黑米色素提取工藝優(yōu)化及其穩(wěn)定性

張素敏,李俊偉,李俊瑞,王麗莎,朱俊玲,3,*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院,山西太谷 030801; 2.太谷縣鑫炳記食業(yè)有限公司,山西太谷 030801; 3.山西功能食品研究院,山西太谷 030801)

黑米種植歷史悠久,是中國古老而名貴的藥食兼用的特殊稻種。黑米營養(yǎng)豐富,主要含有蛋白質(zhì)、碳水化合物兩類營養(yǎng)物質(zhì),富含鈣、磷、鉀、鎂、鐵、鋅等礦物元素以及B族維生素、維生素E[1]。此外,黑米具有特殊的藥用價值,能夠改善缺鐵性貧血、降血壓、活血名目、健脾暖胃,享有“藥米”、“世界米中之王”的美譽。食用天然色素按照來源可以分為植物源的天然色素,動物源的天然色素、微生物源的天然色素3類[2]。目前,我國研究和應用最多的是以植物資源為原料,應用提取、分離、濃縮等技術而獲得的多功能天然植物色素。與合成色素相比,天然色素具有色調(diào)自然,易于吸收,對人體的安全性高的優(yōu)點[3]。

黑米中含有豐富的色素,屬于天然的花青素類色素,具有抗氧化和消除自由基的功效,有一定的藥用及保健價值[4]。目前國內(nèi)外對黑米的研究,主要是將其作為原料生產(chǎn)成產(chǎn)品,比如一些復合飲料、復合乳、餅干等[5-6],對黑米中活性物質(zhì)的提取也有些研究,例如王磊等[7]利用超聲波輔助醇提法提取了黑米中的黃酮,并對工藝進行了優(yōu)化。于長順等[8]用酸化水基萃取劑提取黑米色素,并用大孔樹脂對其進行精制。鄧文輝等[9]對黑米色素抗疲勞的生化機理研究做了展望，但是大部分提取都是以正交試驗進行優(yōu)化,且對色素的穩(wěn)定性研究較少。

本實驗以黑米為原料,除了利用響應面法優(yōu)化黑米色素的提取工藝,還對色素的穩(wěn)定性做了相應的研究,旨在為黑米色素在食品工業(yè)中的綜合應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑米(購于京東商城) 產(chǎn)自遼寧朝陽;無水乙醇、檸檬酸、過氧化氫 均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

XL-16B粉碎機 廣州旭朗機械設備有限公司;FA2204C分析天平 上海精密科學儀器有限公司;HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;LD5-2A高速離心機 北京雷勃爾醫(yī)療器械有限公司;2100型可見分光光度計 尤尼科儀器有限公司;ST3100型pH計 奧豪斯儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黑米色素提取工藝 去除黑米中的雜質(zhì),用粉碎機將黑米磨成粉,過60目篩。稱取適量黑米粉置于錐形瓶中,按照一定的料液比加入一定體積分數(shù)的乙醇,用0.1 mol/L的檸檬酸調(diào)懸浮液pH至3,在一定溫度下恒溫浸提一定時間后,取上清液于4000 r/min離心20 min,取上清定容至100 mL,即得黑米色素提取液,并在510 nm處測定提取液的吸光值。由于提取液的吸光值與黑米色素的提取率正相關,故本研究根據(jù)吸光值的大小來判斷黑米色素提取率的相關高低[11-12]。

1.2.2 單因素試驗

1.2.2.1 料液比對黑米色素提取的影響 分別稱取2 g黑米粉放在150 mL的錐形瓶中,以40%乙醇作為提取劑,料液比分別為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 g/mL,用0.1 mol/L的檸檬酸調(diào)pH至3,在40 ℃恒溫水浴條件下,浸提60 min。其它操作同1.2.1,確定合適的料液比。

1.2.2.2 乙醇體積分數(shù)對黑米色素提取液的吸光度的影響 分別稱取2 g黑米粉放在150 mL錐形瓶中,料液比為1∶30 g/mL,乙醇體積分數(shù)為30%、40%、50%、60%、70%,用0.1 mol/L的檸檬酸調(diào)pH至3,,在40 ℃恒溫水浴條件下,浸提60 min。其它操作同1.2.1,確定合適的乙醇體積分數(shù)。

1.2.2.3 浸提溫度對黑米色素提取液的吸光度的影響 分別稱取2 g黑米粉放在150 mL錐形瓶中,料液比為1∶30 g/mL,乙醇體積分數(shù)為40%,用0.1 mol/L的檸檬酸調(diào)pH至3,分別在60、70、80、90、100 ℃恒溫水浴條件下,浸提60 min。其它操作同1.2.1,確定合適的浸提溫度。

1.2.2.4 浸提時間對黑米色素提取液的吸光度的影響 分別稱取2 g黑米粉放在150 mL錐形瓶中,料液比為1∶30 g/mL,乙醇體積分數(shù)為40%,用0.1 mol/L的檸檬酸調(diào)pH至3,以玻璃塞封口,40 ℃恒溫水浴,浸提時間分別為60、90、120、150、180 min,其它操作同1.2.1,確定合適的浸提時間。

1.2.3 響應面法優(yōu)化提取工藝 根據(jù)單因素試驗結果利用 Design Expert 8.0.6軟件中的 Box-Behnken設計原理,以浸提液的吸光度為響應值,設計響應面實驗4因素3水平,見表1。

表1 響應面實驗因素水平Table 1 Factors and levels of RSM analysis

1.2.4 不同條件對黑米色素穩(wěn)定性的影響

1.2.4.1 溫度對黑米色素穩(wěn)定性的影響 各取10 mL黑米色素提取液于5支具塞比色管中,編號,將5支具塞比色管分別置于60、70、80、90、100 ℃恒溫水浴30 min,然后取出,降溫至室溫,在510 nm處測定其吸光值。

1.2.4.2 pH對黑米色素穩(wěn)定性的影響 各取10 mL黑米色素浸提液,用0.1 moL/L的檸檬酸分別將其pH調(diào)至2、3、4、5、6,然后分別將其裝入已經(jīng)編號的5支具塞比色管中,在510 nm處測定吸光值。

1.2.4.3 光照對黑米色素穩(wěn)定性的影響 各取10 mL黑米色素浸提液于5支具塞比色管中,編號,將5支具塞比色管分別于自然光下光照2、4、6、8、10 h后,在510 nm處測定吸光值。

1.2.4.4 氧化劑對黑米色素穩(wěn)定性的影響 各取10 mL黑米色素浸提液于5支具塞比色管中,編號,分別在5支具塞比色管中加入2 mL蒸餾水、分別加入質(zhì)量分數(shù)為0%、5%、10%、15%、20%的過氧化氫,放置30 min后,在510 nm處測定吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本實驗采用GraphPad Prism數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)作圖并進行統(tǒng)計學分析,所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 料液比對黑米色素提取液吸光值的影響 由圖1可以看出,當料液比小于1∶30 g/mL時，黑米色素浸提液的吸光值隨料液比的增加而增大,當料液比達到1∶30 g/mL時,提取液的吸光值最高,之后隨著料液比的增大,提取液的吸光值逐漸減小。當料液比較低時,黑米色素吸光值低,不利于工業(yè)上提取黑米色素,當料液比過高時，不僅不利于工業(yè)上黑米色素的提取,而且造成了浸提溶劑、黑米原料、能源等的巨大浪費,帶來經(jīng)濟上的損失,而且給后續(xù)黑米色素的濃縮純化帶來困難,不利于黑米色素的生產(chǎn)利用。因此,較適宜的料液比為1∶30 g/mL。

圖1 料液比對黑米色素吸光值的影響Fig.1 Material to solvent effect on extraction absorbance of black rice pigment

2.1.2 乙醇體積分數(shù)對黑米色素提取液吸光值的影響 由圖2可以看出,隨著乙醇體積分數(shù)的增大,浸提液的吸光值逐漸增大,在乙醇體積分數(shù)為40%時,浸提液的吸光值達到最大值,之后隨著乙醇體積分數(shù)繼續(xù)增大,浸提液的吸光值卻降低?？赡苁怯捎谶^高的乙醇體積分數(shù)破壞了色素,導致浸提液吸光值下降。因此,較適宜的的乙醇體積分數(shù)為40%。

圖2 乙醇體積分數(shù)對黑米色素吸光值的影響Fig.2 Effect of volume fraction on the extraction absorbance of black rice pigment

2.1.3 浸提溫度對黑米色素提取液吸光值的影響 由圖3可以看出,從60～70 ℃浸提液的吸光值略有降低,從70 ℃開始浸提液的吸光值逐漸增加,在90 ℃時達到最大值,此后,隨著溫度的升高,黑米色素浸提液的吸光值驟然下降。這是因為黑米色素耐熱性較差,過高的溫度破壞了黑米色素的結構,導致浸提液的吸光值降低,而且過高的溫度造成了能源的浪費,因此,適宜的浸提溫度為90 ℃。

圖3 浸提溫度對黑米色素吸光值的影響Fig.3 Effect of temperature on the extraction absorbance of pigment from black rice

2.1.4 浸提時間對黑米色素提取液吸光值的影響 由圖4可以看出,隨著浸提時間的延長,浸提液的吸光值增大,當浸提時間為90 min時,浸提液吸光值達到最大值,之后,隨著浸提時間的延長,浸提液的吸光值減小,有可能是因為浸提溫度較高,長時間的浸提破壞了黑米色素的結構,使浸提液的吸光值降低。因此,適宜的提取時間為90 min。

圖4 浸提時間對黑米色素吸光值的影響Fig.4 Effect time on the extraction absorbance of pigment from black rice

2.2 響應面法分析

2.2.1 響應面試驗設計與結果 在單因素實驗基礎上,選擇料液比、乙醇體積分數(shù)、浸提溫度、浸提時間為影響因素,浸提液的吸光值為響應值(Y),利用Design Expert 8.0.6軟件中的 Box-Behnken設計響應面試驗。試驗結果見表2。

表2 Box-Behnken試驗設計與結果Table 2 Design and results of Box-Behnken

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

利用Design Expert 8.0.6軟件,對表2 Box-Behnken分析方案及結果中的數(shù)據(jù)進行擬合,以黑米色素浸提液的吸光值Y為響應值,以料液比X1、乙醇體積分數(shù)X2、浸提溫度X3、浸提時間X4為自變量,得到浸提液吸光值Y對編碼自變量的二次多項式回歸方程如下:

2.2.2 各因素交互作用 利用Design Expert 8.0.6 軟件繪制該模型的等高線圖及響應面圖,如圖5～圖10所示,響應面及等高線圖是該模型所建立的二次多項回歸方程的圖形表達方式,這些等高線圖和響應面圖可以更加直觀地反映出不同變量之間的交互作用及每個自變量的不同因素水平與響應值之間的關系[13-14]。由圖5可以看出,在自變量料液比和乙醇體積分數(shù)的變化區(qū)間內(nèi),該等高線的形狀近似橢圓,表明料液比和乙醇體積分數(shù)的交互作用明顯(p<0.01)。由圖6可以看出,在自變量料液比和浸提溫度的變化范圍內(nèi),浸提液吸光值有極大值點,響應面的最高點同時也是等高線中最小橢圓的中心點。該等高線的形狀近似橢圓,表明料液比和浸提溫度的交互作用明顯(p<0.01)。由圖7可以看出，響應面的最高點同時也是等高線中最小橢圓的中心點。該等高線的形狀近似橢圓,表明料液比和浸提時間的交互作用明顯(p<0.01)。由圖8可以看出,響應面的最高點同時也是等高線中最小橢圓的中心點。該等高線的形狀近似橢圓,表明乙醇體積分數(shù)和浸提溫度的交互作用明顯(p<0.01)。由圖9可以看出,響應面的最高點同時也是等高線中最小橢圓的中心點。該等高線的形狀近似橢圓,表明乙醇體積分數(shù)和浸提時間的交互作用明顯(p<0.01)。當由圖10可以看出,響應面的最高點同時也是等高線中最小橢圓的中心點。該等高線的形狀近似圓形,表明浸提溫度浸提和時間的交互作用不顯著。

圖5 料液比與乙醇體積分數(shù)交互作用 對黑米色素吸光值的影響Fig.5 Effects of the interaction of liquid ratio and ethanol volume fraction on the extraction absorbance of black rice pigment

圖6 料液比與浸提溫度交互作用 對黑米色素吸光值的影響Fig.6 Effects of the interaction of liquid ratio and extraction temperature on the extraction absorbance of black rice pigment

圖7 料液比于浸提時間交互作用 對黑米色素吸光值的影響Fig.7 Effects of the interaction of liquid and liquid on the extraction absorbance of black rice pigment

圖8 乙醇體積分數(shù)與浸提溫度交互作用 對黑米色素吸光值的影響Fig.8 Effects of the interaction of ethanol volume fraction and extraction temperature on the extraction absorbance of black rice pigment

圖9 乙醇體積分數(shù)與浸提時間交互作用 對黑米色素吸光值的影響Fig.9 Effects of the interaction of ethanol volume fraction and extraction time on the extraction absorbance of black rice pigment

圖10 浸提溫度與浸提時間的 交互作用對黑米色素吸光值的影響Fig.10 Effects of the interaction between the extraction temperature and the extraction time on the extraction absorbance of black rice pigment

2.2.3 黑米色素提取工藝最優(yōu)條件的得出與驗證性實驗 利用Design Expert 8.0.6軟件分析得到的浸提液吸光值Y對編碼自變量的二次多項式回歸方程，求得黑米色素浸提工藝的最佳工藝條件為:料液比1∶30.47 g/mL、乙醇體積分數(shù)43.58%、浸提溫度90.44 ℃、浸提時間104.37 min,此時黑米色素浸提液吸光值的理論值為1.044。結合實驗室實際操作中能夠達到的條件,將最佳工藝條件修改為:料液比1∶30.5 g/mL、乙醇體積分數(shù)44%、浸提溫度90 ℃、浸提時間104 min。

利用修正后的最佳工藝條件浸提黑米色素,以驗證該模型預測實際實驗的準確性,重復實驗3次,黑米色素浸提液吸光值為(1.040±0.0086),利用統(tǒng)計學t檢驗分析得出,模型理論值與實驗實際值差異不顯著,表明該模型能夠很好的預測實驗實際值。

2.3 不同條件對黑米色素穩(wěn)定性的影響

2.3.1 溫度對黑米色素穩(wěn)定性的影響 根據(jù)圖11,隨著溫度的升高,黑米色素有所升高,但是升高的幅度不大,吸光值的變化范圍較小。因此,可知黑米色素在90 ℃以下的溫度范圍內(nèi)較穩(wěn)定,超過90 ℃黑米色素浸提液的吸光值降低,表明高溫對黑米色素有破壞作用。

圖11 溫度對黑米色素穩(wěn)定性的影響Fig.11 Effect of temperature on the stability of black rice pigment

2.3.2 pH對黑米色素穩(wěn)定性的影響 根據(jù)圖12,隨著pH的增大,黑米色素溶液吸光值逐漸減小,部分黑米色素分解為其他物質(zhì),不過吸光值變化很小。可知黑米色素在pH為2～6的酸性環(huán)境中較穩(wěn)定,因此黑米色素適宜用作酸性食品的著色劑。

圖12 pH對黑米色素穩(wěn)定性的影響Fig.12 Effect of pH on the stability of black rice pigment

2.3.3 光照時間對黑米色素穩(wěn)定性的影響 根據(jù)圖13,光照時間對黑米色素的吸光值影響不大,變化不明顯,因此,黑米色素在儲存過程中不需要避光保存,黑米色素的這一特性為黑米色素的提取、儲存、運輸帶來極大的方便。

圖13 光照時間對黑米色素穩(wěn)定性的影響Fig.13 Effect of light on the stability of black rice pigment

2.3.4 氧化劑濃度對黑米色素穩(wěn)定性的影響 根據(jù)圖14,可知黑米色素浸提液的吸光值隨著所加入的過氧化氫,的乙醇體積分數(shù)的增大而減小,說明氧化劑過氧化氫對黑米色素具有破壞作用。因此,黑米色素不能應用于含有氧化性成分的食品中,在儲存運輸?shù)倪^程中也要盡量避免與氧化劑接觸。

圖14 氧化劑濃度對黑米色素穩(wěn)定性的影響Fig.14 Effect of antioxidants on the stability of black rice pigment

4 結論

根據(jù)Box-Behnken組合實驗設計原理及響應面法可知,各因素對黑米色素吸光值的影響各不同,最佳提取工藝為:料液比1∶30.5 g/mL、乙醇體積分數(shù)44%、溫度90 ℃、時間104 min。這時黑米色素的吸光值為(1.040±0.0086)。并進一步進行了驗證實驗,表明該模型能夠很好的預測實際實驗值,模型準確可靠。黑米色素在90 ℃以下的溫度范圍內(nèi)較穩(wěn)定,在酸性環(huán)境中穩(wěn)定,對光照穩(wěn)定,但是黑米色素穩(wěn)定性受氧化劑影響較大,隨著所添加過氧化氫濃度的增加,浸提液吸光值在減小,即黑米色素對氧化劑過氧化氫不穩(wěn)定。因此黑色色素在具體應用中應在低溫、酸性條件下進行,可以不避光保存,但在儲運過程中要避免其與氧化劑接觸，這為黑米色素的提取及應用提供了理論參考。

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