不同生物活性材料對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞功能影響的比較

劉元媛,曹曉滄

（天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院消化內(nèi)科，天津300052）

MSCs是一組多能異質(zhì)性群體，在體外具有多向分化潛能，可分化為脂肪、骨、軟骨等組織[1-4]。而且，間充質(zhì)干細(xì)胞的來(lái)源十分廣泛，主要來(lái)源于骨髓、脂肪、臍帶以及胎盤等組織[5-8]。近幾年，人胎盤來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞由于其提取方便、成本小、易于培養(yǎng)、效果顯著等諸多優(yōu)點(diǎn)逐漸成為眾多干細(xì)胞研究者的研究熱點(diǎn)[9-14]。間充質(zhì)干細(xì)胞的多能性除了多向分化潛能外還主要體現(xiàn)在免疫調(diào)節(jié)及抗炎作用。然而，免疫抑制及抗炎作用的發(fā)揮依賴于MSCs所分泌的細(xì)胞因子，其中主要為腫瘤壞死因子誘導(dǎo)蛋白-6（tumor necrosis factor-α-induced gene/protein 6 ，TSG-6）及前列腺素 E2（prostaglandin E2，PGE2）[15-17]。

近年來(lái)，為了提高M(jìn)SCs的生物學(xué)效應(yīng)，人們研制出多種生物活性材料以提高M(jìn)SCs的活性及利用率。本課題組將殼聚糖（chitosan，CS）連接到人胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（insulin-like growth factor-1）的C結(jié)構(gòu)域或者連接到一氧化氮（nitric oxide，NO）合成CS-IGF-1C或者CS-NO水凝膠，其在體外與體內(nèi)都具有促進(jìn)MSCs生物學(xué)效應(yīng)的功能[18-19]。然而，本實(shí)驗(yàn)重在進(jìn)一步研究CS、CS-IGF-1C以及CS-NO水凝膠三者對(duì)于MSCs的不同影響，以利于日后研究有目的地選擇與利用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象和主要試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人胎盤來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞（hP-MSCs）由北京干細(xì)胞庫(kù)提供；CS、殼聚糖-胰島素樣生長(zhǎng)因子-1C、殼聚糖-一氧化氮（CS-NO）水凝膠由南開大學(xué)分子生物研究所合成。

1.1.2 主要試劑 2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS，sigma）購(gòu)買自上海易佰聚經(jīng)貿(mào)有限公司；MTT試劑盒購(gòu)買自上海翊圣生物科技有限公司；螢火蟲熒光素酶的底物（D-luciferin）購(gòu)買自美國(guó)Caliperls公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 研究方法

1.2.1 質(zhì)粒提取及慢病毒包裝感染 50 μL感受態(tài)細(xì)胞冰浴融化后加入目的DNA，混勻后冰浴30 min，42℃水浴熱激45 s，快速冰浴2 min，加入400 μL LB液體培養(yǎng)基，37℃，200 r/min搖床培養(yǎng)1 h使菌體復(fù)蘇，3 000 r/min離心1 min，棄部分上清，重懸菌液，轉(zhuǎn)移至含抗生素的LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)1 h至液體被吸收，將平板倒置培養(yǎng)12～16 h。挑取平板上的單克隆加入15 mL含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃，200 r/min搖床內(nèi)過(guò)夜培養(yǎng)。提取質(zhì)粒，檢測(cè)質(zhì)粒溶液濃度，-20℃凍存。Lipofectamine 2000試劑盒進(jìn)行慢病毒包裝，于-80℃凍存待用。預(yù)先將1×105hP-MSCs鋪于六孔板一孔，待貼壁后，吸出原有的培養(yǎng)基，更換為含有病毒液的培養(yǎng)基（2 mL不含抗生素的培養(yǎng)液+3 μL polybrene溶液（8 μg/mL）+1 mL病毒液）。將六孔板于37℃，1 600 r/min離心1 h，孵箱培養(yǎng)3 h后，用新鮮培養(yǎng)液更換含有病毒的培養(yǎng)液，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，于倒置熒光顯微鏡下觀察GFP陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)情況，用生物發(fā)光成像儀檢測(cè)螢火蟲熒光蛋白的表達(dá)情況。

1.2.2 流式細(xì)胞分析 將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞傳代擴(kuò)增后進(jìn)行消化計(jì)數(shù)，取1×105個(gè)細(xì)胞以1 200 rpm/min，4℃離心3 min，棄上清，用PBS緩沖液洗脫離心3次，最后一次棄上清后，用500 μL PBS重懸，移入流式管中，用200目的篩網(wǎng)過(guò)濾成單個(gè)細(xì)胞到新的流式管中，插入冰上，上機(jī)，按照FL-H1通道檢測(cè)GFP陽(yáng)性細(xì)胞的百分比。

1.2.3 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè) 3種水凝膠對(duì)細(xì)胞的增殖效果 MTT實(shí)驗(yàn)可很好的反應(yīng)細(xì)胞的增殖效果，因此，我們將3種水凝膠按照已報(bào)道的最適濃度200 μmol/L 涂布于 96孔板（3 μL/孔）并將孔板置于37℃溫箱中孵育30 min[18，20]。而后細(xì)胞均按照2×103的細(xì)胞濃度鋪盤（5孔/組）。分別于24、48、72 h后進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)并用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD490值。

1.2.4 生物發(fā)光成像儀檢測(cè) 3種水凝膠對(duì)hPMSCs的促增殖作用 由于hP-MSCsGFP-Fluc可穩(wěn)定表達(dá)GFP/Fluc，因此可根據(jù)這個(gè)特性，利用生物發(fā)光成像儀檢測(cè)hP-MSCsGFP-Fluc的增殖效果。將不同水凝膠分別涂布于24孔板（10 μL/孔），將孔板置于37℃溫箱中孵育30 min后培養(yǎng)hP-MSCs，每孔細(xì)胞數(shù)為5×104（3孔/組）。于24、48、72 h分別進(jìn)行生物發(fā)光成像儀檢測(cè)，D-luciferin每孔加10 μL。

1.2.5 H2O2誘導(dǎo)hP-MSCsGFP-Fluc的抗凋亡 再次利用hP-MSCs穩(wěn)定表達(dá)GFP/Fluc的特性，預(yù)先將3種水凝膠涂布于24孔板，再將5×105個(gè)hP-MSCs/孔鋪于孔板中，然后將 H2O2按照 50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L 的濃度梯度加入孔板，于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，按照上述方法，利用生物發(fā)光成像檢測(cè)細(xì)胞的存活。

1.2.6 RT-PCR檢測(cè)不同培養(yǎng)條件下hP-MSCs的表達(dá)情況 利用Real time PCR檢測(cè)三種不同水凝膠處理的hP-MSCs的增殖、凋亡、炎癥、血管新生等相關(guān)因子的表達(dá)。Trizol法提取結(jié)腸組織中總RNA，需要測(cè)定的基因的引物序列，IGF-1，上游：5′-GCTCTTCAGTTCGTGTGTGGA-3′，下游：5′-GCCTCC TTAGATCACAGCTCC-3′（擴(kuò)增片段長(zhǎng)度：109 bp）；HGF，上游：5′-GCTATCGGGGTAAAGACCTACA-3′，下游：5′-CGTAGCGTACCTCTGGATTGC-3′（擴(kuò)增片段長(zhǎng)度：116bp）；EGF，上游：5′-TGTCCACGCAA TGTGTCTGAA-3′，下游：5′-CATTATCGGGTGAGGA ACAACC-3′（擴(kuò)增片段長(zhǎng)度：131 bp）；BAX，上游：5′-CCCGAGAGGTCTTTTTCCGAG-3′， 下 游 ：5′-CCAGCCCATGATGGTTCTGAT-3′（擴(kuò)增片段長(zhǎng)度：155 bp）；BAD，上游：5′-CCCAGAGTTTGAGCCGAG TG-3′，下游：5′-CCCATCCCTTCGTCGTCCT-3′（擴(kuò)增片段長(zhǎng)度：249 bp）；FAS，上游：5′-TCTGGTTCTTA CGTCTGTTGC-3′，下游：5′-CTGTGCAGTCCCTAGC TTTCC-3′（擴(kuò)增片段長(zhǎng)度：197 bp）。FASG，上游：5′-CTCCGAGAGTCTACCAGCCA-3′，下游：5′-TGGA CTTGCCTGTTAAATGGG-3′（擴(kuò)增片段長(zhǎng)度：121bp）；TSG-6，上游：5′-TTTCTCTTGCTATGGGAAGACAC-3′，下游：5′-GAGCTTGTAT TTGCCAGACCG-3′（擴(kuò)增片段長(zhǎng)度：126 bp）；PGE2，上游：5′-CGATGCTCATGCTCTTCGC-3′，下游：5′-GGGAGACTGCATAGATGACAGG-3′（擴(kuò)增片段長(zhǎng)度：126 bp）；VEGF,上游：5′-AGGGCAGAATCATCAC GAAGT-3′，下游：5′-AGGGTCTCGATTGGATGGC A-3′（擴(kuò)增片段長(zhǎng)度：136 bp）；PDGF，上游：5′-GACT CAGGCGGAATCCAACC-3′，下游：5′-CTTGGGCTGT GAATACTTCCATT-3′（擴(kuò) 增 片 段 長(zhǎng) 度 ：122 bp）；GAPDH,上游：5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游：5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′（擴(kuò)增片段長(zhǎng)度：122 bp）

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染后hP-MSCs的特性 在顯微鏡下觀察到，轉(zhuǎn)染后的hP-MSCs細(xì)胞呈現(xiàn)成纖維細(xì)胞樣梭形形態(tài)，在倒置熒光顯微鏡下觀察到90%的hP-MSCs細(xì)胞呈GFP陽(yáng)性。流式細(xì)胞分析結(jié)果也驗(yàn)證了這一結(jié)果。生物發(fā)光成像儀檢測(cè)的結(jié)果表明，細(xì)胞的熒光強(qiáng)度與細(xì)胞數(shù)量呈較好的線性關(guān)系（R2=0.998 1）（圖1），因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中可用熒光強(qiáng)度直接反映細(xì)胞數(shù)量。

2.2 不同水凝膠對(duì)hP-MSCs的促增殖作用 為了研究三者對(duì)細(xì)胞增殖的影響，首先我們進(jìn)行了MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，CS-IGF-1C水凝膠與CS-NO水凝膠均可顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖。而CS對(duì)細(xì)胞的增殖并沒(méi)有明顯效果。生物發(fā)光成像技術(shù)也說(shuō)明，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，CS-IGF-1C水凝膠組細(xì)胞信號(hào)最強(qiáng)，細(xì)胞增殖最快。與此同時(shí)，Real time PCR結(jié)果顯示，CS-IGF-1C水凝膠可顯著促進(jìn)增殖相關(guān)基因IGF-1，HGF及EGF的表達(dá)。CS-NO水凝膠對(duì)細(xì)胞的增殖也具有一定的促進(jìn)作用，由此，進(jìn)一步驗(yàn)證了CS-IGF-1C與CS及CS-NO相比能更好地促進(jìn)細(xì)胞的增殖（圖2）

2.3 不同水凝膠抗細(xì)胞凋亡的作用 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CS、CS-NO、CS-IGF-IC水凝膠都具有抗細(xì)胞凋亡的能力，但是CS-IGF-1C水凝膠抗細(xì)胞凋亡的能力更加顯著，CS-NO水凝膠抗細(xì)胞凋亡的能力與CS組相比并無(wú)顯著差別。而對(duì)三種水凝膠處理后的hP-MSCs表達(dá)的凋亡相關(guān)基因進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，CS-IGF-1C與CS-NO水凝膠能夠顯著降低BAX/BAD、FAS/FASLG等凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，CS水凝膠可下調(diào)FAS/FASLG的表達(dá)，其結(jié)果與生物發(fā)光成像具有相似性（圖3）。

圖1 hP-MSCsGFP-Fluc的特性Fig 1 The characteristics of hP-MSCs

圖2 不同培養(yǎng)條件下細(xì)胞的增殖效果Fig 2 Cell proliferation in different culture conditions

圖3 不同培養(yǎng)條件下細(xì)胞的凋亡情況Fig 3 Apoptosis of cells in different culture conditions

2.4 不同水凝膠對(duì)細(xì)胞抗炎因子表達(dá)的影響 結(jié)果表明，CS-IGF-1C水凝膠組TSG-6與PGE2的表達(dá)量較高，但CS-NO在一定程度上也能促進(jìn)hP-MSCs對(duì)抗炎因子表達(dá)（圖4）。因此CS-NO與CS-IGF-1C水凝膠均可與hP-MSCs共移植用于炎性疾病的治療。

2.5 細(xì)胞促血管新生相關(guān)因子的表達(dá) 結(jié)果表明，CS-NO可顯著促進(jìn)VEGF及PDGF的表達(dá)，同時(shí)，CS-IGF-1C水凝膠對(duì)hP-MSCs也有較明顯的促進(jìn)血管新生相關(guān)因子表達(dá)的作用，而CS在一定程度上也能促進(jìn)VEGF的表達(dá)（圖5）。

圖4 Real time PCR檢測(cè)炎性相關(guān)因子Fig 4 Real time PCR detected the related inflammatory cytokines

圖5 Real time PCR檢測(cè)促血管新生相關(guān)因子Fig 5 Real time PCR detected the angiogenesis related factors

3 討論

間充質(zhì)干細(xì)胞最早被認(rèn)為是來(lái)源于中胚層和外胚層的一組多能干細(xì)胞群體而被人們所熟知，但是隨著再生醫(yī)學(xué)的進(jìn)步，以及對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞可以跨胚層分化，甚至可以分化為脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞等，因此其具有多向分化潛能，在組織修復(fù)與再生的醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的發(fā)展前景[1-4,21-23]。此外，間充質(zhì)干細(xì)胞最早是從小鼠骨髓中提取而來(lái)，但是由于其數(shù)量與分化潛能受年齡的影響，再加上其提取程序復(fù)雜，在應(yīng)用中受到極大限制[24-25]。隨后在脂肪組織、臍帶、羊水及胎盤中也提取出了間充質(zhì)干細(xì)胞，但是脂肪及羊水中的間充質(zhì)干細(xì)胞的提取受多種條件的限制[26]，而且獲取羊水對(duì)胎兒及母體有一定的風(fēng)險(xiǎn)；臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞雖然提取便利，但是其免疫原性比其他間充質(zhì)干細(xì)胞要高。所以胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)顯而易見(jiàn)：低免疫原性，獲取方便，對(duì)人體無(wú)害，易于培養(yǎng)，多向分化、免疫調(diào)節(jié)及抗炎能力強(qiáng)，不涉及倫理問(wèn)題等[27-28]。因此，胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞成為眾多研究領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)。

生物發(fā)光成像是基于分子影像學(xué)的一門技術(shù)，早在1999年美國(guó)哈佛大學(xué)維斯里德教授提出這一概念，并用以檢測(cè)活體狀態(tài)下動(dòng)物體內(nèi)的細(xì)胞及分子水平[29]。而近年來(lái)小動(dòng)物活體成像技術(shù)大多被應(yīng)用于對(duì)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)，應(yīng)用生物發(fā)光成像的原理將腫瘤細(xì)胞進(jìn)行熒光素酶的標(biāo)記，在體外加入熒光素時(shí)，熒光素酶與熒光素發(fā)生反應(yīng)釋放光子，這種光子在一定的波長(zhǎng)內(nèi)可被小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)捕捉到，從而監(jiān)測(cè)瘤性細(xì)胞在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移以及腫瘤的大小[30-32]。與此同時(shí)，將小動(dòng)物體內(nèi)轉(zhuǎn)入熒光素酶的報(bào)告基因，在體外給予熒光素后仍然能夠檢測(cè)目的基因的表達(dá)水平[18-19]。而將細(xì)胞標(biāo)記熒光素酶再置于外源的生物凝膠中仍然不影響發(fā)光強(qiáng)度[19,33]。在本研究中，我們應(yīng)用同樣的原理，將綠色熒光素酶與螢火蟲熒光素酶的報(bào)告基因轉(zhuǎn)入hP-MSCs內(nèi)，使其在正常情況下自發(fā)綠色熒光，并且在與螢火蟲熒光素結(jié)合時(shí)發(fā)生反應(yīng)釋放光子，再利用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)便可以監(jiān)測(cè)到細(xì)胞移植后的分布及活細(xì)胞的數(shù)量。

據(jù)研究表明，傳統(tǒng)的基質(zhì)膠matrigel3D培養(yǎng)條件下的MSCs具有較明顯的促進(jìn)細(xì)胞存活與促血管新生的作用，成功應(yīng)用在心肌缺血的動(dòng)物模型中[34]。另外，人血小板裂解液合成的水凝膠在一定條件下也具有促進(jìn)MSCs增殖與促血管新生的作用，其表征結(jié)果也證明了這種水凝膠的安全性[35]。但是，在以往的研究中得知，CS-IGF-1C水凝膠與小鼠脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞（adipose mesenchymal stem cells，ADSCs）共培養(yǎng)可促進(jìn)ADSCs的增殖，拮抗H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，同時(shí)具有促進(jìn)血管新生的作用[19,36]。而CS-NO水凝膠可促進(jìn)hP-MSCs來(lái)源的外泌體對(duì)促血管新生的作用，上調(diào)VEGF及PDGF的表達(dá)[18]。而在本研究中CS-IGF-1C除了具有促進(jìn)MSCs增殖及抑制凋亡的作用外，還具有促進(jìn)MSCs的促進(jìn)血管新生相關(guān)因子表達(dá)及抗炎相關(guān)因子表達(dá)的作用。而CS-NO水凝膠促進(jìn)MSCs的血管新生相關(guān)因子表達(dá)的作用依然很穩(wěn)定。因此，本課題組所研制的CS負(fù)載的生物活性材料與其他各類已報(bào)道的生物材料相比其生物效應(yīng)可能更加廣泛。

綜上所述，在以后的研究中可將CS-IGF-1C水凝膠與CS-NO水凝膠應(yīng)用于MSCs對(duì)缺血性疾病的移植治療，而CS-IGF-1C水凝膠還可應(yīng)用于炎癥性疾病的治療，這兩種水凝膠具有較廣的臨床應(yīng)用前景。