osw2對(duì)釀酒酵母孢子固定化酶影響的分析

趙 強(qiáng)， 李子杰， 中西秀樹(shù)， 高曉冬

（江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122）

釀酒酵母細(xì)胞當(dāng)生長(zhǎng)條件比較惡劣，缺乏氮源并在非發(fā)酵型的碳源存在下，進(jìn)行減數(shù)分裂，進(jìn)而產(chǎn)生單倍體孢子[1-2]。釀酒酵母營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞壁由兩部分組成[3-4]，從內(nèi)到外依次是 β-葡聚糖（β-glucan）和甘露糖蛋白（mannoprotein），然而成熟的孢子壁是一個(gè)具有四層的層狀結(jié)構(gòu)，由內(nèi)到外依次是甘露糖蛋白、β-葡聚糖、殼聚糖 （chitosan），以及二酪氨酸（dityrosine）層[5-6]。孢子壁的組裝過(guò)程是有序一次組裝的，只有前一層組裝完成，后一層才能開(kāi)始組裝[7-8]。殼聚糖層和二酪氨酸層的主要作用是增強(qiáng)孢子對(duì)外界環(huán)境的抵抗能力[9-10]。DIT1基因參與二酪氨酸在胞質(zhì)中的合成反應(yīng)即催化L-酪氨酸形成二酪氨酸[11-12]，敲除DIT1基因會(huì)導(dǎo)致二酪氨酸層不能形成，因而dit1Δ突變株孢子壁不含二酪氨酸層且最外層為殼聚糖層[13-14]，但是殼聚糖層完整存在[15]。osw2Δ突變株孢子壁雖然具有二酪氨酸層[16-17]，但是卻具有乙醚敏感性，可能是由于OSW2基因的缺失會(huì)導(dǎo)致二酪氨酸層的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)大小發(fā)生改變[18-19]，具體作用機(jī)理目前還未知。

酵母孢子作為固定化酶的載體已經(jīng)成功被應(yīng)用，本實(shí)驗(yàn)室之前的研究已經(jīng)證明osw2Δ突變株孢子是比較優(yōu)良的固定化酶載體，而OSW2基因的具體功能以及osw2Δ突變株孢子與野生型孢子壁有哪些不同之處目前還不清楚[18]，本研究以α-半乳糖苷酶[20]作為目標(biāo)蛋白，基于孢子固定化酶催化不同分子量大小底物的活性[21]，找到osw2Δ突變株和野生型AN120孢子壁孔徑大小的不同，并研究孢子壁對(duì)不同外界條件處理后的保護(hù)性作用。此外研究表明，在不同酵母孢子壁突變體中表達(dá)分泌型綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）時(shí)，不同突變體會(huì)表現(xiàn)出不同的GFP滲漏率，其中ydr326cΔ與osw2Δ相似均具有較低的滲透率，而ydl186wΔ的滲透率稍高一些[22]。本研究選取ydl186wΔ、ydr326cΔ兩種基因缺陷型，并構(gòu)建osw2Δydl186wΔ和osw2Δ ydr326cΔ雙缺陷型菌株，研究不同突變株孢子固定化酶的催化活性。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

釀酒酵母菌株 AN120，缺陷型菌株 dit1Δ，osw2Δ，ydl186wΔ，ydr326cΔ，osw2Δydl186wΔ，osw2Δ ydr326cΔ，MEL1和 MEL1-3HA表達(dá)所用質(zhì)粒pRS426-TEFpr相關(guān)信息見(jiàn)表1，引物相關(guān)信息見(jiàn)表2。

1.2 培養(yǎng)基

酵母營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)與產(chǎn)孢培養(yǎng)基[23]

YPAD培養(yǎng)基：酵母浸出粉10 g，蛋白胨20 g，腺嘌呤30 mg，加水至900 mL，121℃高壓滅菌15 min，培養(yǎng)基冷卻至55℃，加入100 mL單獨(dú)滅菌的質(zhì)量濃度為200 g/L的葡萄糖。

缺陷培養(yǎng)基（SD）：無(wú)氨基酵母氮源（YNB）6.7 g，瓊脂粉 20 g（固體培養(yǎng)基），加水至 900 mL，

121℃高壓滅菌15 min，培養(yǎng)基冷卻至55℃，加入100 mL單獨(dú)滅菌的質(zhì)量濃度為200 g/L的葡萄糖和2 g缺少相應(yīng)氨基酸的氨基酸混合物。

預(yù)產(chǎn)孢培養(yǎng)基（YPAce）：酵母浸出粉10 g，蛋白胨20 g，醋酸鉀20 g，加水定容至1 L，121℃高壓滅菌15 min。

產(chǎn)孢培養(yǎng)基（2%KOAC）：醋酸鉀 20 g，加水定容至1 L，121℃高壓滅菌15 min。

大腸桿菌生長(zhǎng)培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：酵母浸出粉5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，加水至 1 L，121℃高壓滅菌15 min。

1.3 試劑與溶液配制

PCR產(chǎn)物純化試劑盒、瓊脂糖凝膠電泳膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒，蜜二糖以及脫脂奶粉購(gòu)于生工生物工程 （上海）有限公司；DNA連接酶、限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)于TaKaRa公司（大連）；棉籽糖購(gòu)置于J&K百靈威科技；水蘇糖購(gòu)于阿拉?。沪?葡聚糖酶、Percoll梯度離心液、Glucose assay試劑盒購(gòu)于美國(guó) Sigma-Aldrich公司 （上海）；Anti-HA Mouse mAb 一抗、Anti-βActin Mouse mAb 一抗、Goat-Anti-Mouse IgG，HRP 二抗購(gòu)于 TRANS；SDSPAGE凝膠配制試劑盒，ClarityTM Western ECL Substrate顯色劑購(gòu)置于碧云天生物技術(shù)研究所。

表1 本研究中所用的菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

DNS試劑：首先溶解6.9 g結(jié)晶酚于15.2 mL 10%NaOH溶液中。并用水稀釋至69 mL，在此溶液中加入6.9 g亞硫酸氫鈉；然后稱(chēng)取255 g酒石酸鉀鈉加到300 mL 10%NaOH溶液中，再加入800 mL 1%3，5-二硝基水楊酸溶液；將上述兩種溶液混合即可[24-25]。

1.4 主要儀器

PCR儀器購(gòu)于日本takara公司；SDS-PAGE凝膠電泳儀、凝膠成像儀購(gòu)于美國(guó)伯樂(lè)公司；紫外分光光度計(jì)購(gòu)于美國(guó)GE；冷凍干燥機(jī)購(gòu)于日本EYELA；移液槍、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)購(gòu)于德國(guó)Eppendorf；nano drop 2000 spectrophotometer購(gòu)于賽默飛；ImageQuantTMLAS 4000 mini購(gòu)于美國(guó)GE。

表2 本研究中的引物Table 2 Primers used in this study

1.5 質(zhì)粒和菌株構(gòu)建

本實(shí)驗(yàn)室已有質(zhì)粒pRS424-TEFpr-MEL1和pRS424-TEFpr-MEL1-3HA，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建pRS426-TEFpr-MEL1和pRS426-TEFpr-MEL1-3HA。構(gòu)建方法如下：用SpeⅠ和XhoⅠ雙酶切處理質(zhì)粒，并將它們連接到經(jīng)過(guò)相同酶雙酶切處理的質(zhì)粒pRS426-TEFpr上。

osw2Δydl186wΔ 和 osw2Δydr326cΔ 雙重缺陷菌株的構(gòu)建均是在osw2Δ單倍體的基礎(chǔ)上分別敲除ydl186wΔ和ydr326cΔ獲得相應(yīng)的雙重缺陷型單倍體菌株，再將對(duì)應(yīng)的單倍體菌株進(jìn)行融合獲得雙重缺陷型雙倍體菌株。雙重缺陷菌株的具體構(gòu)建方法如下：以pFA6a-TRP1位模板，分別以HXO294和HXO295，HXO298和HXO299為引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得相應(yīng)的敲除片段，然后將獲得的相應(yīng)片段通過(guò)線性DNA醋酸鋰法轉(zhuǎn)化osw2Δ4B和osw2Δ16D單倍體釀酒酵母，涂布到選擇性SD-TRP固體培養(yǎng)基進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，挑取轉(zhuǎn)化子，然后分別以HXO296和 HXO297，HXO300和 HXO301為驗(yàn)證引 物 ，PCR 驗(yàn) 證 后 獲 得 osw2Δydl186wΔ 和osw2Δydr326cΔ單倍體菌株，最后將成功敲除的相應(yīng)單倍體菌株融合為雙倍體菌株osw2Δydl186wΔ（HS9）和 osw2Δydr326cΔ（HS10）。

1.6 α-半乳糖苷酶在釀酒酵母孢子上的表達(dá)、固定和純化

將重組質(zhì)粒pRS426-TEFpr-MEL1分別轉(zhuǎn)化到釀酒酵母野生型 AN120菌株和 osw2Δ，dit1Δ，osw2Δydl186wΔ，osw2Δydr326cΔ 四 種 缺 陷 型 菌 株中，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子在SD-Ura平板上擴(kuò)培，接種適當(dāng)酵母陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子擴(kuò)培菌株于5 mL SD-Ura液體培養(yǎng)基中，30℃過(guò)夜培養(yǎng)，取1 mL過(guò)夜培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至 30 mL YPAce中，30℃搖床培養(yǎng)約24 h（至OD600=1.0），然后 6 000 r/min，離心 1 min 收集酵母細(xì)胞，并將菌體轉(zhuǎn)接至30 mL 2%乙酸鉀產(chǎn)孢培養(yǎng)基中，30℃搖床培養(yǎng)1 d，通過(guò)顯微鏡觀察測(cè)定產(chǎn)孢率，本實(shí)驗(yàn)所用孢子產(chǎn)孢率均在90%以上。為了獲得單個(gè)游離孢子，需進(jìn)行孢子的子囊破碎與純化，具體操作方法如下：8 000 r/min，1 min收集子囊孢子，并用無(wú)菌水洗2次，將收集的子囊孢子重懸于1 mL原生質(zhì)體緩沖液中（50 mmol/L pH 7.5磷酸緩沖液，1.4 mmol/L 山梨醇，40 mmol/L β-巰基乙醇），之后加入 20 μL Lyticase（1 mg β-葡聚糖酶溶于 500 μL 50% 的甘油中）。 37℃處理 1 h，8 000 r/min，1 min收集所有處理后的孢子，去除上清，沉淀用原生質(zhì)體緩沖液洗2次，重懸于原生質(zhì)體緩沖液中，充分混勻，超聲破碎獲得單個(gè)游離孢子。將獲得的單個(gè)游離孢子用Percoll密度梯度離心的方法進(jìn)行孢子純化[26]，具體方法如下：首先，孢子經(jīng)0.5%Triton-X洗滌數(shù)次，然后重懸于1 mL 0.5%Triton-X中，將其全部加至Percoll梯度離心液 （從上到下依次為50%，60%，70%，80%Percoll+10%2.5 M 蔗糖和0.5%Triton-X） 最上層，15 000 g，4℃離心 1 h，離心后，去除上面三層，純化的孢子位于最下層，加適量無(wú)菌水稀釋后，9 000 r/min離心5 min，棄上清，細(xì)胞沉淀經(jīng)0.5%Triton-X洗滌數(shù)次，離心收集細(xì)胞。將上述獲得的濕孢子溶于適量無(wú)菌水，然后進(jìn)行冷凍干燥：首先-20℃冷凍預(yù)處理約2 h，然后在-50℃，25 Pa下，置于冷凍干燥機(jī)EYELA FD-1000處理72 h。經(jīng)過(guò)處理后可獲得干燥的孢子粉末。

1.7 檢測(cè)野生型AN120菌株和osw2Δ菌株固定化酶對(duì)不同底物的催化效率

α-半乳糖苷酶（Mel1p）催化 α-1，6-半乳糖苷健的水解，本實(shí)驗(yàn)選取3種含有α-1，6-半乳糖苷健且分子大小不同的糖作為底物，蜜二糖（melibiose）、棉子糖（raffinose）、水蘇糖（stachyose），分別屬于二糖、三糖、四糖。這3種糖均能被α-半乳糖苷酶降解，蜜二糖被分解為半乳糖和葡萄糖；棉子糖被分解為半乳糖和蔗糖；水蘇糖被分解為半乳糖和蔗糖。α-半乳糖苷酶酶活測(cè)定在2 mL反應(yīng)體系中進(jìn)行，反應(yīng)體系為1 mL 0.2 mol/L HAc-NaAc緩沖液（pH 4.6），1 mL 5% 底物，10 mg孢子。 37℃下反應(yīng)2 h后，沸水浴10 min終止反應(yīng)。α-半乳糖苷酶酶活分析檢測(cè)用高效液相色譜（HPLC）進(jìn)行分析，檢測(cè)條件為：Bio-Rad Aminex HPX-87C色譜柱（250×4 mm），流動(dòng)相為超純水，流速為 0.3 mL/min，柱溫為80℃，使用5450示差檢測(cè)器。一個(gè)酶活單位U定義為：37℃下，1 mg孢子反應(yīng)10 min所產(chǎn)生的半乳糖的量（mg）。

1.8 游離酶的制備和孢子固定化酶保護(hù)性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)

游離酶制備：轉(zhuǎn)化有MEL1質(zhì)粒的野生型酵母菌首先在5 mL SD缺陷型培養(yǎng)基中30℃過(guò)夜預(yù)培養(yǎng)，然后經(jīng)30 mL SD缺陷型培養(yǎng)基放大培養(yǎng)，離心收集上清，用Amicon-Ultra超濾管（截留分子量為10 kDa）濃縮至 200 μL，每次實(shí)驗(yàn)取 10 μL。

SDS處理方法介紹如下：稱(chēng)取10 mg的干孢子粉末，10 μL濃縮蛋白，分別將它們懸浮溶解在1 mL 2%或10%SDS溶液中，然后加入1 mL 5%的底物，37℃下反應(yīng)2 h，反應(yīng)完成后沸水浴10 min終止反應(yīng)。對(duì)照組為未經(jīng)SDS處理，只將其溶解在緩沖液中。

8 mol/L Urea處理方法：收集超聲破碎純化后的單個(gè)游離孢子，將其懸浮在1 mL 8 mol/L尿素中處理1 h，對(duì)照組在緩沖液中靜止1 h，水洗3次，然后分開(kāi)進(jìn)行孢子凍干 （用于固定化酶酶活測(cè)定）或8 mol/L尿素提取孢子蛋白 （用于western blot分析蛋白表達(dá)量）。

當(dāng)以蜜二糖為底物時(shí)，檢測(cè)試劑盒為Glucose assay購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司；當(dāng)以棉子糖為底物時(shí)，檢測(cè)試劑為DNS試劑（除特殊說(shuō)明外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果均由試劑盒檢測(cè)得到）。

1.9 蛋白免疫印跡分析8 M尿素處理對(duì)孢子固定化酶的影響

將重組質(zhì)粒pRS426-TEFpr-MEL1-3HA轉(zhuǎn)化釀酒酵母AN120野生型與osw2Δ突變株，產(chǎn)孢，收集超聲破碎純化后的單個(gè)游離孢子，用8 mol/L尿素處理1 h，收集處理后的孢子，將其懸浮在8 mol/L尿素中，并加入一定量的蛋白酶抑制劑，置于冰上，玻璃珠破碎1 h使孢子完全破碎，孢子內(nèi)蛋白全部溶解于尿素中，15 000 r/min 4℃，離心30 min，收集上清，nanodrop測(cè)定蛋白濃度。上樣量為50 μg蛋白，保證總蛋白量一致，實(shí)驗(yàn)組Anti-HA為一抗，對(duì)照組Anti-Actin為一抗，二抗均為Goat-Anti-Mouse IgG，HRP。

2 結(jié)果與討論

2.1 雙缺陷型突變菌株的PCR驗(yàn)證

由于基因敲除片段會(huì)有一定的概率插入到染色體的其他位置上，這樣會(huì)導(dǎo)致選擇性培養(yǎng)基生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子有可能是假陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，為了避免這種情況的發(fā)生，要將轉(zhuǎn)化子酵母基因組提取出來(lái)進(jìn)行PCR驗(yàn)證。為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子 osw2Δydl186wΔ和osw2Δydr326cΔ，分別以 HXO296 和 HXO297，HXO300和HXO301為引物，轉(zhuǎn)化子酵母基因組作為模板，同時(shí)以osw2Δ突變株酵母基因組作為對(duì)照組模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得不同大小的產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示，osw2Δydl186wΔ目的條帶大小為 1 156 bp，對(duì)照組為 1 089 bp，osw2Δydr326cΔ 目的條帶大小為1 106 bp，對(duì)照組為4 528 bp。

圖1 PCR驗(yàn)證基因敲除Fig.1 PCR identify of gene knockout

2.2 野生型AN120與osw2Δ突變株酵母孢子壁孔徑大小對(duì)比

為了比較野生型AN120和osw2Δ突變株酵母孢子壁的結(jié)構(gòu)差異，分別選取3種分子量大小不同的糖作為底物，HPLC檢測(cè)對(duì)比兩種孢子對(duì)不同底物的催化活性，結(jié)果如圖2所示。3種不同底物的孢子固定化酶活檢測(cè)均說(shuō)明osw2Δ突變株酵母孢子固定化酶的活性要高于野生型AN120酵母孢子，但隨著底物分子量的增大，酵母孢子固定化酶的活性隨之降低，野生型AN120與osw2Δ突變株之間孢子固定化酶的活性差異也逐步增大。圖2（b）顯示，當(dāng)以棉子糖（三糖）為底物時(shí)，野生型AN120酵母孢子固定化酶有一定活性，然而，圖2（c）顯示，當(dāng)以水蘇糖（四糖）為底物時(shí)，野生型AN120酵母孢子固定化酶沒(méi)有活性，由此可以猜測(cè)，野生型AN120酵母孢子壁的結(jié)構(gòu)不能允許四糖大小的底物通過(guò)，如果把酵母孢子壁看作是具有一定孔徑的結(jié)構(gòu)，那么野生型AN120酵母孢子壁的的孔徑大小介于三糖和四糖之間。圖2（c）顯示，當(dāng)以水蘇糖（四糖）為底物時(shí)，osw2Δ突變株酵母孢子固定化酶仍然有活性，因此，osw2Δ突變株酵母孢子壁的孔徑大小應(yīng)大于四糖。

圖2 孢子固定化酶催化不同底物的活性Fig.2 Activity of encapsulated enzyme with different substrates

2.3 孢子固定化酶可抵抗一定濃度SDS的處理

為了研究野生型AN120與osw2Δ突變株酵母孢子對(duì)固定化酶的保護(hù)性作用，本實(shí)驗(yàn)分別用2%和10%SDS處理孢子固定化酶和游離酶，分別選取蜜二糖和棉子糖為底物來(lái)檢測(cè)酶的相對(duì)活性，將各自未進(jìn)行處理的酶活作為對(duì)照組，活性設(shè)為1。以蜜二糖為底物，用2%SDS分別處理游離酶和孢子固定化酶，檢測(cè)酶的相對(duì)活性，結(jié)果如圖3所示。實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，孢子固定化酶幾乎可以完全抵抗2%SDS的處理。以棉子糖為底物，用10%SDS分別處理游離酶和孢子固定化酶，檢測(cè)酶的相對(duì)活性，結(jié)果如圖4所示。實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，孢子固定化酶仍可部分抵抗10%SDS的處理。

2.4 酶活測(cè)定與蛋白免疫印跡分析尿素對(duì)孢子固定化酶的影響

尿素作為一種小分子物質(zhì)，更容易進(jìn)入孢子內(nèi)，蛋白質(zhì)中含有肽鍵，尿素中含有酰胺鍵，根據(jù)相似相容原理，尿素可以溶解蛋白質(zhì)。實(shí)驗(yàn)用8 mol/L尿素處理野生型與osw2Δ突變株孢子固定化酶，以蜜二糖為底物，通過(guò)葡萄糖測(cè)定試劑盒測(cè)定固定化酶的活性，結(jié)果如圖5所示。實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，osw2Δ突變株孢子固定化酶經(jīng)8 mol/L尿素處理后，酶活降低80%，而野生型AN120孢子固定化酶經(jīng)8 mol/L尿素處理后僅降低不足30%，因此猜測(cè)8 mol/L尿素更容易進(jìn)入osw2Δ突變株孢子中，溶解孢子固定化酶。為了驗(yàn)證這一猜測(cè)，進(jìn)行western blot蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)，直觀分析孢子固定化酶的含量，結(jié)果如圖6所示。經(jīng)過(guò)8 mol/L尿素處理后，osw2Δ突變株孢子固定化酶的含量降低很多，而野生型AN120卻變化不大，結(jié)果更進(jìn)一步說(shuō)明了8 mol/L尿素可進(jìn)入osw2Δ孢子內(nèi)部，溶解固定化酶，降低固定化酶含量，降低酶活。

圖3 2%SDS處理后游離酶和孢子固定化酶的相對(duì)活性Fig.3 Relative activity of enzyme after 2%SDS treatment

圖4 10%SDS處理后游離酶和孢子固定化酶的相對(duì)活性Fig.4 Relative activity of enzyme after 10%SDS treatment

2.5 多種突變株孢子固定化酶活性測(cè)定

為了對(duì)比多種突變菌株孢子固定化酶的活性，分別選取蜜二糖和棉子糖為底物進(jìn)行研究對(duì)比，結(jié)果如圖7所示。當(dāng)以蜜二糖為底物時(shí)，osw2Δ，ydr326cΔ，osw2Δydl186wΔ，osw2Δydr326cΔ 突變株固定化酶的活性均比較高，差異不大；而當(dāng)以棉子糖為底物時(shí)，osw2Δ，osw2Δydl186wΔ，osw2Δydr326cΔ三個(gè)突變株固定化酶的活性明顯高于其他突變株與野生型。綜合考慮，對(duì)于催化分子量較大的底物，osw2Δ，osw2Δydl186wΔ，osw2Δydr326cΔ 三個(gè)突變株固定化酶催化活性更有優(yōu)勢(shì)。說(shuō)明這些突變株均能成功固定化酶并具有活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果是由試劑盒測(cè)定并分析得到，由于測(cè)定方法的不同，所以比HPLC測(cè)定結(jié)果整體偏高，但趨勢(shì)均為一致。

圖5 8 mol/L Urea處理后孢子固定化酶的相對(duì)活性Fig.5 Relative activity of encapsulated enzyme after 8 mol/L Urea treatment

圖6 8 mol/L Urea處理后osw2Δ孢子固定酶量明顯降低Fig.6 osw2Δ spore encapsulate enzyme decrease significantly

圖5 不同突變株固定化酶的活性Fig.5 Specific activity ofdifferentmutantstrains encapsulate enzyme

3 結(jié) 語(yǔ)

本研究將α-半乳糖苷酶成功固定在多種孢子突變菌株上，并著重研究了野生型與osw2Δ突變株固定化酶在對(duì)不同底物的催化效率，對(duì)外界不良因素的抵抗能力之間的差異等多方面因素，發(fā)現(xiàn)了野生型孢子壁最大只允許處于三糖與四糖之間分子量大小的物質(zhì)通過(guò)，而對(duì)于osw2Δ突變株孢子壁可以允許四糖或者可能大于四糖的物質(zhì)通過(guò)，在接下來(lái)的工作中希望通過(guò)嘗試五糖、六糖等更大分子的糖作為底物進(jìn)行研究，找到osw2Δ突變株以及其他突變株孢子壁結(jié)構(gòu)的最大通過(guò)物質(zhì)。通過(guò)8 M尿素處理實(shí)驗(yàn)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)osw2Δ突變株孢子固定化酶的含量下降尤為明顯，目前對(duì)于OSW2基因具體影響孢子壁結(jié)構(gòu)的哪一部分還不清楚，后期將會(huì)深入研究OSW2基因的具體作用。