新活絡(luò)效靈丹對(duì)ApoE基因敲除早期動(dòng)脈粥樣硬化小鼠Cav-1、SR-BI的影響?

耿 濤，房玉濤，張 云，劉桂芳

(中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京 100053)

膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)(reverse cholesterol transport，RCT)是血脂代謝的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其能力的強(qiáng)弱決定著動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程與轉(zhuǎn)歸。B族I型清道夫受體(B scavenger receptor family of type I，SR-BI)、小凹蛋白-1(Caveolin-1，Cav-1)作為重要的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體在RCT起始步驟中起重要作用[1-2]。

本研究通過ApoE基因敲除小鼠AS模型，觀察新活絡(luò)效靈丹對(duì)ApoE基因敲除小鼠早期AS的斑塊面積和斑塊/管腔面積比值(PA/ALA)的影響，并采用PCR技術(shù)，檢測主動(dòng)脈內(nèi)Cav-1 mRNA、SR-BI mRNA 的表達(dá)水平，從而探討其抗AS早期斑塊的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法[3-4]

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6～8周齡ApoE基因敲除雄性小鼠(C57BL/6 J)45只，體質(zhì)量(17～21) g，給予高脂飼料喂養(yǎng)；6～8周齡清潔級(jí)C57BL/6 J雄性小鼠10只，體質(zhì)量(17～21) g，普通飼料喂養(yǎng)。飼養(yǎng)條件為2級(jí)，光照時(shí)間7∶00～19∶00，相對(duì)濕度40%～60%，室溫20～24 ℃，均購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(許可證號(hào)SCXK(京)2011-0012)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及制備

新活絡(luò)效靈丹組成(顆粒劑型)：丹參30 g，制乳香12 g，制沒藥12 g，三七4 g，由四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司生產(chǎn)，中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院藥劑科制備。阿托伐他汀鈣片(立普妥)為大連輝瑞制藥有限公司提供，20 mg/片(批號(hào)031711k)。

1.3 主要儀器和試劑

光學(xué)顯微鏡(BX-41型，日本OLYMPUS公司)；切片機(jī)(日本SAKURA，型號(hào)CRM-440)；7900HT型熒光定量PCR儀(購自美國應(yīng)用生物公司)；Trizol試劑(批號(hào)14105，購自Invitrogen公司)；Fermentas K1622 RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)00044977,購自MBI公司)；SYBR Green PCR Master Mix試劑盒(批號(hào)1108401,購自美國應(yīng)用生物公司)；引物由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。

引物序列：SR-B1,上游引物5’- ACCTTCAATGACAACGACACC-3’，下游引物5’-VVAVAGGATCTCACCAACTGT-3’，擴(kuò)增物長度234 bp；Cav-1，上游引物5’- TCTACAAGCCCAACAACAAGG-3’，下游引物5’-GACAACAAGCGGTAAAACCAA-3’，擴(kuò)增物長度241 bp。圖像分析軟件Image-Pro Plus Version 5.0 (Ipp5.0)。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物分組及造模 適應(yīng)性喂養(yǎng)4 d，然后采用隨機(jī)數(shù)字表法將45只ApoE基因敲除小鼠分為模型組、西藥組、中藥組各15只，3組均喂以高脂飼料(78.85%基礎(chǔ)飼料+0.15%膽固醇+21%脂肪混合而成)13周。另設(shè)C57BL/6 J小鼠 10只為空白對(duì)照組，給予普通飼料喂養(yǎng)。

1.4.2 各組小鼠給藥方法 根據(jù)成人臨床推薦的常用劑量，按成人與小鼠的體質(zhì)量折算系數(shù)10折算成小鼠用量，造模同時(shí)即給予藥物干預(yù)，中藥組飼以新活絡(luò)效靈丹顆粒劑9.67 g/(kg·d)灌胃，西藥組飼以阿托伐他汀鈣片3.33 mg/(kg·d)。中藥組和西藥組藥物均以蒸餾水溶解后按體質(zhì)量比灌胃，模型組按體質(zhì)量比以生理鹽水灌胃，連續(xù)給藥13周，空白對(duì)照組小鼠則不予以處理。

1.5 觀察指標(biāo)與方法

取材前夜禁食水。處死全部小鼠，無菌條件下取出主動(dòng)脈根部。(1)部分組織常規(guī)石蠟包埋切片，自主動(dòng)脈根部連心肌部分橫斷面進(jìn)行連續(xù)切片(厚度5um)[5]。對(duì)切片進(jìn)行HE染色，倒置顯微鏡下觀察主動(dòng)脈橫切面組織學(xué)改變、AS病變程度，×15倍鏡下應(yīng)用IPP5.0圖像分析軟件測量各組ApoE基因敲除小鼠內(nèi)彈力膜圍繞面積(internal elastic laminal area IELA，μm2)、動(dòng)脈管腔面積(artery lumen area，ALA, μm2)，計(jì)算斑塊面積、斑塊/管腔面積比值[6]。公式如下[2]：斑塊面積(plaque aera，PA，μm2)=IELA-ALA，斑塊/管腔面積比=PA/ALA。(2) 部分組織置于凍存管內(nèi)液氮驟冷保存。采用RT-PCR 法檢測小鼠主動(dòng)脈中SR-BImRNA、Cav-1mRNA表達(dá)，具體步驟參照試劑盒說明進(jìn)行操作。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠主動(dòng)脈組織HE染色結(jié)果

圖1顯示，空白對(duì)照組(A):主動(dòng)脈內(nèi)膜光滑連續(xù)，內(nèi)皮細(xì)胞排列均勻，表面光滑，未見泡沫細(xì)胞及炎性細(xì)胞；模型組(B)：主動(dòng)脈內(nèi)形成明顯的AS斑塊，并可出現(xiàn)脂質(zhì)核心，膽固醇和膽固醇酯沉積，泡沫細(xì)胞增多，大量的巨噬細(xì)胞浸潤；西藥組(C)：管壁可見AS斑塊，斑塊面積明顯小于模型組；中藥組組(D)：斑塊面積顯著減少，部分內(nèi)膜較為光滑。

圖1 各組小鼠主動(dòng)脈根部組織病理比較(HE染色×15)注：圖1B.模型組小鼠主動(dòng)脈根部組織病理圖，箭頭所指為AS斑塊，且出現(xiàn)明顯脂質(zhì)核心，周圍大量巨噬細(xì)胞的浸潤；圖1 C為西藥組小鼠主動(dòng)脈根部組織病理圖中箭頭所指同樣為 AS斑塊，但斑塊面積明顯小于模型組

2.2 各組小鼠主動(dòng)脈斑塊面積、斑塊/管腔面積比值(PA/ALA)結(jié)果及主動(dòng)脈Cav-1 mRNA、SR-BI mRNA表達(dá)比較

表1顯示，IPP5.0圖像分析軟件測量計(jì)算各組ApoE基因敲除小鼠主動(dòng)脈切片的斑塊面積及PA/ALA后，結(jié)果顯示空白組主動(dòng)脈內(nèi)膜光滑連續(xù)，未見斑塊。模型組斑塊面積明顯增大，與模型組比較，西藥組斑塊面積顯著縮小(P<0.01), PA/ALA顯著降低(P<0.01)；中藥組與模型組比較，斑塊面積、PA/ALA均有顯著改變(P<0.01)；西藥組與中藥組比較，斑塊面積、PA/ALA差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。模型組小鼠主動(dòng)脈組織中SR-BI mRNA、Cav-1 mRNA表達(dá)水平低于空白組(P<0.05)；西藥組小鼠主動(dòng)脈組織中SR-BI mRNA、Cav-1 mRNA表達(dá)水平高于模型組 (P<0.05)；中藥組小鼠主動(dòng)脈組織中SR-BI mRNA、Cav-1 mRNA表達(dá)水平明顯高于模型組(P<0.01)；中藥組SR-BI mRNA表達(dá)水平高于西藥組，西藥組Cav-1 mRNA表達(dá)水平高于中藥組，但2組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 新活絡(luò)效靈丹對(duì)各組小鼠斑塊面積、斑塊/管腔面積比值(PA/ALA)的影響及各組小鼠主動(dòng)脈組織中Cav-1 mRNA、SR-BI mRNA表達(dá)比較

注：與空白對(duì)照組比較：*P<0.05；與模型組比較:△P<0.05，△△P<0.01

3 討論

AS是心腦血管疾病的主要致病基礎(chǔ)，具有進(jìn)展性和全身性的特點(diǎn),也是一個(gè)穩(wěn)定期與不穩(wěn)定期交替的過程[7]。防治AS的關(guān)鍵在于能否進(jìn)行早期干預(yù)，延緩斑塊形成和穩(wěn)定斑塊。到目前為止，他汀是AS藥物治療的基石,但其肝功能受損、肌毒性、糖尿病風(fēng)險(xiǎn)增加、老年人記憶力減低等問題無法回避[8-12]。近年來，膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)逐漸成為抗動(dòng)脈粥樣硬化的研究熱點(diǎn)，其初始過程是以通過Cav-1、SR-BI等多種蛋白參與，使細(xì)胞內(nèi)膽固醇外流，從而有利于機(jī)體排出多余的膽固醇[13]。因此，藥物干預(yù)RCT對(duì)于AS的治療具有重要意義。

小凹(Caveolae) 是細(xì)胞膜上存在的一種特異性凹陷結(jié)構(gòu)，直徑50～100 nm，是細(xì)胞內(nèi)膽固醇的主要流出部位，在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)膽固醇以及維持細(xì)胞內(nèi)膽固醇的動(dòng)態(tài)平衡方面有重要影響[14]。小凹蛋白(Caveolin)是構(gòu)成小凹的標(biāo)志性核心蛋白，Cav-1是小凹蛋白中分布最為廣泛、高親和力的脂質(zhì)結(jié)合蛋白，是形成細(xì)胞膜Caveolae結(jié)構(gòu)的主要分子基礎(chǔ)[15]。其通過激活蛋白激酶信號(hào)通路促進(jìn)血管新生，改善局部缺血情況[16-17]。最新研究證實(shí)，Cav-1對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化具有抑制作用，不僅體現(xiàn)在對(duì)平滑肌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移的抑制、巨噬細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)、凋亡細(xì)胞的清除之外，還與降低炎癥反應(yīng)、穩(wěn)定斑塊緊密相關(guān)[18]。脂質(zhì)能增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，而炎癥又促進(jìn)脂質(zhì)沉積，二者相互影響加速AS的發(fā)生和發(fā)展。Cav-1能調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中信號(hào)傳導(dǎo)通路，進(jìn)而影響炎癥反應(yīng)過程[19-20]。既往研究表明，小凹及小凹蛋白1是膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)和炎癥應(yīng)答的共同分子平臺(tái)，在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)膽固醇的動(dòng)態(tài)平衡方面起重要作用[21-22]。

B型I類SR(SR-BI)屬于CD超家族，是一種CD36相關(guān)蛋白。1996年Acton等首次證實(shí)，SR-BI為可選擇性介導(dǎo)膽固醇吸收的高密度脂蛋白(high density lipoproteins，HDL)受體[23]，能介導(dǎo)膽固醇和膽固醇酯自HDL顆粒的轉(zhuǎn)運(yùn)，并與HDL一起對(duì)于動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病的發(fā)生起保護(hù)作用[24-25]。通過SR-BI基因敲除大鼠的實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了SR-BI在膽固醇的選擇性吸收、運(yùn)輸及控制血漿膽固醇水平中的決定性作用[26]。

活血化瘀中藥防治AS的臨床療效已得到確認(rèn)[27]，但不同種類的活血化瘀藥在抗AS中作用靶點(diǎn)有何不同，在各個(gè)階段中有何各自特點(diǎn)和優(yōu)勢，尚缺乏深入研究。故挖掘簡便效廉、機(jī)理明確、早期干預(yù)作用突出的抗AS活血化瘀方劑，有著非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。

活絡(luò)效靈丹(制乳香、制沒藥、當(dāng)歸、丹參)出自張錫純所著《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》。近年，此方對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化與心腦血管疾病的治療作用日益受到關(guān)注[28]。樹脂類活血化瘀中藥乳香、沒藥均能宣通氣血、透達(dá)臟腑經(jīng)絡(luò)，現(xiàn)代研究表明，乳香具有抗氧化、抗炎、降脂等藥理活性，其抗炎作用與對(duì)炎癥細(xì)胞因子的調(diào)控和對(duì)蛋白激酶通路的影響有關(guān)[29-30]。沒藥其活性成分能降低炎癥介質(zhì)過氧化物酶的活性[31]，具有強(qiáng)效抑制急慢性炎癥的作用。新方以三七易當(dāng)歸活血益氣，制約乳香、沒藥久服耗氣之弊，從而達(dá)到養(yǎng)血不留瘀、祛瘀不傷正的目的?，F(xiàn)代研究表明，三七有效組分三七總皂苷在提高心肌對(duì)缺氧環(huán)境耐受力的同時(shí)，還具有擴(kuò)張血管、改善血供、增強(qiáng)免疫[32]的作用。丹參具有活血祛瘀、養(yǎng)血安神之功，現(xiàn)代研究表明，丹參可抗血小板聚集、降低血液黏稠度、改善微循環(huán)、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、持續(xù)降低心肌耗氧、防止心肌缺血和心梗的發(fā)生，其有效組分丹參酮可降低炎癥細(xì)胞活性，抑制炎癥因子和趨化因子表達(dá)，抗氧自由基損害，降低缺血組織的再灌注損傷[33]。4藥配伍具有活血化瘀、益氣通絡(luò)之功，臨床治療動(dòng)脈粥樣硬化療效顯著，但具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步闡明。

本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，中藥組和阿托伐他汀鈣組動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積明顯縮小，2組均具有延緩動(dòng)脈粥樣硬化早期斑塊形成的作用。中藥組動(dòng)脈粥樣硬化小鼠主動(dòng)脈組織Cav-1 mRNA、SR-BI mRNA表達(dá)提示明顯升高，與模型組比較差異明顯，提示新活絡(luò)效靈丹具有提高動(dòng)脈粥樣硬化小鼠主動(dòng)脈組織Cav-1 mRNA、SR-BI m RNA的表達(dá)作用，從而提高細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出的能力，推測為防治AS早期斑塊形成的機(jī)制之一。