利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建穩(wěn)定敲除CBX2基因的A549細(xì)胞系

董旭，張兆域，茍芳琳，蘭蓓

（天津醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，天津300070）

多梳蛋白家族（PcG）是重要的表觀遺傳修飾調(diào)控復(fù)合物，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制功能[1]，在生物進(jìn)程中具有十分重要的作用，如X染色體失活、維持胚胎干細(xì)胞多能性和自我更新、細(xì)胞命運(yùn)決策和發(fā)展控制[2]。在哺乳動物中，PcG主要有兩種表現(xiàn)形式：多梳抑制復(fù)合物 1（PRC1）和多梳抑制復(fù)合物 2（PRC2），它們是維持胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞干性必需的重要組分[3]，對細(xì)胞周期調(diào)控、DNA修復(fù)、細(xì)胞分化、衰老和死亡發(fā)揮重要的作用[4]。PRC2依賴于其組分EZH2在轉(zhuǎn)錄起始發(fā)揮作用。EZH2是甲基轉(zhuǎn)移酶，能特異性三甲基化組蛋白H3K27，從而抑制轉(zhuǎn)錄。PRC1通過識別H3K27me3并募集到染色質(zhì)上，維持染色質(zhì)的抑制狀態(tài)。此外，PRC1還能泛素化組蛋白H2A，進(jìn)一步發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制作用[5]。CBX蛋白家族是PRC1的經(jīng)典組成成分，主要功能為識別H3K27me3并將PRC1定位到染色質(zhì)。CBX蛋白家族包括CBX2，CBX4，CBX6，CBX7 和 CBX8，其擁有共同的結(jié)構(gòu)域，從而在轉(zhuǎn)錄抑制方面功能相似[6]。同時，CBX家族成員之間也存在結(jié)構(gòu)差異，因此功能也有所差別：CBX4擁有SUMO活性[7]，這種活性在人類腫瘤細(xì)胞增殖和DNA損傷修復(fù)過程中發(fā)揮作用[8]。CBX6是維持胚胎干細(xì)胞多能性和干細(xì)胞分化所需的關(guān)鍵因子[9]。CBX7和CBX8能夠在癌癥中發(fā)揮作用。CBX7是研究最廣泛的CBX家庭成員，有大量的研究表明它在多種癌癥中有特異性活性[10]，能夠抑制腦癌，結(jié)腸癌和肺癌等[11]。CBX8對MLL/AF9白血病發(fā)生至關(guān)重要[12]。然而，CBX2對癌癥的作用及分子機(jī)制還并不清楚，有待更為深入的研究。CRISPR/Cas9技術(shù)是一種高效、方便、靈活的基因編輯工具[13]，是細(xì)菌和古細(xì)菌演化形成的一種對抗入侵病毒及外源DNA的適應(yīng)性免疫防御[14]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)已被設(shè)計成能夠在多個真核系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)RNA引導(dǎo)基因組修改的工具，使基因編輯更為方便[15]。通過人工設(shè)計sgRNA，使外源核酸酶Cas9和基因組靶基因位點(diǎn)相結(jié)合并隨機(jī)剪切，然后通過同源重組等DNA修復(fù)過程最終實(shí)現(xiàn)基因敲除。本文利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建穩(wěn)定敲除CBX2基因的A549細(xì)胞系。該細(xì)胞系為今后研究CBX2對肺腺癌的作用及分子機(jī)制提供了實(shí)驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株，質(zhì)粒和細(xì)胞系 DH5α購自北京博邁德生物公司，PX459載體購自Addgene公司，A549細(xì)胞購自ATCC公司。

1.2 主要試劑耗材 胎牛血清和高糖培養(yǎng)基購自Hyclone公司，胰酶購自Gibco公司，蛋白Marker購自Thermo Fisher Scientific公司，30%丙烯酰胺購自北京索萊寶公司，Opti-MEM購自Gibco公司，CBX2蛋白抗體和β-actin蛋白抗體購自Sigma公司，Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑購自Thermo Fisher Scientific公司，T4 PNK（T4多聚核苷酸激酶）和Bbs I限制性內(nèi)切酶及T4連接酶購自NEB公司，DNA小提試劑盒購自Tiangen公司，質(zhì)粒大提試劑盒購自北京莊盟生物公司。

1.3 PX459-CBX2-sgRNA質(zhì)粒構(gòu)建

1.3.1 載體酶切和回收 用Bbs I酶切PX459質(zhì)粒，酶切體系為：PX459 1 μg，Bbs I 1 μL，10X Buffer 2 μL，ddH2O 16 μL，37 ℃反應(yīng) 1 h。用新鮮的 TAE buffer配置1.5%DNA膠，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，用DNA膠回收試劑盒將質(zhì)粒條帶切膠回收。

1.3.2 引物退火延伸和添加磷酸根 反應(yīng)體系為sgRNA 上下游引物（100 μmol/L） 各 1 μL，T4 PNK（T4多聚核苷酸激酶）0.5 μL，T4連接酶 buffer 1 μL，ddH2O 6.5 μL。其中T4 PNK是一種多聚核苷酸5′羥基激酶，可以催化ATP的γ位磷酸基團(tuán)向單鏈或雙鏈DNA、RNA、寡核苷酸或帶有3′磷酸基團(tuán)的單核苷酸的5′羥基轉(zhuǎn)移。加完體系后將EP管放入37℃金屬浴30min，使引物5′端加上磷酸根。然后在95℃金屬浴放置5 min后，緩慢降溫到25℃（1℃/min），完成引物退火。

1.3.3 載體和引物連接 反應(yīng)體系為：經(jīng)過酶切回收的PX459載體質(zhì)粒1 μL，磷酸化和退火的引物1 μL，10X T4 連接酶 buffer 1 μL，T4 連接酶 1 μL，ddH2O 6 μL。16℃連接過夜。

1.3.4 轉(zhuǎn)化及重組質(zhì)粒測序 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α，挑取單克隆菌落并用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA。由華大基因公司對重組質(zhì)粒進(jìn)行測序。1.4 轉(zhuǎn)染細(xì)胞 將A549細(xì)胞鋪于6孔板，24 h后，使細(xì)胞密度達(dá)到70%。轉(zhuǎn)染體系為：Optimem200μL，重組質(zhì)粒 3 μg，Lipofectamine?2000 轉(zhuǎn)染試劑 6 μL。室溫靜置20 min，形成脂質(zhì)體后將轉(zhuǎn)染體系加入到6孔板細(xì)胞中，輕輕混勻，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染6 h后換成新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.5 細(xì)胞篩選及分離單克隆細(xì)胞 由于PX459載體中帶有嘌呤霉素抗性，所以成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞將有其抗性。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后加入含有1 μg/mL的嘌呤霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，72 h后將存活細(xì)胞消化，用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，稀釋為1個/100 μL的細(xì)胞濃度，將細(xì)胞傳入96孔板，每孔加100 μL細(xì)胞液，可得到單克隆細(xì)胞（每孔只有一個細(xì)胞）。將單克隆細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.6 單克隆細(xì)胞CBX2蛋白檢測 收取轉(zhuǎn)染PX459-CBX2-sgRNA的單克隆和轉(zhuǎn)染空載PX459單克隆細(xì)胞，PBS洗兩遍，再用200 μL PBS重懸。在細(xì)胞懸液中加入50 μL的5X蛋白緩沖液，放于95℃金屬浴震蕩加熱30 min。將蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE（80 V,120 min），轉(zhuǎn)膜（400 mA，90 min），用 5%脫脂牛奶封閉30 min，CBX2蛋白抗體（1:1 000）結(jié)合過夜，結(jié)合二抗后曝光。之后將膜用1 mol/L NaOH進(jìn)行洗脫，再重新結(jié)合β-actin抗體，檢測β-actin內(nèi)參蛋白表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 sgRNA的設(shè)計 在NCBI網(wǎng)站查詢CBX2的基因序列，在第一個外顯子區(qū)域設(shè)計針對CBX2敲除的sgRNA（圖1A）。sgRNA序列應(yīng)該位于Cas9蛋白識別的保守區(qū)PAM（NGG）之前。將CBX2第一個外顯子序列提交于麻省理工大學(xué)張峰sgRNA設(shè)計網(wǎng)站http://crispr.mit.edu/，得到5條待選序列（圖1B）。選出分?jǐn)?shù)最高的序列為CBX2-sgRNA序列，該序列對應(yīng)CBX2基因的位置如（圖1C）所示。在CBX2-sgRNA正向序列5′端添加CACCG堿基，在反向序列5′端添加AAAC堿基，在3′端添加末尾加上C堿基（表1），從而能夠與PX459質(zhì)粒經(jīng)BbsⅠ酶切后形成的黏性末端互補(bǔ)。

2.2 PX459-CBX2-sgRNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 將合成的CBX2-sgRNA兩條引物退火，形成雙鏈，并用T4 PNK在5′端加磷酸根。PX459質(zhì)粒用Bbs I酶切并切膠回收，與退火的CBX2-sgRNA連接，構(gòu)建PX459-CBX2-sgRNA質(zhì)粒（圖2A）。將PX459-CBX2-sgRNA重組質(zhì)粒測序，測序結(jié)果顯示CBX2-sgRNA：5′-CACCGCTTGCTCAGGATGCACT CGG-3′序列正確插入到PX459中（圖2B）。

表1 CBX2-sgRNA寡核苷酸序列Tab 1 The oligo sequences of CBX2-sgRNA

圖1 CBX2-sgRNA的設(shè)計Fig 1 Design of sgRNA of CBX2

圖2 PX459-CBX2-sgRNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定Fig 2 Construction and identification of PX459-CBX2-sgRNA recombinant plasmid

2.3 CBX2敲除細(xì)胞系構(gòu)建及鑒定 將PX459-CBX2-sgRNA重組質(zhì)粒和空載PX459分別轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞中，培養(yǎng)48 h后，加嘌呤霉素篩選轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞。經(jīng)過3 d的嘌呤霉素篩選（正常細(xì)胞無存活），將存活的細(xì)胞稀釋到96孔板中分離單克隆。選擇5個單克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并通過Western blot檢測細(xì)胞系中CBX2的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染空載PX459的單克隆細(xì)胞系相比，5個敲除細(xì)胞系中CBX2蛋白表達(dá)明顯降低（圖3）。

圖3 轉(zhuǎn)染PX459-CBX2-sgRNA質(zhì)粒的5個單克隆細(xì)胞系CBX2的表達(dá)量顯著低于對照組細(xì)胞Fig 3 The expression of CBX2 protein in five A549 CBX2 knockout cell lines was significantly lower than that in the control group

3 討論

PRC1對維持胚胎干細(xì)胞干性、調(diào)控細(xì)胞周期以及癌癥的發(fā)生和轉(zhuǎn)移有重要的作用。PRC1的經(jīng)典組分CBX蛋白家族有共同的結(jié)構(gòu)域：C端的PcR box（polycomb repressor box），N 端的染色質(zhì)區(qū)，和靠近N端的DNA結(jié)合區(qū)。C端結(jié)構(gòu)域主要發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制作用，還可以和PRC1另一組分泛素連接酶Ring1B蛋白相互作用。N端的染色質(zhì)區(qū)主要調(diào)控異染色質(zhì)和基因表達(dá)，并且可以結(jié)合H3K27me3。

雖然CBX能夠抑制轉(zhuǎn)錄，但是其在癌癥中的作用機(jī)制還不明確。有研究表明，小鼠CBX2同源基因M33敲低后，可以減弱E2F依賴性的細(xì)胞周期進(jìn)展，使小鼠胚胎成纖維細(xì)胞阻滯在G0/G1期[16]。在人類造血干細(xì)胞中，CBX2敲低能夠促進(jìn)抑癌基因p21的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡[17]。由此推測，CBX2極大可能在癌癥的發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中也發(fā)揮著重要作用，但是其具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。因此我們構(gòu)建穩(wěn)定敲除CBX2基因的肺腺癌細(xì)胞系對研究CBX2基因在肺腺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)理有重要的意義。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是種高效、方便的基因編輯工具，近年來研究人員對它不斷的改進(jìn)和應(yīng)用，使得該系統(tǒng)對基因編輯擁有多種優(yōu)勢，包括操作簡單，靶向精確性高，基因修飾率高，可遺傳，實(shí)驗成本小，周期短。本實(shí)驗利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，設(shè)計了針對CBX2敲除的sgRNA，并連入PX459載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞中，采用嘌呤霉素篩選細(xì)胞后，分離單克隆細(xì)胞，成功構(gòu)建了敲除CBX2基因的A549穩(wěn)定細(xì)胞系。但是由于腫瘤細(xì)胞存在染色體異常導(dǎo)致的多倍體細(xì)胞，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除基因，不能同時編輯多個等位基因，往往只能達(dá)到敲低的效果。采用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建CBX2敲除的細(xì)胞系克服了以往CBX2小干擾RNA（siRNA）效果差和用慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞引發(fā)的突變及不穩(wěn)定表達(dá)的缺點(diǎn)。該細(xì)胞系的構(gòu)建為CBX2在肺腺癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究奠定了實(shí)驗基礎(chǔ)。