穴位貼敷聯(lián)合穴位注射烏體林斯對(duì)OVA哮喘模型大鼠氣道炎癥和氣道高反應(yīng)的影響?

梁志娟，耿立梅

(1. 邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056000； 2. 河北省中醫(yī)院，石家莊 050011)

社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展日新月異，但環(huán)境污染和人口老齡化日益凸顯[1-2]，哮喘的發(fā)病率也明顯升高[3-5]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，哮喘是以氣道慢性非特異性炎癥及氣道的高反應(yīng)性為本質(zhì)的一種異質(zhì)性疾病，在臨床可分為急性發(fā)作期、慢性持續(xù)期和緩解期[6]。本實(shí)驗(yàn)使用OVA誘導(dǎo)Wistar大鼠發(fā)生過(guò)敏性哮喘，該模型具有高嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)特征，在治療上采用中醫(yī)外治療法，即穴位貼敷和穴位注射，這種療法通過(guò)刺激體表穴位激發(fā)經(jīng)氣，調(diào)動(dòng)經(jīng)脈的行氣血、營(yíng)陰陽(yáng)功能，以提高機(jī)體的免疫力防病治病，在減少哮喘反復(fù)發(fā)作方面取得了良好的療效。在過(guò)敏性哮喘患者的氣道中，Th2細(xì)胞以NF-κB依賴(lài)的方式釋放IL-4、IL-5等，這些細(xì)胞因子促進(jìn)B淋巴細(xì)胞合成和分泌IgE，參與氣道炎癥反應(yīng)。另外ET-1在肺臟中含量豐富，是一種強(qiáng)支氣管收縮劑，由上皮細(xì)胞合成95%以上的ET-1輸送至黏膜下層。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立OVA致敏的慢性持續(xù)期哮喘模型，檢測(cè)其血清IgE、肺組織NF-κB及其下游細(xì)胞因子、內(nèi)皮素-1水平，探討穴位貼敷和穴位注射烏體林斯治療哮喘的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組

SPF 級(jí)雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量(120～140)g，購(gòu)于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(合格證編號(hào)1605283，許可證號(hào)SCXK(冀)2013-1-003)。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分組為正常組、哮喘組、布地奈德霧化組、貼注組、聯(lián)合組各13只。

1.2 藥物、試劑及相關(guān)儀器

貼敷藥物粉末(白芥子、細(xì)辛、甘遂、延胡索、百部、五味子、前胡、麻黃)由河北省中醫(yī)院中藥房提供，草分枝桿菌F.u.36注射液(1.72 μg/1 ml成都金星健康藥業(yè)有限公司生產(chǎn))，普米克令舒(1 mg、2 ml, Astrazeneca)，雞卵清蛋白(美國(guó)Sigma公司分裝，GradeⅡ)，自制透明霧化箱(60 cm×40 cm×30 cm)，NE502空氣壓縮式霧化器(深圳市金億帝科技有限公司)，大鼠IgE定量ELISA試劑盒(上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司)，IL-4、IL-5放射免疫分析藥盒(北京華埠利特生物技術(shù)研究所)，碘[125I]內(nèi)皮素放射免疫分析藥盒(北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司)，免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，MK3酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(芬蘭雷勃)；FJ-2021 γ-放射免疫計(jì)數(shù)器(西安二六二廠)；HMIAS-2000顯微圖像分析系統(tǒng)(武漢同濟(jì)醫(yī)科大學(xué))；DP73數(shù)碼顯微鏡(Olympus)。

2 方法

2.1 模型制備

采用腹腔注射OVA致敏后加連續(xù)霧化激發(fā)制作哮喘大鼠模型，治療期間給予間斷激發(fā)模擬慢性持續(xù)期。除正常對(duì)照組外，實(shí)驗(yàn)第1、8天每只大鼠腹腔注射新鮮配制的10%卵蛋白1 ml(內(nèi)含OVA100 mg，Al(OH)3100 mg)致敏。第16天時(shí)將造模大鼠放入不完全封閉的霧化吸入箱內(nèi)開(kāi)始激發(fā)，每次10只，用霧化器噴入含2%卵蛋白激發(fā)，每次20 min，每日1次，連續(xù)激發(fā)直至大鼠出現(xiàn)煩躁、咳嗽、呼吸加快、點(diǎn)頭呼吸、行動(dòng)遲緩、口唇紫紺甚至腹肌痙攣等癥狀，取血可檢測(cè)到EOS升高,取肺組織HE染色觀察符合炎性改變，認(rèn)為哮喘模型制造成功。

2.2 給藥

造模成功后開(kāi)始治療，貼注組選取大椎穴、雙定喘穴、雙肺俞穴、雙腎俞穴，將貼敷藥物使用鮮姜汁調(diào)和后進(jìn)行貼敷，選取雙定喘、雙肺俞穴交替使用烏體林斯穴位注射(穴位注射后不再貼敷藥物)，每周3次；布地奈德霧化組給予吸入用布地奈德霧化溶液霧化治療，每日1次(藥物用量參考徐叔云《藥理試驗(yàn)方法學(xué)》[7]中人和動(dòng)物用藥劑量換算)；聯(lián)合組采用貼敷并穴注、布地奈德霧化2種方法進(jìn)行治療,共治療1個(gè)月共計(jì)12次。大鼠取穴參照華興邦《大鼠穴位圖譜的研制》[8]，在穴位注射之前使用10%水合氯酸腹腔注射，使大鼠處于安定狀態(tài)。

2.3 標(biāo)本取材

所有動(dòng)物治療完畢后，在取標(biāo)本當(dāng)天再次給予霧化激發(fā)，觀察癥狀及體征并稱(chēng)量體質(zhì)量，10%水合氯醛按照0.3 ml/100 g進(jìn)行腹腔注射麻醉，仰面固定于解剖臺(tái)上，股動(dòng)脈剪開(kāi)放血3 ml/只，置于普通血清管中，隨后從腹壁正中線(xiàn)處剪開(kāi)表皮及肌肉層，剪斷膈肌及兩側(cè)肋骨暴露胸腔內(nèi)部器官，取右肺上葉置于凍存管中投入液氮備用檢測(cè)IL-4/5和ET-1，取右肺中葉生理鹽水漂洗去除血滯后放于10%甲醛溶液內(nèi)固定24 h，以備制作蠟塊，后期行HE染色及免疫組化染色。隨即剝離左主支氣管，插入灌胃針，用0.9%生理鹽水分2次共注射進(jìn)5 ml，行左肺肺泡灌洗，每次氣道內(nèi)注入回抽3次，回收液體量>70%合格，BALF液和血清皆置于低溫冰箱中保存。

2.4 檢測(cè)指標(biāo)

使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)BALF中總的細(xì)胞數(shù)以及中性、淋巴、嗜酸分類(lèi)比例；經(jīng)HE染色，鏡下觀察肺組織病理學(xué)改變并進(jìn)行炎細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分；ELISA檢測(cè)血清總IgE,放射免疫法測(cè)定肺組織中ET-1、IL-4、IL-5水平；免疫組化染色后鏡下觀察肺組織NF-κBp65胞核陽(yáng)性表達(dá)情況，顯微圖像分析系統(tǒng)分析IOD值。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 穴位貼敷聯(lián)合穴位注射法對(duì)BALF中細(xì)胞總數(shù)和分類(lèi)計(jì)數(shù)的影響

表1顯示，模型組BALF中的細(xì)胞總數(shù)和分類(lèi)計(jì)數(shù)(嗜酸、中性、淋巴)明顯高于正常組(P<0.05)；各治療組均低于哮喘組(P均<0.05)；聯(lián)合組低于布地奈德組和貼注組(P均<0.05)；布地奈德組低于貼注組(P<0.05)，表明穴位貼敷和穴位注射能降低氣道中炎細(xì)胞浸潤(rùn)，但作用不如霧化吸入激素治療，聯(lián)合使用的作用最佳。

表1 BALF中細(xì)胞總數(shù)和分類(lèi)計(jì)數(shù)

注：與正常組比較:aP<0.05;與哮喘組比較:bP<0.05; 與貼注組比較:cP<0.05; 與布地奈德組比較:dP<0.05

3.2 穴位貼敷聯(lián)合穴位注射對(duì)血清IgE水平的影響

表2顯示，與正常組比較，哮喘組IgE水平明顯增高，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)制作的哮喘模型具有過(guò)敏性哮喘所具有的高IgE特點(diǎn)，說(shuō)明模型制造成功。各個(gè)治療組的血清IgE水平均降低(P均<0.01)，其中聯(lián)合治療組降低明顯。

表2 肺組織HE炎細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分[9]和免疫組化NF-κB陽(yáng)性細(xì)胞

注：與正常組比較:aP<0.05;與哮喘組比較:bP<0.05; 與貼注組比較:cP<0.05; 與布地奈德組比較:dP<0.05

3.3 穴位貼敷聯(lián)合穴位注射對(duì)肺組織中IL-4、IL-5的影響

表3顯示，IL-4：哮喘組高于正常組(P<0.01),貼注組、布地奈德組、聯(lián)合組低于哮喘組(P<0.05),布地奈德組低于貼注組(P<0.05)，聯(lián)合組低于布地奈德組(P<0.05)。IL-5：哮喘組高于正常組(P<0.01)，貼注組、布地奈德組、聯(lián)合組低于哮喘組(P<0.05),布地奈德組低于貼注組(P<0.05)，聯(lián)合組低于布地奈德組(P<0.05)。

表3 肺組織中IL-4、IL-5、ET-1水平

注：與正常組比較:aP<0.05;與哮喘組比較:bP<0.05; 與貼注組比較:cP<0.05; 與布地奈德組比較:dP<0.05

3.4 肺組織ET-1水平

表3顯示，哮喘組肺組織ET-1水平高于正常組(P<0.01),貼注組、布地奈德組、聯(lián)合治療組肺組織ET-1水平均低于模型組(P均<0.01)；3個(gè)治療組之間比較，聯(lián)合組、布地奈德組較貼注組降低(P<0.01,P<0.05)，聯(lián)合組和布地奈德組兩者之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3.5 穴位貼敷聯(lián)合穴位注射對(duì)大鼠肺組織病理學(xué)改善情況

表2顯示，哮喘組肺組織病理炎細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分比正常組顯著增高(P<0.01)。3個(gè)治療組比哮喘組降低(P均<0.01)，其中聯(lián)合組改善最明顯。

圖1顯示，正常組的支氣管管腔光滑，氣道及周?chē)芙M織無(wú)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。哮喘組氣管壁纖毛紊亂并有脫落現(xiàn)象，氣道周?chē)仔约?xì)胞浸潤(rùn)，氣道和肺泡壁增厚，可見(jiàn)平滑肌收縮使氣道管管腔不規(guī)則。貼注組、布地奈德組、聯(lián)合組支氣管壁的變化、氣道平滑肌受損及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度相對(duì)較輕。

圖1 各組大鼠肺組織病理比較(HE×400)注：正常組、哮喘組、貼注組、布地奈德霧化組、聯(lián)合組

3.6 穴位貼敷聯(lián)合穴位注射對(duì)肺組織NF-κBp65陽(yáng)性細(xì)胞IOD表達(dá)及免疫組化NF-κBp65入核情況影響

表2顯示，哮喘組大鼠肺組織NF-κBp65陽(yáng)性細(xì)胞IOD值高于正常組(P<0.01)，貼注組、布地奈德組、聯(lián)合組均低于模型組(P均<0.01)；聯(lián)合組肺組織NF-κBp65陽(yáng)性細(xì)胞IOD值較貼注組、布地奈德組低(P<0.01)，布地奈德組低于貼注組(P<0.01)。

圖2顯示，細(xì)胞核染成黃色、棕黃色、棕色的細(xì)胞為NF-κBp65陽(yáng)性細(xì)胞，表明NF-κB從胞漿進(jìn)入胞核活化，可見(jiàn)正常組氣道上皮細(xì)胞有個(gè)別胞核陽(yáng)性細(xì)胞，哮喘組胞核陽(yáng)性細(xì)胞明顯可見(jiàn)，各治療組胞核陽(yáng)性細(xì)胞減少，治療組中聯(lián)合組胞核陽(yáng)性細(xì)胞最少。

圖2 NF-κB在氣道中的表達(dá)比較(免疫組化×400)注：正常組、哮喘組、貼注組、布地奈德霧化組、聯(lián)合組

4 討論

哮喘的慢性氣道炎癥是其基本特征之一，其中Th1/Th2失衡已被認(rèn)為是哮喘發(fā)生的重要機(jī)制。在此過(guò)程中，Th2細(xì)胞通過(guò)分泌多種細(xì)胞因子參與致病，這些細(xì)胞因子進(jìn)一步促進(jìn)B淋巴細(xì)胞合成和分泌IgE，并與多種炎性細(xì)胞上的受體結(jié)合，參與炎癥反應(yīng)，因此IgE升高是過(guò)敏性哮喘氣道炎癥的核心。而且多項(xiàng)研究提示，抗IgE治療藥物奧馬珠單抗在改善患者癥狀、減少急發(fā)事件和激素用量上取得很好成績(jī)[10-11]。另外，過(guò)敏性哮喘是發(fā)生在氣道的嗜酸性細(xì)胞聚集的典型過(guò)敏性疾病，EOS增多主要通過(guò)IL-5依賴(lài)和非IL-5依賴(lài)兩種機(jī)制，其中IL-4是非IL-5依賴(lài)機(jī)制中重要的炎癥因子之一。有研究顯示，阻斷IL-5后能夠使外周血和痰液中EOS浸潤(rùn)減少[12-13]。在上述氣道的IgE增多和EOS浸潤(rùn)導(dǎo)致過(guò)敏性哮喘發(fā)生機(jī)制的上游，是Th2細(xì)胞依賴(lài)NF-κB釋放細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)。哮喘患者NF-κB核定位、IκB(κB抑制蛋白)的磷酸化及IKK-β(κB激酶)在氣道中的表達(dá)量均增高[14]。正常情況下，NF-κB與其抑制蛋白以無(wú)活性的形式存在于細(xì)胞漿中，遇刺激后進(jìn)入細(xì)胞核活化，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。NF-κB調(diào)控Thl/Th2細(xì)胞因子相關(guān)基因表達(dá)的結(jié)果是使炎癥因子產(chǎn)生級(jí)聯(lián)放大，對(duì)機(jī)體免疫或炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)及維持發(fā)揮重要作用。氣道高反應(yīng)性是哮喘的另一個(gè)典型特征，肺是ET-1含量最豐富的器官，由上皮細(xì)胞合成的ET-1，95%以上輸送至黏膜下層。有研究提示，ET-1的特異性結(jié)合位點(diǎn)在氣道平滑肌最致密，ET-1也是強(qiáng)支氣管收縮劑，吸入ET-1后支氣管收縮效能大約是乙酰膽堿的100倍，所以ET-1是一種較強(qiáng)的支氣管平滑肌收縮劑[15]。

本研究表明，OVA誘導(dǎo)哮喘大鼠模型血清IgE、肺組織NF-κB及其下游細(xì)胞因子IL-4、IL-5、肺組織ET-1水平較正常組顯著增高，病理圖片及評(píng)分顯示炎癥改變明顯。經(jīng)過(guò)干預(yù)后，治療組的各項(xiàng)指標(biāo)較模型組均有降低，3治療組之間比較聯(lián)合治療組治療效果最明顯，貼注組和布地奈德霧化組兩者比較，布地奈德治療組效果明顯。但聯(lián)合組和布地奈德組兩者之間比較，ET-1水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，造成這種原因不排除存在穴位貼敷操作技術(shù)上的原因?？傊?jīng)過(guò)穴位貼敷和注射烏體林斯能夠改善氣道炎癥，其作用機(jī)制可能為抑制肺組織中NF-κB從胞漿進(jìn)入胞核后的活化，從而降低其下游細(xì)胞因子IL-4、IL-5水平，進(jìn)而阻斷這些下游細(xì)胞因子，促進(jìn)B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IgE引起的炎癥反應(yīng)；另外，穴位貼敷聯(lián)合穴位注射烏體林斯能夠降低氣道高反應(yīng)性，其作用機(jī)制可能與抑制氣道上皮細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)量的ET-1有關(guān)。