左卡尼汀對(duì)多西他賽在NCI-H520細(xì)胞中抗腫瘤作用影響的研究

錢興運(yùn)，郎娟娟，陶若琳，吳春暖，王 晨

（天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院藥學(xué)部，國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津市“腫瘤防治”重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市惡性腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津300060）

多西他賽（docetaxel,DTX）是治療非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）最有效的藥物之一[1]，其能通過在腫瘤細(xì)胞有絲分裂期間形成無功能的微管束來抑制肺癌細(xì)胞的增殖[2]。DTX聯(lián)合鉑類藥物的治療方案是治療晚期NSCLC的一線治療方案[3]，在許多國家DTX也被批準(zhǔn)單獨(dú)作為二線治療藥物用于晚期NSCLC的治療[4]。盡管DTX在NSCLC的治療中扮演著重要角色，但是DTX同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生諸如竇性心動(dòng)過緩等多種心臟毒副作用[5]。

左卡尼汀（L-carnitine,L-CNT）是一種內(nèi)源性氨基酸，對(duì)哺乳動(dòng)物的能量代謝至關(guān)重要。已有研究表明L-CNT及其衍生物能夠阻止ROS的形成，清除自由基，并防止細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激[6]。近年來，很多研究也表明L-CNT在應(yīng)對(duì)化療藥物引起的心臟毒性和周圍神經(jīng)毒性方面有一定作用[7]。還有研究表明，L-CNT能夠抑制表柔比星等藥物在肺腺癌中的抗腫瘤作用[8-9]，然而在胃癌細(xì)胞中，L-CNT卻能增強(qiáng)5-氟尿嘧啶的抗腫瘤作用[10]。因此，L-CNT對(duì)不同化療藥物在不同腫瘤細(xì)胞中的影響是不同的。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在研究聯(lián)合給藥時(shí)，L-CNT對(duì)DTX抑制人肺癌細(xì)胞NCI-H520增殖作用的影響，并初步探索其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系 人肺癌NCI-H520細(xì)胞（天津腫瘤研究所生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室）。

1.2 儀器和試劑 細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱；IX70倒置光學(xué)顯微鏡；FACS流式細(xì)胞儀；左卡尼汀注射液；多西他賽注射液；胎牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)基；Annexin V-FITC/PI雙染凋亡試劑盒；兔抗人Bcl-2，Bax，P21和 P53抗體；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）；PI粉末；RNA 酶（RNase A）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將從液氮中取出的NCI-H520細(xì)胞復(fù)蘇后，接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于含5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長，待細(xì)胞生長密度達(dá)到培養(yǎng)皿的80%左右時(shí)，用0.25%含EDTA的胰蛋白酶消化細(xì)胞，待細(xì)胞收縮變圓時(shí)，用培養(yǎng)液終止消化，進(jìn)行傳代或稀釋成合適濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組 對(duì)照組：未被藥物處理過的細(xì)胞；L-CNT 組：只加 L-CNT（80 μg·mL-1）作用 24 h的細(xì)胞；DTX 組：只加 DTX（40 μg·mL-1）作用 24 h的細(xì)胞；聯(lián)合用藥組：同時(shí)加入 L-CNT（80 μg·mL-1）和 DTX（40 μg·mL-1）作用 24 h 的細(xì)胞。每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)獨(dú)立平行重復(fù)3次。

1.3.3 不同濃度的DTX對(duì)NCI-H520細(xì)胞增殖的影響 將終濃度為6×104個(gè)·mL-1的細(xì)胞懸液接種于96孔板中，每孔100 μL，恒溫培養(yǎng)24 h。分別設(shè)空白對(duì)照組，陰性對(duì)照組和不同濃度的藥物實(shí)驗(yàn)組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔?？瞻讓?duì)照組只加培養(yǎng)液，陰性對(duì)照組為培養(yǎng)液和細(xì)胞，藥物試驗(yàn)組為包含不同濃度DTX的培養(yǎng)液和NCI-H520細(xì)胞。待細(xì)胞貼壁后，將原培養(yǎng)液吸出，采用逐級(jí)稀釋的方法，將藥物終濃度稀釋成 0.25、2.5、5、10、25、50、100、200 μg·mL-1，每孔加入體積為200 μL的含藥培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后，每孔加入 20 μL MTT 溶液（5 mg·mL-1），恒溫孵育4 h，棄掉孔內(nèi)液體，每孔加入150 μL的DMSO溶液，低速震蕩15 min，在490 nm波長處測定吸光度，采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算24 h的IC50值（40 μg·mL-1）作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的 DTX 濃度。

1.3.4 MTT實(shí)驗(yàn) 以 6×104個(gè)·mL-1的終濃度將NCI-H520細(xì)胞懸液接種于96孔板中，每孔100 μL，恒溫培養(yǎng)24 h。根據(jù)“1.3.3”的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最終選用DTX 的濃度為其 IC50值（40 μg·mL-1），根據(jù)臨床給藥后的血藥濃度，確定L-CNT的濃度為80 μg·mL-1，實(shí)驗(yàn)分組如“1.3.2”所述，并且每個(gè)組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，其余實(shí)驗(yàn)步驟同“1.3.3”。

1.3.5 細(xì)胞凋亡 實(shí)驗(yàn)以1×105個(gè)·mL-1的終濃度將NCI-H520細(xì)胞懸液接種于6孔板中，待貼壁后，每孔加入終體積為2 mL的含藥培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)分組同“1.3.2”，藥物濃度如“1.3.4”所述。恒溫培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞懸液，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，1 200 r·min-1離心 5 min，棄上清，100 μL 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，每管加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI染料，避光條件下，4℃固定 30 min后，采用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率。

1.3.6 細(xì)胞周期 實(shí)驗(yàn)以1×105個(gè)·mL-1的終濃度將NCI-H520細(xì)胞懸液接種于6孔板中，待貼壁后，每孔加入終體積為2 mL的含藥培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)分組同“1.3.2”，藥物濃度如“1.3.4”所述。恒溫培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞懸液，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，用75%的乙醇重懸細(xì)胞，4℃過夜。1 500 r·min-1離心5 min，棄掉上清，并用PBS洗滌1次，用200 μL PBS重懸細(xì)胞，每管加10 mg·mL-1PI染料1 μL和10 mg·mL-1RNase A 溶液 1 μL，避光條件下，4℃固定30 min后，采用流式細(xì)胞儀測定周期。

1.3.7 蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn) 以1×105個(gè)·mL-1的終濃度將NCI-H520細(xì)胞懸液接種于6孔板中，待貼壁后，每孔加入終體積為2 mL的含藥培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)分組同“1.3.2”，藥物濃度如“1.3.4”所述。收集細(xì)胞懸液，使用SDS裂解液提取總蛋白，測定蛋白濃度，并確定上樣體積。配制12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE），每組上樣量為 20μg，采用80 V恒壓電泳，200 mA恒流轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉 1 h。一抗 P21（1∶1 000），P53（1∶1 000），BAX（1∶1 000），BCL-2（1∶1 000），內(nèi)參 β-actin（1∶2 000），4 ℃搖床過夜。二抗 P21（1∶2 000），P53（1 ∶2 000），BAX（1∶2 000），BCL-2（1∶2 000），內(nèi)參β-actin（1∶4 000），搖床室溫孵育 1 h，在暗室用化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）顯色曝光。將曝光結(jié)果進(jìn)行灰度分析，比較各組目標(biāo)蛋白表達(dá)量的變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本實(shí)驗(yàn)采用GraphPad Prim 5和SPSS來對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，所有實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)進(jìn)行3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s的形式表示，兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 L-CNT能夠增強(qiáng)DTX對(duì)NCI-H520細(xì)胞增殖的抑制作用 MTT的結(jié)果表明，DTX對(duì)NCI-H520細(xì)胞的抑制作用具有濃度依賴性，隨著藥物濃度的增加，抑制作用增強(qiáng)（圖1F）。在顯微鏡下觀察各組細(xì)胞生長情況，對(duì)照組和L-CNT細(xì)胞組細(xì)胞貼壁狀態(tài)良好，細(xì)胞密度大，胞膜完整，細(xì)胞間連接緊密（圖1A和1B）；DTX組細(xì)胞密度降低（圖1 C）；聯(lián)合用藥組細(xì)胞密度進(jìn)一步降低，細(xì)胞間隙變大（圖1 D）。MTT結(jié)果顯示，L-CNT對(duì)NCI-H520細(xì)胞的增殖無明顯影響，與L-CNT單藥組相比，L-CNT+DTX組細(xì)胞增殖率顯著降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；DTX能夠抑制NCI-H520細(xì)胞的增殖（P＜0.05）；與DTX單藥組相比，L-CNT+DTX組的細(xì)胞增殖率進(jìn)一步降低，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）（圖1 E）。結(jié)果表明，L-CNT能夠增強(qiáng)DTX對(duì)NCI-H520細(xì)胞增殖的抑制作用。

2.2 DTX在24 h不誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡 細(xì)胞凋亡的結(jié)果顯示，24 h時(shí)，L-CNT組，DTX組和L-CNT+DTX組的細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖2 A和2B），結(jié)果表明，L-CNT，DTX以及聯(lián)合用藥在24 h均不誘導(dǎo)NCI-H520細(xì)胞發(fā)生凋亡，結(jié)合“2.1”的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，表明DTX對(duì)NCI-H520細(xì)胞在24 h主要表現(xiàn)為抑制增殖的藥理作用。

2.3 L-CNT能夠增強(qiáng)DTX誘導(dǎo)的G2/M期阻滯 細(xì)胞周期的結(jié)果顯示，L-CNT對(duì)細(xì)胞周期沒有顯著影響，與L-CNT組相比，L-CNT+DTX組G2/M期細(xì)胞的比顯著升高，G1/G0期細(xì)胞顯著減少，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）；DTX能夠誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯（P＜0.01）；與 DTX 組相比，L-CNT+DTX 組 G2/M期細(xì)胞比例進(jìn)一步升高，G1/G0期細(xì)胞比例降低，且均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。結(jié)果表明，L-CNT能夠增強(qiáng)DTX誘導(dǎo)的G2/M期阻滯（圖3）。

2.4 L-CNT能增加P21和P53蛋白的表達(dá) Western blot結(jié)果顯示，同L-CNT組相比，L-CNT+DTX組細(xì)胞周期相關(guān)蛋白P21和P53的表達(dá)明顯增高（P＜0.05）；DTX能夠誘導(dǎo)P21和P53蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；同DTX組相比，L-CNT+DTX組P21和P53蛋白的表達(dá)量進(jìn)一步增高（P＜0.05）。而各實(shí)驗(yàn)組凋亡相關(guān)蛋白BAX和BCL-2的表達(dá)量沒有發(fā)生變化（圖4），說明L-CNT增強(qiáng)DTX抑制NCI-H520細(xì)胞增殖的能力可能是通過增強(qiáng)周期相關(guān)蛋白P21和P53的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。

圖1 L-CNT和DTX單藥以及聯(lián)合用藥對(duì)NCI-H520細(xì)胞增殖的作用Fig 1 The effects of L-CNT,DTX or combination drugs on NCI-H520 cell proliferation

圖2 L-CNT和DTX單藥以及聯(lián)合用藥對(duì)NCI-H520細(xì)胞凋亡的影響Fig 2 The effects of L-CNT,DTX or combination drugs on NCI-H520 cell apoptosis

圖3 L-CNT和DTX單藥以及聯(lián)合用藥對(duì)NCI-H520細(xì)胞周期的影響Fig 3 The effects of L-CNT,DTX or combination drugs on NCI-H520 cell cycle

圖4 L-CNT和DTX單藥以及聯(lián)合用藥對(duì)NCI-H520細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響Fig 4 The effects of L-CNT,DTX or combination drugs on the expression of proteins in NCI-H520 cells

3 討論

DTX屬于第二代紫杉烷類抗腫瘤藥物，其能通過在腫瘤細(xì)胞有絲分裂期間，增強(qiáng)微管蛋白的聚合作用并抑制其解聚，進(jìn)而形成無功能的微管束，將腫瘤細(xì)胞增殖阻滯于G2/M期來抑制肺癌細(xì)胞的增殖。L-CNT及其衍生物能夠阻止ROS的形成，清除自由基，并防止細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，從而發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。

細(xì)胞周期受多種細(xì)胞通路調(diào)控，其中P53-P21通路發(fā)揮重要作用。P53是一種重要的腫瘤抑制基因[11]，參與誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，進(jìn)行DNA修復(fù)等以響應(yīng)各種細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，包括DNA損傷，致癌應(yīng)激，端粒功能障礙和缺氧等[12-13]。在細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)中，P53主要負(fù)責(zé)監(jiān)測G0/G1和G2/M期的修正點(diǎn)，以起到調(diào)節(jié)周期的作用[14]。此外，它還能調(diào)節(jié)下游P21基因的表達(dá)[15]，并在細(xì)胞增殖中起重要作用。P21是P53的下游基因，其編碼的P21Cip/Wafl蛋白是具有廣泛激酶抑制活性的細(xì)胞周期抑制蛋白。P21Cip/Wafl與cyclinD，CyclinE和CDK2一起在細(xì)胞周期抑制中發(fā)揮作用[16-18]，P21的表達(dá)能夠誘導(dǎo)G1期，G2/M期或S期阻滯[19]，進(jìn)而發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖的效應(yīng)。

由本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，我們觀察到，DTX與L-CNT聯(lián)合應(yīng)用后，周期相關(guān)蛋白P53與P21表達(dá)升高，細(xì)胞G2/M期阻滯增強(qiáng)。這可能是L-CNT的加入，使NCI-H520細(xì)胞中P53的蛋白表達(dá)量增加，進(jìn)而誘導(dǎo)下游的P21蛋白表達(dá)升高，激活P53-P21通路發(fā)揮細(xì)胞周期抑制作用；有研究表明，DTX誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生晚于其誘導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯[20]，本研究的結(jié)果也表明DTX在NCI-H520細(xì)胞中的抗腫瘤作用，在24 h時(shí)，只表現(xiàn)為對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用，而不誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，因此，關(guān)于L-CNT對(duì)DTX誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響還有待進(jìn)一步研究。此外，本文只針對(duì)L-CNT和DTX同時(shí)給藥24 h進(jìn)行了研究，而對(duì)于L-CNT和DTX的給藥順序是否會(huì)對(duì)其作用產(chǎn)生影響，仍有待于進(jìn)一步研究。腫瘤病理錯(cuò)綜復(fù)雜，不同病理分型的腫瘤對(duì)于化療藥物的敏感性不同，而L-CNT與不同的化療藥物聯(lián)合應(yīng)用所產(chǎn)生的相互作用也不盡相同，因此，在使用左卡尼汀預(yù)防或降低心臟毒性的同時(shí)，如何更合理地與抗腫瘤藥物聯(lián)合應(yīng)用，值得進(jìn)一步研究。