)化,通過回歸模型得出鼠李糖乳桿菌的最佳增殖條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)時間對鼠李糖乳桿菌增殖數(shù)量的影響

由圖1可看出，不同質(zhì)量濃度的香蕉低聚糖(2、4、6、8、10 g/L)對鼠李糖乳桿菌的增殖作用是在培養(yǎng)36 h左右達到高峰,其中香蕉低聚糖的添加量為6 g/L時,鼠李糖乳桿菌的增殖數(shù)量最多,可達到109數(shù)量級。主要是因為在以香蕉低聚糖為唯一碳源時,培養(yǎng)前期碳源充足,而鼠李糖乳桿菌處于對數(shù)生長期,生長旺盛;隨著培養(yǎng)時間的增加,及香蕉低聚糖的消耗,在培養(yǎng)36 h后，鼠李糖乳桿菌的生長進入穩(wěn)定期,菌落數(shù)量基本不再增加。陰性對照組在48 h的培養(yǎng)期間內(nèi),菌落數(shù)變化無顯著性差異(p>0.05);陽性對照組在培養(yǎng)28 h后,鼠李糖乳桿菌數(shù)量可達到108數(shù)量級。陽性對照組的菌數(shù)小于香蕉低聚糖添加量為6 g/L培養(yǎng)液中的菌數(shù)。說明香蕉低聚糖作為碳源，對鼠李糖乳桿菌的增殖作用更強。

圖1 培養(yǎng)時間對鼠李糖乳桿菌增殖數(shù)量的影響Fig.1 Effect of culture time on the proliferation of Lactobacillus

2.2 低聚糖添加量對鼠李糖乳桿菌增殖數(shù)量的影響

由圖2可知,不同濃度的香蕉低聚糖對鼠李糖乳桿菌的體外生長有不同程度的影響。當?shù)途厶堑奶砑恿繛? g/L時,鼠李糖乳桿菌的增殖數(shù)量最多,可達到109數(shù)量級;當?shù)途厶堑奶砑恿繛?0 g/L時,鼠李糖乳桿菌的增殖數(shù)量明顯最低,說明高濃度的低聚糖對鼠李糖乳桿菌的生長有抑制作用。這可能是由于高濃度的低聚糖造成培養(yǎng)基的碳源量過高,鼠李糖乳桿菌在代謝發(fā)酵后產(chǎn)酸,使培養(yǎng)基偏酸,造成了高滲透壓的環(huán)境,鼠李糖乳桿菌細胞脫水,從而抑制了生長[30-32]。由此說明,低聚糖作為鼠李糖乳桿菌的生長增殖因子，有一定的濃度作用范圍,過高或過低都不適宜鼠李糖乳桿菌的生長。

圖2 香蕉低聚糖的添加量對鼠李糖乳桿菌增殖數(shù)量的影響Fig.2 Effect of additive amount of banana oligosaccharide on the proliferation of Lactobacillus

2.3 初始菌液濃度對鼠李糖乳桿菌增殖數(shù)量的影響

由圖3可知,乳桿菌的初始菌液的濃度為106CFU/mL時,鼠李糖乳桿菌的增殖效果最佳。當初始菌液濃度小于106CFU/mL時,鼠李糖乳桿菌的增殖程度較高,數(shù)量可達到108數(shù)量級;當初始菌液濃度大于106CFU/mL時,鼠李糖乳桿菌的數(shù)量雖然比較高,但其增殖程度比較低,這可能是由于培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質(zhì)和能量有限,菌液濃度過高時,菌體間會產(chǎn)生競爭性抑制,導致菌體數(shù)量的平衡或降低,從而使增殖程度較低。

圖3 初始菌液濃度對鼠李糖乳桿菌增殖數(shù)量的影響Fig.3 Effect of concentration of bacteria suspensions on the proliferation of Lactobacillus

2.4 基礎培養(yǎng)基的初始pH對鼠李糖乳桿菌增殖數(shù)量的影響

由圖4可知,香蕉低聚糖的濃度為6 g/L、菌懸液的濃度為106CFU/mL時,對鼠李糖乳桿菌增殖效果最好的基礎培養(yǎng)基pH為7.0。當pH小于5.5時,鼠李糖乳桿菌的增殖速度慢、數(shù)量少,可能是由于培養(yǎng)基的酸度過高,不利于鼠李糖乳桿菌的生長繁殖,而鼠李糖乳桿菌生長又會產(chǎn)生乳酸等酸性物質(zhì),導致增殖數(shù)量一直比較低[30-32]。

圖4 基礎培養(yǎng)基的初始pH對鼠李糖乳桿菌增殖數(shù)量的影響Fig.4 Effect of pH of basic medium on the proliferation of Lactobacillus

2.5 響應面試驗結(jié)果與分析

2.5.1 響應面回歸模型的建立與分析 響應面試驗結(jié)果見表2,對表2數(shù)據(jù)進行回歸分析,得二次多項式回歸方程:

表2 響應面試驗設計與結(jié)果Table 2 Box-Behnken design and test results

Y=-184.64667+2.54067A+1.79767B+7.03733C+34.97867D+0.001562AB-0.023125AC-0.083750AD-0.018750BC-0.097500BD-0.21000CD-0.024656A2-0.10925B2-0.38325C2-2.20300D2

對鼠李糖乳桿菌增殖規(guī)律的數(shù)學模型進行方差分析,方差分析結(jié)果見表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 The variance analysis of regression equation

方差分析中模型p值<0.0001說明回歸方程是極顯著的(p<0.01),相關系數(shù)R2=0.9905，說明響應值的變化有99.05%來源于所選變量,即培養(yǎng)時間、低聚糖添加量、初始菌液濃度和基礎培養(yǎng)基pH。失擬項不顯著,說明模型合適,回歸方程對實驗擬合情況好,可以較好的描述各因素與響應值之間的真實關系,可以利用該回歸方程代替實驗真實點對實驗結(jié)果進行分析。一次項中培養(yǎng)時間、初始菌液濃度和基礎培養(yǎng)基pH的p值均小于0.001,說明這三個因素對結(jié)果的影響非常顯著;而低聚糖添加量的p值為0.0133,小于0.05,說明其對結(jié)果的影響顯著。四個因素二次項的p值均小于0.001,說明這四個因素的平方項對結(jié)果的影響非常顯著。六個交互項中只有培養(yǎng)時間和基礎培養(yǎng)基pH交互作用的p值小于0.001,對結(jié)果影響非常顯著;培養(yǎng)時間和初始菌液濃度交互作用、低聚糖添加量和基礎培養(yǎng)基pH交互作用的p值均小于0.05,說明其交互作用對結(jié)果影響顯著;而培養(yǎng)時間和低聚糖添加量、低聚糖添加量和初始菌液濃度交互作用的p值均大于0.05,說明其交互作用對結(jié)果影響不顯著。

2.5.2 響應面交互作用的分析與優(yōu)化 各因素的交互作用對鼠李糖乳桿菌增殖數(shù)量的影響見圖5～圖10。

圖5 培養(yǎng)時間與低聚糖添加量的交互作用對鼠李糖乳桿菌增殖數(shù)量的影響Fig.5 Effect of culture time and additive amount of banana oligosaccharide on the proliferation of Lactobacillus

圖6 培養(yǎng)時間與初始菌液濃度的交互作用對鼠李糖乳桿菌增殖數(shù)量的影響Fig.6 Effect of culture time and concentration of bacteria suspensions on the proliferation of Lactobacillus

圖7 培養(yǎng)時間與培養(yǎng)基的初始pH的交互作用對鼠李糖乳桿菌增殖數(shù)量的影響Fig.7 Effect of culture time and pH of basic medium on the proliferation of Lactobacillus

圖8 低聚糖添加量與初始菌液濃度的交互作用對鼠李糖乳桿菌增殖數(shù)量的影響Fig.8 Effect of additive amount of banana oligosaccharide and concentration of bacteria suspensions on the proliferation of Lactobacillus

圖9 低聚糖添加量與培養(yǎng)基的初始pH的交互作用對鼠李糖乳桿菌增殖數(shù)量的影響Fig.9 Effect of additive amount of banana oligosaccharide and pH of basic medium on the proliferation of Lactobacillus

圖10 初始菌液濃度與培養(yǎng)基的初始pH的交互作用對鼠李糖乳桿菌增殖數(shù)量的影響Fig.10 Effect of concentration of bacteria suspensions and pH of basic medium on the proliferation of Lactobacillus

響應曲面坡度越陡峭,說明響應值對于該因素的改變越敏感,而曲面坡度越平滑,說明該因素的改變對響應值的影響也就越小[33]。由各因子間的回歸優(yōu)化響應曲面圖和方差分析可知,培養(yǎng)時間(A)與低聚糖添加量(B)、低聚糖添加量(B)與初始菌液濃度(C)的交互作用對鼠李糖乳桿菌的增殖影響不顯著;初始菌液濃度(C)與pH(D)、培養(yǎng)時間(A)與pH(D)的交互作用對鼠李糖乳桿菌的增殖影響均顯著。

2.5.3 最佳增殖條件的驗證 通過回歸模型得出的鼠李糖乳桿菌最佳體外增殖條件為:培養(yǎng)時間為37.2 h,低聚糖添加量為6.01 g/L,初始菌液濃度的對數(shù)為6.34,即菌液濃度為2.2×106CFU/mL,pH為6.80。在此條件下模型的預測值為9.1899?？紤]到實際操作,將最佳條件調(diào)整為:培養(yǎng)時間為37 h,低聚糖添加量為6.00 g/L,菌液濃度為2.2×106CFU/mL,pH為6.80。在此條件下,進行三次重復實驗,實際測得的鼠李糖乳桿菌數(shù)量為1.5×109CFU/mL,取對數(shù)后得9.1706,與預測值的RSD值為0.149%,提示此模型和方法的可行性和有效性較好。

3 結(jié)論

方程與實際操作所確定的鼠李糖乳桿菌最佳體外增殖條件為:培養(yǎng)時間37 h,低聚糖添加量為6.00 g/L,菌液濃度為2.2×106CFU/mL,pH為6.80。在此條件下,進行三次重復實驗,實際測得的鼠李糖乳桿菌數(shù)量為1.5×109CFU/mL,取對數(shù)后得9.1706,與預測值的RSD值為0.149%,提示此模型和方法的可行性和有效性較好,其本試驗所得模型合適,回歸方程對實驗擬合度好,其最佳優(yōu)化條件適合于鼠李糖乳桿菌的增殖。