不同miR-146a表達條件下Treg細胞體內(nèi)回輸對小鼠心臟移植免疫排斥反應的影響

于 洋 ，曹際森 ，王多偉 ，戚 峰

（1.天津醫(yī)科大學總醫(yī)院普通外科，天津300052；2.天津港口醫(yī)院外科，天津300456；3.天津市第三中心醫(yī)院肝膽外科,天津300170）

研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)T細胞負責維持體內(nèi)免疫穩(wěn)態(tài)和免疫耐受[1]，隨著對其功能研究的不斷深入，相關人員已將其應用于抑制器官移植的免疫耐受。近年來相關研究表明miRNA通過調(diào)控免疫相關基因的表達影響免疫系統(tǒng)的發(fā)育及功能[2]，其中miR-146a是目前研究較為廣泛的miRNA之一，它在不同物種間的序列高度保守，并且在器官移植免疫排斥過程中發(fā)揮著重要的作用[3]。大量研究發(fā)現(xiàn)miR-146a在Treg細胞的抑制功能的發(fā)揮上起著重要的調(diào)控作用[4-5]。在此基礎上，本研究的主要目的是探討Treg細胞體內(nèi)回輸對小鼠心臟移植免疫排斥反應的影響以及進一步調(diào)控miR-146a的表達對Treg細胞抑制功能的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 實驗選用6～8周齡雄性C57，Balb/c小鼠（購于中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所實驗動物中心，體質(zhì)量20～25 g)，飼養(yǎng)于天津醫(yī)科大學總醫(yī)院實驗動物中心。

1.2 實驗方法

1.2.1 Treg細胞的分選及體外擴增 無菌條件下獲取及處理脾臟，加入PBS制備脾單細胞懸液，單細胞懸液白細胞計數(shù)，用PBS調(diào)整細胞密度為1×106，流式標本的制備后立刻上機分選CD4+CD25+Treg細胞，采用德國美天旎公司的Treg細胞體外擴增試劑盒按說明書完成CD4+CD25+Treg細胞的體外擴增。

1.2.2 Treg細胞轉染 對擴增之后的Treg細胞采用廣州銳博公司的miR-146a agomir和miR-146a antagomir試劑進行細胞轉染，分別實現(xiàn)對Treg細胞miR-146a表達水平的上調(diào)和下調(diào)。具體實驗步驟如下：用完全1640培養(yǎng)基重懸細胞后，進行細胞計數(shù)并檢測細胞活力。然后用完全培養(yǎng)基按3×105/mL的密度接種在24孔板中。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育30min。分別在相應孔中加入100nmol/L agomir及150 nmol/L antagomir對Treg細胞轉染，之后置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)3 d后進行下一步檢測。

1.2.3 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-PCR） 采用RT-PCR方法檢測轉染后調(diào)節(jié)T細胞的miR-146a表達水平。具體步驟包括：總miRNA提取，miRNA逆轉錄，實時定量PCR，用2-△Ct將原始數(shù)據(jù)（△Ct值）轉化成線性形式進行統(tǒng)計處理，再以2-△△CT方法計算miRNA的相對表達量。

1.2.4 小鼠腹腔異位心臟移植模型的建立及處理 取Balb/c小鼠心臟作為供體，以C57小鼠作為受體，構建小鼠腹腔異位心臟移植模型[6-7]。實驗分為NS對照組、Treg對照組、agomir組、antagomir組。于移植手術完成后立即經(jīng)陰莖背靜脈推注相應轉染后的Treg細胞（數(shù)量均為106個）。術后小鼠分為兩部分，一部分小鼠每日經(jīng)腹壁觸摸移植心臟搏動情況，直到供心停跳，記錄各組供心存活時間。另一部分小鼠在術后第5天處死，取部分移植心臟組織用福爾馬林固定，石蠟包埋后切片，行HE染色；流式檢測受體脾臟中T細胞亞群及Th細胞的比例；RT-PCR技術檢測術后 5 d供心IFN-γ、IL-4、IL-17mRNA的表達水平，實時定量PCR的實驗方法同前，相關因子引物序列如下：

1.3 統(tǒng)計學處理 所有實驗均重復6次，所得實驗數(shù)據(jù)運用SPSS19.0軟件包進行統(tǒng)計學處理。計量資料表示為±s，兩樣本之間的比較采用t檢驗，3組以上比較采用方差分析（one-way ANOVA），組間均數(shù)間多重比較采用最小顯著差法（least significant difference,LSD）。

2 結果

2.1 Treg細胞擴增前后的純度及miR-146a表達水平檢測 Treg細胞經(jīng)擴增試劑盒擴增后，流式檢測結果顯示細胞數(shù)量達擴增前的10倍，純度為92.3%,如圖1所示。RT-PCR結果顯示，擴增前后Treg細胞miR-146a的表達水平無顯著差異（P＞0.05），見表1。

圖1 Treg細胞擴增前后的純度檢測Fig 1 The purity of Treg cells before and after cell amplification

表1 擴增前后miR-146a的表達水平檢測Tab 1 Expression of miR-146a before and after cell amplification

2.2 各組小鼠心臟移植術后生存曲線分析 如圖2所示，與生理鹽水對照組相比，輸注空白Treg細胞能夠明顯延長供心的生存時間，在此基礎上應用miR-146a agomir上調(diào)Treg細胞中miR-146a的表達，能夠使供心生存時間進一步延長（P＜0.05），與之相反的是，輸注下調(diào)miR-146a的Treg細胞卻使得供心生存時間較空白Treg組顯著縮短（P＜0.05）。

圖2 各組小鼠心臟移植術后生存曲線分析Fig 2 The survival curves of mice after heart transplantation in each group

2.3 各組小鼠心臟移植術后5 d供心病理分析 對術后5 d各組供心進行了病理學分析，如圖3、表2、3所示，miR-146a上調(diào)組的急性排斥反應病理分級較空白 Treg組顯著降低（P＜0.05），而 miR-146a下調(diào)組急性排斥反應病理分級較空白Treg組顯著升高（P＜0.05）。

圖3 各組移植心臟HE染色Fig 3 HE-staining of donor hearts in each group

表2 各組移植心臟病理分級Tab 2 The pathological grades of donor hearts in each group

表3 各組間病理結果兩兩比較（P）Tab 3 Paired comparison of thepathologicalgradesineachgroup（P）

2.4 各組小鼠心臟移植術后5 d受體脾臟T細胞亞群檢測 流式結果顯示，與空白Treg組相比，miR-146a上調(diào)組CD4+T細胞數(shù)量顯著降低（P＜0.05），CD8+T細胞數(shù)量無明顯區(qū)別（P＞0.05），而 miR-146a下調(diào)組 CD4+、CD8+T 細胞數(shù)量無明顯區(qū)別（P＞0.05），如圖4和表4、5所示。

表4 各組受體小鼠術后5 d脾臟T細胞亞群分析Tab 4 Cells of spleen in recipients by flow cytometry on the 5th day after transplantation

表5 各組間CD4+結果兩兩比較（P）Tab 5 Paired comparison of CD4+in each group（P）

2.5 各組受體小鼠心臟移植術后5 d脾臟Th細胞亞群檢測 與空白Treg組相比，miR-146a上調(diào)組Th1、Th2和 Th17細胞數(shù)量無明顯差別（P＞0.05）；而miR-146a下調(diào)組Th1細胞數(shù)量顯著升高（P＜0.05），Th2和Th17細胞數(shù)量無明顯區(qū)別（P＞0.05），如表6、7所示。

表6 各組受體小鼠術后5 d脾臟Th細胞亞群分析Tab 6 Th cells of spleen in recipients by flow cytometry on the 5th day after transplantation

表7 各組間Th1細胞結果兩兩比較（P）Tab 7 Paired comparison of Th1 cells in each group（P）

圖4 各組術后5 d受體脾臟T細胞亞群流式檢測Fig 4 T cells of spleen in recipients by flow cytometry on the 5th day after transplantation

2.6 各組受體小鼠心臟移植術后5 d供心相關細胞因子表達水平 如表8、9所示，與空白Treg組相比，miR-146a上調(diào)組供心IFN-γ、IL-4和IL-17的表達水平無明顯差別（P＞0.05）；而miR-146a下調(diào)組供心 IFN-γ 的表達水平顯著升高（P＜0.05），IL-4、IL-17的表達水平無明顯區(qū)別（P＞0.05）。

表8 各組受體小鼠術后5 d供心相關細胞因子檢測Tab 8 Expression of related cytokines of donor hearts in recipients on the 5th day after transplantation

表9 各組間IFN-γ結果兩兩比較（P）Tab 9 Paired comparison of the expression of IFN-γ in each group（P）

3 討論

器官移植的最終目的是受體對移植物產(chǎn)生類似于自身耐受的狀態(tài)。早在1995年便有相關報道Treg細胞具有維持免疫耐受的作用。相關器官移植模型建立也表明其在維持免疫耐受的重要作用。Treg細胞作為一種治療手段在幾十年前出現(xiàn)[8]。Lee等通過小鼠骨髓移植模型證明了回輸Treg細胞可以有效的防止移植物抗宿主病的發(fā)生或延緩病程進展。Treg是目前用于I期臨床試驗較多的調(diào)節(jié)T細胞，其通過細胞接觸式和非細胞接觸式兩種方式實現(xiàn)免疫抑制。但是單一的抑制性細胞因子治療卻不能達到滿意的治療及抑制效果。而互噬作用可能會成為未來臨床免疫耐受研究的新途徑[9]。miRNA近年來成為免疫學領域的新熱點，其能調(diào)控相關基因來影響免疫功能，進而參與更多自身免疫疾病發(fā)展。研究表明，miR-146a在器官移植的免疫排斥過程中起著重要的調(diào)控作用，而且研究人員證實，miR-146a對于Treg細胞的功能發(fā)揮也起著重要作用[10-11]?；谙嚓P文獻，我們將不同miR-146a表達條件下Treg細胞在小鼠心臟移植后回輸體內(nèi)，假設被移植心臟抗原激活效應T細胞，可被Treg細胞識別為自身反應性T細胞，從而被抑制，由此在受體內(nèi)長期存在的，針對移植抗原記憶的Treg細胞，形成自身耐受的耐受模式，這就是的本課題的研究思路。Treg細胞是通過細胞間的直接作用來實現(xiàn)的[12]，結合體外抑制實驗得出要想實現(xiàn)有效的抑制功能，必須要滿足足量的細胞數(shù)量。大量動物實驗表明，要想達到回輸?shù)挠行ё饔茫毎麛?shù)量要達到106以上，而常規(guī)體外分選所得的Treg細胞數(shù)量極為有限[13]，因此獲得足夠細胞數(shù)量，一直困擾從事細胞回輸?shù)难芯咳藛T，2009年研究人員首次成功地用體外擴增Treg細胞解決了細胞數(shù)量不足的困擾[14]。本實驗采用擴增試劑盒有效獲得滿意細胞數(shù)量，并維持了Treg細胞的細胞表型及免疫功能。我們的實驗結果表明，體內(nèi)回輸空白Treg及上調(diào)miR-146a表達后的Treg可減輕急性免疫排斥反應，延長移植心臟存活期，減輕移植心臟病理炎癥反應，上調(diào)組作用更為明顯。這進一步證實了miR-146a對Treg細胞起著重要的調(diào)控作用，上調(diào)Treg細胞中miR-146a的表達能夠進一步增強其抑制功能，其具體機制也有待于進一步深入研究。但是，我們的實驗也發(fā)現(xiàn)回輸下調(diào)miR-146a的Treg細胞后，生存時間較空白Treg組縮短，病理分級明顯升高。在對移植物Th細胞的流式檢測中我們發(fā)現(xiàn)下調(diào)組Th1較Treg對照組及上調(diào)組明顯升高，對應的細胞因子IFN-γ也明顯升高。由此可知下調(diào)miR-146a的Treg細胞抑制功能受到破壞，其具體機制可能是下調(diào)Treg細胞的miR-146a表達水平使其抑制Th1分泌IFN-γ的功能受損[15]。綜上所述，體外能有效的分選和擴增Treg細胞，且不影響miR-146a的表達。回輸Treg明顯抑制小鼠心臟移植急性排斥反應，上調(diào)組抑制功能增強，下調(diào)組抑制功能減弱。但是回輸后的Treg細胞能否在體內(nèi)進行擴增，或者細胞不斷凋亡對于移植免疫反應的影響還需進一步研究。關于miR-146a和Treg細胞在心臟移植免疫耐受的作用及機制還需要更深入的研究。