CRP熒光免疫層析定量檢測(cè)儀

楊建鵬 高躍明 魏建崇 陳建國(guó) 姜海燕,5

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CRP熒光免疫層析定量檢測(cè)儀

楊建鵬1,2高躍明1,2魏建崇2,3陳建國(guó)2,4姜海燕2,4,5

（1. 福州大學(xué)物理與信息工程學(xué)院，福州 350108； 2. 福建省醫(yī)療器械和醫(yī)藥技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350108； 3. 江夏學(xué)院電子信息科學(xué)學(xué)院，福州 350116； 4. 福州大學(xué)電氣工程與自動(dòng)化學(xué)院，福州 350108； 5. 福建省激光精密加工工程技術(shù)研究中心，福建 莆田 351100）

本文研制開(kāi)發(fā)一套用于血清C-反應(yīng)蛋白（CRP）定量檢測(cè)的熒光免疫層析試紙檢測(cè)設(shè)備。運(yùn)用CMOS圖像傳感器采集熒光試條圖像信息，使用數(shù)學(xué)形態(tài)學(xué)方法濾除圖像噪聲，使用Otsu圖像閾值分割算法得到圖像有用信息進(jìn)而計(jì)算得到檢測(cè)結(jié)果。本文采用多種不同濃度的熒光免疫層析試紙條進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該CRP熒光免疫層析定量檢測(cè)儀的重復(fù)性和線性度良好，＜3.4%，擬合優(yōu)度2＞99%。結(jié)論：該檢測(cè)儀有著良好的性能，能夠準(zhǔn)確檢測(cè)CRP的數(shù)值。

CRP；熒光免疫層析；圖像

C反應(yīng)蛋白（C-reactive protein, CRP）是由人體體內(nèi)的肝臟在應(yīng)激狀態(tài)下生成的蛋白質(zhì)[1]。當(dāng)人體發(fā)生組織損傷、急性炎癥、細(xì)菌性感染、冠心病、惡性腫瘤等情況時(shí)，CRP的含量會(huì)隨著病情的嚴(yán)重而升高[2-5]。由于機(jī)體的CRP濃度與炎癥之間存在相關(guān)性，因此醫(yī)學(xué)上將CRP廣泛應(yīng)用于衡量或監(jiān)測(cè)體內(nèi)感染、組織損傷以及某些炎癥疾病的發(fā)展，尤其是作為心血管疾病預(yù)測(cè)和愈后評(píng)價(jià)的標(biāo)志分子[6]。當(dāng)人體發(fā)生病原菌感染時(shí)，由于身體的應(yīng)激反應(yīng)而導(dǎo)致CRP發(fā)生較大的變化，通過(guò)監(jiān)測(cè)CRP的含量，可以達(dá)到診斷感染的作用[8]。

傳統(tǒng)CRP檢測(cè)采用單向免疫擴(kuò)散法（SRID）[7-8]、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELIS）[9]等方法，但單項(xiàng)免疫擴(kuò)散法的檢測(cè)敏感性較差、在抗原過(guò)量時(shí)容易出現(xiàn)假陰性，準(zhǔn)確性欠佳；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法采用酶作為標(biāo)記物，缺點(diǎn)是酶標(biāo)記物容易變質(zhì)、檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)[2]。

熒光免疫層析方法以熒光標(biāo)記物作為示蹤劑標(biāo)記，通過(guò)光學(xué)儀器檢測(cè)待測(cè)樣本，直接或間接獲取待測(cè)物有用信息，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定物質(zhì)的定量檢測(cè)。本研究針對(duì)傳統(tǒng)CRP檢測(cè)方法的不足，采用基于圖像處理的熒光免疫層析方法，開(kāi)發(fā)一款用于檢測(cè)CRP的熒光免疫層析定量檢測(cè)儀。

1 實(shí)現(xiàn)方法

1.1 系統(tǒng)總體組成結(jié)構(gòu)及工作原理

在CRP樣本溶液滴入檢測(cè)試條后，其與熒光標(biāo)記物發(fā)生特異性反應(yīng)。經(jīng)反應(yīng)后，熒光試條檢測(cè)窗口上的檢測(cè)帶（T帶）與質(zhì)控帶（C帶）含有較多的熒光標(biāo)記物，因此被激發(fā)出高強(qiáng)度的熒光強(qiáng)度，而其他區(qū)域的熒光標(biāo)記物較少，所以被激發(fā)出的熒光強(qiáng)度較微弱。T帶的熒光強(qiáng)度直接反應(yīng)了CRP樣本溶液的濃度值，C帶則是對(duì)T帶起對(duì)照的作用，消除環(huán)境等因素的影響。

檢測(cè)儀采用圖像式檢測(cè)方法，將充分反應(yīng)后的熒光免疫層析試條放入儀器檢測(cè)，在激發(fā)光源的照射下發(fā)出熒光，通過(guò)圖像傳感器采集熒光試條圖像信息，并將其傳輸給圖像處理設(shè)備，該設(shè)備對(duì)熒光試條圖像信息進(jìn)行處理。

圖像傳感器采用等間隔均勻量化，圖像的灰度值正比于設(shè)備光敏單元的輸出信號(hào)。因此，將檢測(cè)線的灰度值與控制線的灰度值的比值作為特征值/，特征值與待測(cè)溶液濃度成正比。計(jì)算T帶與C帶灰度值的比值/，將得到的結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)刻度曲線進(jìn)行對(duì)比，即可得到CRP樣本溶液的濃度值，達(dá)到定量檢測(cè)的功能。檢測(cè)儀總體組成結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 CRP熒光免疫層析定量檢測(cè)儀總體組成結(jié)構(gòu)

1.2 硬件系統(tǒng)

本文選用Eu3+螯合劑作為熒光標(biāo)記物，Eu3+螯合劑熒光光譜中吸收波長(zhǎng)范圍較寬，在波長(zhǎng)為230～370mm的光線激發(fā)下，發(fā)射出610nm的熒光信號(hào)?？紤]熒光標(biāo)記物的特性，采用TH-UV365T3WA- 3535-B紫外光LED作為激發(fā)光源，該光源采用貼片式封裝，燈珠呈半球形，具有顯色性高、穩(wěn)定性好、體積小、能耗低的特點(diǎn)。

圖像傳感器主要分為CCD圖像傳感器和CMOS圖像傳感器，二者均有各自的優(yōu)點(diǎn)。CCD圖像傳感器具有靈敏度高、噪點(diǎn)低的優(yōu)點(diǎn)，但是其存在成本高、功耗高的缺點(diǎn)；CMOS圖像傳感器具有低成本、低功耗以及高整合度的優(yōu)點(diǎn)，但噪聲性能不及CCD圖像傳感器。綜合成本、成像質(zhì)量等因素考慮，檢測(cè)儀選用華谷動(dòng)力公司研發(fā)設(shè)計(jì)UF系列的WP- UF500M型號(hào)的CMOS圖像傳感器采集圖像，傳感器具有500萬(wàn)像素，自帶32MB緩存，具有快速穩(wěn)定的圖像傳輸速度。

檢測(cè)儀光路結(jié)構(gòu)采用雙邊斜射式檢測(cè)系統(tǒng)，保證激發(fā)光源能夠均勻照射熒光免疫層析試條。檢測(cè)裝置如圖2所示。裝置由波長(zhǎng)為365nm的LED激發(fā)光源、CMOS攝像機(jī)和透射波長(zhǎng)分別為365nm與610nm的濾光片組成，濾光片可以濾除無(wú)關(guān)波長(zhǎng)的光線。激發(fā)光源照射在C帶和T帶上，產(chǎn)生波長(zhǎng)為610nm的發(fā)射光，經(jīng)過(guò)濾波片進(jìn)入CMOS圖像傳感器，傳輸?shù)綀D像處理設(shè)備。

圖2 CRP熒光免疫層析檢測(cè)儀

1.3 軟件設(shè)計(jì)

圖像處理設(shè)備接收到從試條圖像獲取設(shè)備傳過(guò)來(lái)的熒光試條圖像，對(duì)圖像進(jìn)行處理，處理過(guò)程如圖3所示。

圖3 熒光試條圖像處理流程圖

圖像獲取設(shè)備在采集圖像信號(hào)的過(guò)程中因環(huán)境等因素會(huì)出現(xiàn)噪聲[10]，這些噪聲對(duì)檢測(cè)結(jié)果會(huì)造成不利影響，導(dǎo)致出現(xiàn)誤差[11]。因此在圖像分割之前，必須對(duì)原始圖像信號(hào)進(jìn)行濾除噪聲的處理。根據(jù)圖像特性，本文利用數(shù)學(xué)形態(tài)學(xué)方法[12]濾除噪聲，先進(jìn)行開(kāi)運(yùn)算，平滑圖像輪廓，切割細(xì)線，去除邊緣毛刺和異常值，磨光圖像外邊界，再進(jìn)行閉運(yùn)算，在圖像中連接較短的斷點(diǎn)，添補(bǔ)小間隙，并對(duì)圖像的內(nèi)部邊沿進(jìn)行平滑。

鑒于試條C帶和T帶分別在試條的兩側(cè)，因此對(duì)圖像的處理分為左右兩部分，分別采用Otsu閾值分割準(zhǔn)則[13]。該算法概述如下：

設(shè)圖像的灰度級(jí)數(shù)為，每個(gè)灰度值出現(xiàn)的概率為，閾值將不同的灰度值分成目標(biāo)A（灰度值為0～）與背景B（灰度值為+1～-1）。

則目標(biāo)A和背景B的出現(xiàn)的概率分別為

目標(biāo)A和背景B的灰度均值分別為

圖像總的灰度均值為

目標(biāo)和背景的類間方差：

因此，最佳判別閾值需滿足

用Otsu閾值分割算法所得的閾值對(duì)熒光試條圖像進(jìn)行分割，得到檢測(cè)線和控制線的灰度值，分割效果如圖4所示。

為檢驗(yàn)分割效果，本文分別使用迭代法與Otsu分割算法對(duì)不同濃度的熒光試條圖像進(jìn)行分割，并使用區(qū)域一致性作為分割算法的對(duì)比，比較結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 分割算法的區(qū)域一致性

分別采用1.95mg/mL、7.81mg/mL、62.5mg/mL三種試條進(jìn)行檢測(cè)對(duì)比。從表1對(duì)比中看出，Otsu的區(qū)域一致性優(yōu)于迭代分割算法。

2 實(shí)驗(yàn)及數(shù)據(jù)分析

2.1 重復(fù)性

重復(fù)性原則是科學(xué)研究最重要的標(biāo)準(zhǔn)之一。一般情況下，科學(xué)實(shí)驗(yàn)的研究應(yīng)當(dāng)是可重復(fù)的，這意味著實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有客觀性[14]。尤其對(duì)于檢測(cè)類儀器來(lái)說(shuō)，可重復(fù)性原則是衡量其儀器性能的重要指標(biāo)之一。

分別選取1.95mg/mL、7.81mg/mL、31.25mg/mL、125mg/mL四種濃度的熒光免疫層析試條作為檢測(cè)試條。將四種不同濃度的熒光免疫層析試條分別送入CRP熒光免疫層析試條檢測(cè)儀檢測(cè)。為保證實(shí)驗(yàn)室的可靠性，由同一測(cè)試人員在相同環(huán)境下用同樣的儀器對(duì)同一根待測(cè)試條進(jìn)行5次重復(fù)檢測(cè)，并將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄下來(lái)，見(jiàn)表2。

表中采用變異系數(shù)（）作為儀器重復(fù)性的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)

式中，()表示測(cè)試數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)差，()表示測(cè)試數(shù)據(jù)的平均值。從表2可以看出，檢測(cè)儀的檢測(cè)結(jié)果值在0～3.35%之間。

表2 CRP熒光試條檢測(cè)結(jié)果

2.2 線性度

使用最小二乘法對(duì)不同濃度CRP溶液的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行曲線擬合，擬合結(jié)果如圖5所示。

圖5 儀器的檢測(cè)結(jié)果線性度

線性關(guān)系為

=0.0237+0.0572 （9）

式中，表示特征值/；表示待測(cè)液濃度，直線擬合優(yōu)度2＞0.99，實(shí)驗(yàn)表明，在可測(cè)范圍內(nèi)，儀器的線性度良好。

3 結(jié)論

CRP作為人體檢測(cè)炎癥的標(biāo)志物，在血液生化檢測(cè)中的作用越來(lái)越大[15]。本研究克服傳統(tǒng)CRP檢測(cè)方法的不足，設(shè)計(jì)基于圖像處理的熒光免疫層析試條檢測(cè)儀。本文詳細(xì)闡述了檢測(cè)儀檢測(cè)裝置的硬件設(shè)計(jì)與軟件設(shè)計(jì)。針對(duì)熒光試條圖像信號(hào)，采用數(shù)學(xué)形態(tài)學(xué)濾除噪聲，Otsu閾值分割方法獲取圖像信息，得到定量檢測(cè)結(jié)果。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本文研制的檢測(cè)儀的檢測(cè)結(jié)果變異系數(shù)值小于3.4%，擬合優(yōu)度大于99%，與德國(guó)Qiagen公司研發(fā)的ESE檢測(cè)儀相比，值無(wú)太大差異，而線性擬合優(yōu)度更高。這表明檢測(cè)儀重復(fù)性高，線性度好。除此之外，為了能進(jìn)一步提高檢測(cè)系統(tǒng)的便攜性，還可研發(fā)一個(gè)檢測(cè)終端系統(tǒng)，擺脫檢測(cè)儀對(duì)于PC的依賴，移植檢測(cè)系統(tǒng)到終端上，進(jìn)一步減小儀器的體積。

[1] Li Y P, Mold C, Du Clos T W. Sublytic complement attack exposes C-reactive protein binding sites on cell membranes[J]. Journal of Immunology (Baltimore, Md.: 1950), 1994, 152(6): 2995-3005.

[2] 陳俊蕾, 張唯, 李新霞, 等. 背景熒光猝滅-免疫層析法檢測(cè)C-反應(yīng)蛋白[J]. 高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào), 2018, 39(1): 41-47.

[3] Moutachakkir M, Lamrani Hanchi A, Baraou A, et al. Immunoanalytical characteristics of C-reactive protein and high sensitivity C-reactive protein[J]. Annales de Biologie Clinique, 2017, 75(2): 225-229.

[4] Dow C A, Templeton D L, Lincenberg G M, et al. Elevations in C-reactive protein and endothelin-1 system activity in humans[J]. Life Sciences, 2016, 159: 66-70.

[5] 楊善敏, 劉少忠. 冠心病患者C反應(yīng)蛋白測(cè)定的臨床意義[J]. 安徽醫(yī)學(xué), 2009, 30(8): 937-938.

[6] 姚振宇, 武一, 吉尚戎. CRP變構(gòu)及其促炎機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)科學(xué): 生命科學(xué), 2017(8): 863-870.

[7] Ghazavi A, Mosayebi G, Solhi H, et al. Serum markers of inflammation and oxidative stress in chronic opium (Taryak) smokers[J]. Immunology Letters, 2013, 153(1/2): 22-26.

[8] Tagata K, Yokoyama S, Ginbo T, et al. Quantitative capillary reversed passive latex agglutination test for C-reactive protein (CRP) in the dog[J]. Veterinary Research Communications, 1996, 20(1): 21-30.

[9] Zhang Xiaolu, Liu Juntian, Pang Xiaoming, et al. Eplerenone inhibits aldosterone-induced CRP Gener- ation in rat vascular smooth muscle cells by regulating the MR-ROS-ERK1/2 signal pathway[J]. European Journal of Inflammation, 2017, 15(3): 210- 218.

[10] 艾建勇, 金立軍. 基于紫外圖像的接觸網(wǎng)棒瓷絕緣子污穢狀態(tài)檢測(cè)[J]. 電工技術(shù)學(xué)報(bào), 2016, 31(10): 112-118.

[11] 王欣, 孫鵬. 智能變電站中指針式儀表圖像自動(dòng)識(shí)別方法[J]. 電氣技術(shù), 2016, 17(5): 7-10.

[12] 申洪明, 黃少鋒, 費(fèi)彬, 等. 基于數(shù)學(xué)形態(tài)學(xué)的換相失敗檢測(cè)新方法[J]. 電工技術(shù)學(xué)報(bào), 2016, 31(4): 170-177.

[13] 喬玲玲. 圖像分割算法研究及實(shí)現(xiàn)[D]. 武漢: 武漢理工大學(xué), 2009.

[14] 周莉. 單相電能表自動(dòng)檢定流水線系統(tǒng)的應(yīng)用研究[J]. 電氣技術(shù), 2014, 15(2): 59-63.

[15] 林婉媚, 彭成豐. 血液生化指標(biāo)CRP在臨床上的檢測(cè)意義[J]. 中國(guó)社區(qū)醫(yī)師: 醫(yī)學(xué)專業(yè), 2010(20): 181.

The CRP fluorescence immunochromatography quantitative detector

Yang Jianpeng1,2Gao Yueming1,2Wei Jianchong2,3Chen Jianguo2,4Jiang Haiyan2,4,5

(1. College of Physics and Telecommunication Engineering, Fuzhou University, Fuzhou 350108; 2. Key Laboratory of Medical Instrumentation and Pharmaceutical Technology of Fujian Province, Fuzhou 350108; 3. College of electrics and information science, Fujian Jiangxia University, Fuzhou 350116; 4. College of Electrical Engineering and Automation, Fuzhou University, Fuzhou 350108; 5. Precision Machining Engineering Technology Research Center, Putian, Fujian 351100)

In this study, a set of fluorescence immunochromatographic quantitative detector for serum c-reactive protein (CRP) is developed. The image information of fluorescent strips is collected by using CMOS image sensor, and the image noise is filtered out by the method of mathematical morphology. The Otsu threshold segmentation algorithm is used to obtain the information of the image and to calculate the results. In this study, a number of different concentrations of fluorescence immunochromatographic strips are used to detect. The result shows that the CRP fluorescence immunochromatographic detector has good repeatability, and linearity.＜3.4% and fit2＞99%. The detector has good performance and can accurately detect CRP value.

CRP; fluorescence immunochromatography; image

2018-03-07

楊建鵬（1991-），福建省漳州市人，碩士研究生，主要從事醫(yī)學(xué)檢測(cè)與處理的研究工作。

福建省科技重大專項(xiàng)（2014YZ0001）