響應(yīng)面法優(yōu)化長裂苦苣菜 總生物堿提取工藝

潘方方,李秀梅,張海英,馬文建,*,楊培龍,*

(1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院,天津 300457; 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所,北京 100081)

長裂苦苣菜(SonchusbrachyotusDC.)系菊科苦苣菜屬一年生草本植物,又名苦曲菜、苦菜、苦苣菜、苦荬菜、苣荬菜等,它的特征是根垂直直伸,生多數(shù)須根。莖直立,有縱條紋,基部直徑達(dá)1.2 mm,上部有傘房狀花序分枝,分枝長或短或極短,全部莖枝光滑無毛,其主要分布在黑龍江、吉林、內(nèi)蒙古、河北、山西、陜西和山東等地,資源豐富,是一種價(jià)廉易得、藥食兩用的植物[1]?？嘬牟藢僦参锏幕瘜W(xué)成分主要為萜類化合物(如倍半萜和三類)、黃酮類及黃酮苷。同時(shí)該屬植物中還存在香豆素、木脂素、揮發(fā)油、糖類、生物堿、有機(jī)酸類、氨基酸類及微量元素等[2]。藥理研究表明,長裂苦苣菜具有抗腫瘤、抗菌、抗炎、抗心率失常、降壓和降膽固醇、保肝、清除自由基等作用[3-7]。生物堿廣泛存在于植物、動(dòng)物、微生物等生物有機(jī)體內(nèi),其數(shù)量多、結(jié)構(gòu)類型復(fù)雜多樣,是最重要的天然產(chǎn)物之一[8]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,天然植物中生物堿具有抗腫瘤、抗菌抗病毒、抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗纖維化等作用[9-11]。因此研究長裂苦苣菜中總生物堿具有重要意義。

近幾年關(guān)于使用超聲波法的報(bào)道比較多,許多人采用此法研究了不同原料中生物堿的提取,如曼陀羅種子、桑葉、鐵莧菜等,這些研究極大地推動(dòng)了生物堿提取工藝的發(fā)展[12]。但采用超聲波法提取長裂苦苣菜中的生物堿的研究目前還少見報(bào)道。因此,本試驗(yàn)以長裂苦苣菜全草為材料,采用超聲波法提取生物堿,通過單因素和響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝條件,以期優(yōu)選出長裂苦苣菜總生物堿的適宜提取工藝,為開發(fā)和利用生物堿資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

烏頭堿對(duì)照品 中國藥品生物制品檢定所;長裂苦苣菜 采自山東濱州,經(jīng)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所李秀梅助理研究員鑒定為SonchusbrachyotusDC.的全草;氫氧化鈉、無水硫酸鈉、鄰苯二甲酸氫鉀 西隴化工股份有限公司;溴麝香草酚藍(lán)指示液 北京索萊寶科技有限公司;甲基紅 上海金穗生物科技有限公司;氯仿和無水乙醇 北京化工廠;氨水和鹽酸 北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司;以上試劑 均為分析純。

SY-1000恒溫超聲提取機(jī) 北京弘祥隆生物技術(shù)股份有限公司;UV-3200紫外分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;ME-204電子天平 梅特勒-托利多儀器上海有限公司;FE-28 pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器上海有限公司;YF114微型植物粉碎機(jī) 中國江陰市新友機(jī)械制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱取12.0 mg烏頭堿標(biāo)品置于試管中,加入1 mol/L鹽酸溶液5 mL,溶解,加等量的1 mol/L氫氧化鈉溶液,移至50 mL容量瓶中,用蒸餾水定容至刻度,搖勻,即可得濃度為0.24 mg/mL的烏頭堿標(biāo)品溶液。

準(zhǔn)確量取烏頭堿標(biāo)品溶液0、0.35、0.40、0.50、0.80、1.00 mL,分別置于分液漏斗中,各加蒸餾水3.00、2.65、2.60、2.50、2.20、2.00 mL,加溴麝香草酚藍(lán)指示液2.0 mL,鄰苯二甲酸氫鉀-氫氧化鈉(pH=6)緩沖液5.0 mL,氯仿10 mL,旋渦振蕩3 min,室溫靜置1 h,分取氯仿液,并加入0.5 g無水硫酸鈉,靜置30 min,以只有蒸餾水的一份為空白,在410 nm處測其吸光值,以質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo),吸光值(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[13],標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.3119x-0.0526,R2=0.9997。

1.2.2 原料預(yù)處理方法 長裂苦苣菜清洗后于40 ℃烘箱烘至恒重,然后用微型植物粉碎機(jī)將長裂苦苣菜粉碎,過60目的分析篩于密封袋中保存,備用。

1.2.3 長裂苦苣菜總生物堿的提取 稱取一定質(zhì)量的長裂苦苣菜粗粉置于250 mL的錐形瓶中,以一定的料液比加入一定濃度的乙醇,在一定溫度和功率下,調(diào)至合適的pH,進(jìn)行一定時(shí)間的超聲提取,靜置10 min,將上層提取液倒入離心管中,5000 r/min 離心10 min,將離心后的提取液置于250 mL的錐形瓶中,使用相對(duì)應(yīng)的乙醇濃度定容,備用。

取0.1 mL的提取液置于1 mL比色管中,用一定濃度的乙醇定容至刻度,以相對(duì)應(yīng)的乙醇濃度為空白,并在410 nm處測定提取液吸光值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測長裂苦苣菜中總生物堿的提取率,提取率(%)=(樣品中總生物堿的重量/藥材重量)×100。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 料液比對(duì)長裂苦苣菜中總生物堿提取率的影響 采取1.2.3中方法提取長裂苦苣菜總生物堿,提取條件:在超聲功率 500 W,超聲溫度50 ℃,超聲時(shí)間30 min,pH為5和乙醇濃度為75%下,考察料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL)對(duì)總生物堿提取率的影響,進(jìn)而確定最佳的料液比。

1.2.4.2 超聲時(shí)間對(duì)長裂苦苣菜中總生物堿提取率的影響 采取1.2.3中方法提取長裂苦苣菜總生物堿,提取條件:在料液比為1∶30 g/mL,超聲功率500 W,超聲溫度50 ℃,pH為5和乙醇濃度為75%下,考察超聲時(shí)間(15、20、25、30、35 min)對(duì)總生物堿提取率的影響,進(jìn)而確定最佳的超聲時(shí)間。

1.2.4.3 超聲溫度對(duì)長裂苦苣菜中總生物堿提取率的影響 采取1.2.3中方法提取長裂苦苣菜總生物堿,提取條件:在料液比為1∶30 g/mL,超聲時(shí)間為30 min,超聲功率500 W,pH為5和乙醇濃度為75%下,考察超聲溫度(40、45、50、55、60 ℃)對(duì)總生物堿提取率的影響,進(jìn)而確定最佳的超聲溫度。

1.2.4.4 超聲功率對(duì)長裂苦苣菜中總生物堿提取率的影響 采取1.2.3中方法提取長裂苦苣菜總生物堿,提取條件:在料液比為1∶30 g/mL,超聲時(shí)間為30 min,超聲溫度為55 ℃,pH為5和乙醇濃度為75%下,考察超聲功率(400、500、600、700、800 W)對(duì)總生物堿提取率的影響,進(jìn)而確定最佳的超聲功率。

1.2.4.5 pH對(duì)長裂苦苣菜中總生物堿提取率的影響 采取1.2.3中方法提取長裂苦苣菜總生物堿,提取條件:在料液比為1∶30 g/mL,超聲時(shí)間為30 min,超聲溫度為55 ℃,超聲功率為700 W和乙醇濃度為75%下,考察 pH(3、4、5、6、7)對(duì)總生物堿提取率的影響,進(jìn)而確定最佳的pH。

1.2.4.6 乙醇濃度對(duì)長裂苦苣菜中總生物堿提取率的影響 采取1.2.3中方法提取長裂苦苣菜總生物堿,提取條件:在料液比為1∶30 g/mL,超聲時(shí)間為30 min,超聲溫度為55 ℃,超聲功率為700 W和pH為5下,考察乙醇濃度(55%、60%、65%、70%、75%、80%)對(duì)總生物堿提取率的影響,進(jìn)而確定最佳的乙醇濃度。

1.2.5 Box-Benhken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,利用響應(yīng)面法對(duì)長裂苦苣菜中總生物堿的提取條件進(jìn)行優(yōu)化。根據(jù)Box-Benhken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[14],選取對(duì)長裂苦苣菜中總生物堿提取率有顯著影響的單因素液料比(A)、超聲溫度(B)、pH(C)和乙醇濃度(D)作為自變量設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn),考察提取總生物堿的最佳提取條件,因素水平見表1[15]。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)表Table 1 Factors and their coded levels tested in response surface

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對(duì)總生物堿提取率的影響 由圖1可知,隨著溶劑量的不斷增加,總生物堿的提取率呈現(xiàn)先逐漸增大后降低的趨勢(shì),提取率增加是因?yàn)槿軇┡c浸提物接觸充分,使溶出率增加,當(dāng)料液比達(dá)到1∶30 g/mL時(shí),總生物堿的提取率達(dá)到最大(20.44%),但隨著溶劑量繼續(xù)增加,提取率反而呈下降趨勢(shì),這可能是當(dāng)溶劑太多時(shí),溶劑大量吸收超聲波輻射而使其不能完全作用于長裂苦苣菜，從而影響總生物堿的提取率,故選擇料液比為1∶30 g/mL。

圖1 料液比對(duì)總生物堿提取率的影響Fig.1 Effect of the ration of solid to liquid on the extraction ratio of total alkaloids

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)總生物堿提取的影響 由圖2可知,超聲時(shí)間小于30 min時(shí),總生物堿提取率隨著超聲時(shí)間的增加,逐漸提高,但增加幅度不大。超聲時(shí)間為30 min時(shí),提取率達(dá)到最大值(19.85%),當(dāng)時(shí)間超出30 min后,總生物堿提取率反而降低?？赡苁且?yàn)槌晻r(shí)間過長,部分不太穩(wěn)定的生物堿發(fā)生了降解[16]。故提取過程中使用30 min即可。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)總生物堿提取率的影響Fig.2 Effect of the ration of ultrasonic time on the extraction ratio of total alkaloids

2.1.3 超聲溫度對(duì)總生物堿提取的影響 由圖3可知,當(dāng)超聲溫度在40～55 ℃時(shí),總生物堿提取率隨著溫度的升高而增加;超過55 ℃時(shí),總生物堿提取率反而有所降低。這是因?yàn)闇囟冗^高,使生物堿的溶出量減少;也可能由于過高的溫度使生物堿結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,同時(shí)雜質(zhì)的浸出量也增加,從而影響了提取效果[16-17],故選擇 55 ℃為較適宜的超聲溫度。

圖3 超聲溫度對(duì)總生物堿提取率的影響Fig.3 Effect of the ration of ultrasonic temperature on the extraction ratio of total alkaloids

2.1.4 超聲功率對(duì)總生物堿提取的影響 由圖4可知,當(dāng)超聲功率小于700 W時(shí),隨著超聲功率的增加,總生物堿的提取率也隨之增加,當(dāng)超聲功率達(dá)到700 W時(shí),總生物堿提取率達(dá)到最大值(20.34%),然而超過700 W后,總生物堿的提取率有所下降。這是因?yàn)閷?duì)于一定頻率和一定發(fā)生面的超聲波來說,功率增大,聲強(qiáng)隨著增大,這就導(dǎo)致單位時(shí)間內(nèi)超聲產(chǎn)生的空化效應(yīng)增強(qiáng),從而有利于提高總生物堿的提取率。但是太高的聲強(qiáng)會(huì)產(chǎn)生大量空化泡,通過反射聲波可能減少能量的傳遞,并且空化泡與聲強(qiáng)的增加呈非線性關(guān)系,這樣可能會(huì)破壞生物堿的結(jié)構(gòu),從而影響總生物堿的提取率。故提取過程中使用700 W即可。

圖4 超聲功率對(duì)總生物堿提取率的影響Fig.4 Effect of the ration of ultrasonic power on the extraction ratio of total alkaloids

2.1.5 pH對(duì)總生物堿提取的影響 由圖5可知,隨著pH的增加,總生物堿提取率呈上升趨勢(shì),當(dāng) pH為5時(shí),總生物堿提取率達(dá)到最大(20.21%),隨著pH的繼續(xù)增加,總生物堿提取率反而呈下降趨勢(shì),故選取5為適宜的pH。

圖5 pH對(duì)總生物堿提取率的影響Fig.5 Effect of the ration of pH on the extraction ratio of total alkaloids

2.1.6 乙醇濃度對(duì)總生物堿提取的影響 由圖6可知,在乙醇濃度為75% 時(shí),總生物堿提取率最高(19.76%),隨著乙醇濃度的繼續(xù)增大,總生物堿提取率反而有所降低。其原因是隨著乙醇的濃度增大,溶解在有機(jī)溶劑中的生物堿量會(huì)隨之增多,但當(dāng)乙醇濃度超過一定值時(shí),長裂苦苣菜中的其他物質(zhì)也會(huì)被提取出來,這反而會(huì)降低總生物堿的提取率。因此選取總生物堿提取的乙醇濃度為75%。

圖6 乙醇濃度對(duì)總生物堿提取率的影響Fig.6 Effect of the ration of volume percentage of ethanol on the extraction ratio of total alkaloids

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,由Design-Expert 8.05b統(tǒng)計(jì)分析軟件設(shè)計(jì)出的實(shí)驗(yàn)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示,建立四因素三水平中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，共包括29個(gè)實(shí)驗(yàn)方案,其中24個(gè)析因試驗(yàn)點(diǎn),5個(gè)中心試驗(yàn)點(diǎn),用以計(jì)算實(shí)驗(yàn)誤差。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

2.2.2 回歸方程擬合及方差分析 采用Design-Expert 8.05b統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析,回歸分析結(jié)果如表3所示,對(duì)各因素?cái)M合后,得到回歸方程:Y=20.18-0.53A-0.068B+0.14C+0.47D-0.023AB-0.21AC-0.20AD-5.000×10-3BC-7.500×10-3BD-0.11CD-1.58A2-0.30B2-0.37C2-1.12D2

由表3可知,二項(xiàng)式擬合模型方程失擬項(xiàng)不顯著(p>0.05),回歸模型達(dá)到極顯著水平(p<0.01),說明該模型與實(shí)測值擬合較好,回歸模型R2=0.9902>0.9,表明該模型相關(guān)度好,可利用該模型分析最佳提取工藝條件。結(jié)果表明,液料比(A)、pH(C)、乙醇濃度(D)、液料比二次項(xiàng)(A2)、超聲溫度二次項(xiàng)(B2)、pH二次項(xiàng)(C2)、乙醇濃度二次項(xiàng)(D2)對(duì)響應(yīng)值影響極顯著(p<0.01),液料比與pH交互項(xiàng)(AC)、液料比與乙醇濃度交互項(xiàng)(AD)對(duì)響應(yīng)值影響顯著(p<0.05),各因素對(duì)響應(yīng)值的影響順序?yàn)锳>D>C>B。

表3 回歸統(tǒng)計(jì)分析表Table 3 Variance analysis for each term of the fitted regression equation

2.2.3 響應(yīng)面及等高線分析結(jié)果 為了考察交互項(xiàng)對(duì)總生物堿提取率的影響,在兩個(gè)因素固定不變的情況下,對(duì)模型進(jìn)行降維分析,經(jīng)Design-Expert 8.0.5b軟件處理得到響應(yīng)面及等高線見圖7,圖7a表明液料比和超聲溫度的交互作用對(duì)長裂苦苣菜生物堿提取率的影響不大。液料比過大導(dǎo)致了長裂苦苣菜生物堿的提取率下降,主要是由于長裂苦苣菜生物堿類化合物的相對(duì)極性影響的,料液比過大不能將一些極性較大的生物堿類物質(zhì)溶解出來,另外溫度過高,可能會(huì)使生物堿類化合物降解。圖7b表明液料比與pH的交互作用對(duì)長裂苦苣菜生物堿提取率的影響顯著。圖7c表明液料比與乙醇濃度的交互作用對(duì)長裂苦苣菜生物堿提取率的影響顯著。乙醇濃度在一定范圍內(nèi)可以使生物堿類化合物快速溶解,以便提高生物堿提取率。圖7d表明超聲溫度與pH的交互作用對(duì)長裂苦苣菜生物堿提取率的影響不大。長裂苦苣菜生物堿提取率會(huì)隨著超聲溫度和pH的增加而增加,當(dāng)達(dá)到一定值時(shí),長裂苦苣菜生物堿提取率就會(huì)下降或者變化不大。圖7e表明超聲溫度與乙醇濃度的交互作用對(duì)長裂苦苣菜生物堿提取率的影響不大。長裂苦苣菜生物堿提取率會(huì)隨著超聲溫度與乙醇濃度的增加而提高,當(dāng)達(dá)到一定值時(shí),提取效果不太明顯。圖7f表明pH與乙醇濃度的交互作用對(duì)長裂苦苣菜生物堿提取率的影響不大。長裂苦苣菜生物堿提取率會(huì)隨著乙醇濃度和pH的增加而增加,當(dāng)達(dá)到一定值時(shí),長裂苦苣菜生物堿提取率就會(huì)下降或者變化不大。

圖7 各兩因素交互作用對(duì)總生物堿提取率影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.7 Three-dimensional response surface and contour plots showing interactive effects of hydrolysis conditions on total alkaloids

根據(jù)所得模型經(jīng)響應(yīng)面回歸分析,得出最佳提取條件為:料液比1∶28.06 g/mL,超聲溫度54.43 ℃,pH5.21,乙醇濃度76.08%,在此條件下總生物堿提取率可達(dá)到20.30%。根據(jù)實(shí)際條件,調(diào)整的優(yōu)化條件為:料液比1∶30 g/mL,超聲時(shí)間30 min,超聲溫度55 ℃,超聲功率700 W,pH為5,乙醇濃度75%。

2.2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 取3等份長裂苦苣菜粗粉進(jìn)行平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中3組實(shí)驗(yàn)的總生物堿提取率分別為19.93%,19.84%,20.32%,此3組實(shí)驗(yàn)的總生物堿提取率的平均值為20.03%,與預(yù)測值相比,可得出相對(duì)誤差為1.35%。結(jié)果表明,經(jīng)過響應(yīng)回歸方程擬合出的理論值與實(shí)際值相吻合,證明用響應(yīng)面法可以有效地優(yōu)化長裂苦苣菜提取總生物堿的工藝。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)影響長裂苦苣菜總生物堿提取的六個(gè)單因素:料液比、超聲時(shí)間、超聲溫度、超聲功率、pH、乙醇濃度進(jìn)行了考察,利用Box-Behnken設(shè)計(jì)篩選出的四個(gè)主要影響因子:料液比、超聲溫度、pH、乙醇濃度。然后通過響應(yīng)面分析法對(duì)各因素的最佳水平范圍及其交互作用進(jìn)行了研究和探討,確定出最佳長裂苦苣菜提取總生物堿的條件為料液比1∶30 g/mL,超聲時(shí)間30 min,超聲溫度55 ℃,超聲功率700 W,pH為5,乙醇濃度75%,此條件下總生物堿提取率可達(dá)到20.30%。本實(shí)驗(yàn)采用Box-Behnken響應(yīng)面法首次對(duì)長裂苦苣菜中總生物堿的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化,為其進(jìn)一步開發(fā)提供了科學(xué)、合理的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。