殼聚糖固定化海藻糖合酶

黃 珍,王 慧,黃 芳,李 欣,王 志,代 俊,陳 雄

(湖北工業(yè)大學生物工程學院，發(fā)酵工程教育部重點實驗室， 工業(yè)發(fā)酵湖北省協同創(chuàng)新中心,湖北武漢 430068)

海藻糖(Trehalose)是由兩個葡萄糖分子通過α,α-1,1糖苷鍵縮合形成的一種非還原性的雙糖,化學名為D-吡喃葡萄糖基-α-D-吡喃葡萄糖苷(α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopy ranoside)。最早從麥角菌(Clavicepspurpurea)中分離得到,之后陸續(xù)在低等植物、藻類、細菌、真菌、酵母菌、昆蟲及無脊椎動物中被發(fā)現[1]。海藻糖不僅是一種重要的有機碳源,更是一種生物體對抗冷、熱、氧化等脅迫條件的重要保護劑;還能阻止高滲、高鹽條件下物質的相變,保持細胞膜雙分子層結構,減少膜的通透性和維持蛋白正常折疊形式;當存在某種逆境脅迫時,酵母細胞能富集海藻糖對抗脅迫環(huán)境,最高可達干重的15%以上[2]?；诤Ｔ逄堑纳鲜鎏匦?其常被作為穩(wěn)定劑或食品添加劑應用于食品、藥品及化妝品等工業(yè)領域[3]。

傳統(tǒng)的海藻糖生產方法主要為酵母抽提法,其成本高,過程復雜,分離難度大,限制了海藻糖的應用;雖然酶轉化法是目前研究和開發(fā)的重點,但游離酶只能一次性使用、可操作性低、儲存中穩(wěn)定性不高、對熱和有機試劑敏感等缺點制約其在工業(yè)化方面的應用[4]。固定化酶具有增加酶穩(wěn)定性、能重復使用、容易分離等優(yōu)點,日益受到人們的重視[5]。

本研究中,用作固定化的海藻糖合酶來源于一種耐熱嗜酸古菌(Picrophilustorridus),該菌在溫度60 ℃、pH0.7的環(huán)境中依然能存活[6],其海藻糖合酶具有耐熱性、耐酸性強的特點[7]。殼聚糖又名脫乙酰殼多糖,化學名稱為聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-B-D葡萄糖,由于來源廣泛、生物相容性好、成本低廉等優(yōu)點[8],選作本研究固定化酶的載體。本文利用基因工程菌生產海藻糖合酶,純化后以殼聚糖為載體制備成固定化酶,研究固定化條件并比較固定化前后酶學特性,旨為工業(yè)化酶法生產海藻糖提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

pET-28a(+)-TreS BL21(含有pET-28a(+)-TreS質粒的EscherichiacoliBL21工程菌株) 由本實驗室構建并保存;Bradford蛋白質定量試劑盒 天根生化科技(北京)有限公司;蛋白分子量標準 賽默飛世爾科技公司;超濾管(30 kDa,50 mL) Millipore公司;海藻糖、麥芽糖標準品 色譜級，Biosharp公司;殼聚糖 國藥集團化學試劑有限公司;Ni-IDA-Sefinose Column BBI Life Sciences公司;其余試劑均為國產分析純。

WFJ2000型可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司;UltiMate 3000型高效液相色譜儀 Thermo scientific公司;YXQ-LS-100SⅡ型高壓蒸汽滅菌鍋 上海博訊實業(yè)有限公司;5810R型高速冷凍離心機 eppendorf公司;JY92-Ⅱ型超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技有限公司;DELTA 320型pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司,等。

1.2 實驗方法

1.2.1 海藻糖合酶(TreS)的制備 將37 ℃活化后的pET-28a(+)-TreS BL21菌株按1%接種量分別接種于5瓶含50 μg/mL卡那霉素的200 mL LB培養(yǎng)液中,37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600=0.6,分別添加終濃度為0.1 mmol/L的IPTG,置于20 ℃、200 r/min誘導12 h。離心收集誘導表達后的pET-28a(+)-TreS BL21菌體,水洗三次,每克濕菌體添加10 mL Ni-Native-0緩沖液(50 mmol/L NaH2PO4,300 mmol/L NaCl,pH8.0)懸浮,冰浴下250 W超聲破碎10 min,12000 r/min離心20 min取上清,即為粗酶液。粗酶液的純化依據Ni-IDA-Sefinose Column說明書進行,分別按順序用含20、50、100、250和500 mmol/L咪唑的洗脫緩沖液對蛋白進行梯度洗脫,然后用SDS-PAGE檢測梯度洗脫液中的純化蛋白有無情況。接著將層析柱純化的酶洗脫液再用超濾管進行脫鹽濃縮,使用20 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH6.0)作為置換緩沖液。酶濃度使用Bradford蛋白質定量試劑盒測定。

1.2.2 TreS固定化條件研究 依據岳振峰固定化酶的方法[9],先稱取1 g殼聚糖,分別按4.0、5.6、7.2、8.0、12.0、16.0、20.0、24.0、32.0、40.0、48.0 mg/g給酶量(海藻糖合酶與殼聚糖的質量比)加入純化酶,再用50 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH6.0)定容到20 mL,15 ℃吸附過夜,靜置,離心,棄去上清液,用50 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH6.0)洗至洗液無蛋白質檢出為止,研究不同給酶量對固定化酶酶活的影響。在上述最優(yōu)給酶量條件下,進一步研究不同吸附時間(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 h)對固定化酶相對酶活的影響。在最適給酶量和最適吸附時間條件下,測定固定化海藻糖合酶的酶活回收率。相對酶活(%)是在考察最適催化條件時,將某一條件下測定的酶活最高值記為100%,其他條件下測定的酶活與最高酶活的比值[10]。酶活回收率的計算公式為:酶活回收率(%)=固定化酶的總酶活/固定化中加入的游離酶的總酶活×100[11]。

1.2.3 游離酶和固定化酶的酶學特性研究

1.2.3.1 最適酶反應溫度 在反應pH為6.0的條件下,將游離酶和固定化酶分別置于不同溫度(4、20、30、40、45、50、60、70、80 ℃)反應,研究溫度分別對游離酶和固定化酶相對酶活的影響,確定最適酶反應溫度。

1.2.3.2 最適酶反應pH 在最適反應溫度下,將游離酶和固定化酶分別置于不同pH(3.5、4.5、5.5、6.0、6.5、7.5、8.5)反應,研究pH分別對游離酶和固定化酶相對酶活的影響,確定最適酶反應pH。

1.2.3.3 反應進程曲線 按照1.2.5中酶活的測定方法,在20 mL體系中測定游離酶和固定化酶的反應進程,分別繪制海藻糖、麥芽糖和葡萄糖的反應進程曲線[4],根據海藻糖的最大生成量數值,計算游離酶和固定化酶的最大海藻糖得率[12],海藻糖得率的計算公式為:海藻糖得率(%)=反應中產物海藻糖的濃度/反應前底物麥芽糖的濃度×100。

1.2.4 固定化酶的穩(wěn)定性研究

1.2.4.1 重復使用性 評價固定化酶穩(wěn)定性的兩個主要指標是酶活殘留率和重復使用次數[13]。用1.2.2的最優(yōu)固定化酶條件,將制備的固定化酶進行9次重復分批催化試驗,每次反應后用緩沖液洗滌3次,再進行反應,測定酶活力,計算每次重復使用后的酶活殘留率。酶活殘留率的計算公式為:酶活殘留率(%)=處理后殘留的酶活/處理前酶活×100[10]。

1.2.4.2 熱穩(wěn)定性 將游離酶和固定化酶在不同溫度(4、20、30、40、45、50、60、70、80 ℃)放置20 min,再分別測定兩者的相對活性[7],比較兩者的熱穩(wěn)定性。

1.2.4.3 酸堿穩(wěn)定性 將游離酶和固定化酶在不同pH(3.5、4.5、5.5、6.0、6.5、7.5、8.5)放置20 min,再分別測定兩者的相對活性[7],比較兩者的酸堿穩(wěn)定性。

1.2.5 酶活的測定

1.2.5.1 游離酶 將16 μg純化酶加入100 μL麥芽糖含量為150 mmol/L的磷酸鈉緩沖液(pH6.0)中,45 ℃反應25 min,沸水浴15 min結束反應。酶活力定義為:在上述條件下,每分鐘催化產生1 μmol海藻糖所需的酶量(mg)為一個酶活力單位(U/mg)。

1.2.5.2 固定化酶 在1 g殼聚糖固定化酶中加入20 mL含150 mmol/L麥芽糖的磷酸鈉緩沖液(pH6.0),40 ℃攪拌反應25 min,沸水浴15 min結束反應。酶活力定義為:在上述條件下,每分鐘催化產生1 μmol海藻糖所需的固定化酶量(g)為一個酶活力單位(U/g)[4]。

1.2.5.3 色譜分析方法 酶催化反應液經12000 r/min離心5 mim后,取上清液用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法(HPLC-ELSD)分析麥芽糖、海藻糖與葡萄糖含量。色譜條件為:氨基柱(Agilent,ZORBAX NH2,4.6 mm×250 mm,5 μm),柱溫30 ℃,檢測器Alltech 2000ES蒸發(fā)光散射檢測器,漂移管溫度90 ℃,流動相為乙腈∶水(19∶6),流速1 mL/min。

1.3 數據處理

每個樣品設3個平行,利用Origin 8.0軟件進行數據分析,測定結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 海藻糖合酶的純化

用Ni-IDA親和層析柱純化重組蛋白,不同濃度咪唑洗脫液對蛋白的洗脫情況如圖1。由圖中泳道1和2對比可知,粗酶液經過層析柱后,重組蛋白被層析柱吸附,由泳道3、4、5、6和7對比可知,泳道4、5和6在預期結果處含有蛋白條帶,即在50、100和250 mmol/L咪唑洗脫液中成功純化出重組蛋白。

圖1 SDS-PAGE分析純化結果Fig.1 SDS-PAGE analysis of the purification results注:M為蛋白分子量標準;泳道1為超聲破碎后的粗酶液; 泳道2為過層析柱后的粗酶液;泳道3、4、5、6、7分別為 20、50、100、250和500 mmol/L咪唑的洗脫液。

2.2 海藻糖合酶固定化條件的研究

2.2.1 固定化海藻糖合酶的給酶量 由圖2可知,給酶量在4.0～32.0 mg/g時,酶活性迅速增加,這可能由于殼聚糖吸附的酶量隨給酶量增加而增多;當給酶量大于32.0 mg/g時,酶活性變化不大,這時殼聚糖吸附的酶量基本達到飽和狀態(tài),再增加給酶量,酶已不能被吸附。因此,選擇最佳固定化給酶量為32.0 mg/g。

圖2 給酶量對酶活的影響Fig.2 Effect of different enzyme loading on the activity

2.2.2 固定化海藻糖合酶的吸附時間 從圖3中可看出,吸附時間在0.5～2.5 h時,酶活逐漸增加,這可能因為殼聚糖吸附的酶量隨時間增加而增多,而吸附3.0 h之后,由于后期酶變性速度大于吸附速度,使得固定化酶活性逐漸下降。因此,選擇2.5 h為最適固定化吸附時間。采用研究后的固定化條件:給酶量為32.0 mg/g,吸附時間為2.5 h,測定固定化海藻糖合酶的酶活回收率為40.17%。

圖3 吸附時間對相對酶活的影響Fig.3 Effect of different adsorption time on the relative activity

2.3 固定化酶酶學特性和穩(wěn)定性研究

2.3.1 固定化酶最適反應溫度和熱穩(wěn)定性 研究中分別測定了溫度對游離酶和固定化酶相對酶活的影響,發(fā)現固定化酶的最適反應溫度為40 ℃,游離酶最適反應溫度為45 ℃,該酶固定化后最佳反應溫度下降(見圖4)。經過測定不同溫度的熱穩(wěn)定性,發(fā)現固定化酶的溫度穩(wěn)定性與游離酶相比差距不大,其在4～60 ℃范圍內放置20 min后,相對酶活均高于87%(見圖5)。

圖4 溫度對游離酶和固定化酶相對活性的影響Fig.4 Effects of temperature on the relative activity of the free and immobilized enzyme

圖5 溫度對游離酶和固定化酶穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effects of temperature on the stability of the free and immobilized enzyme

2.3.2 固定化酶最適反應pH和酸堿穩(wěn)定性 分別測定pH對游離酶和固定化酶相對酶活的影響,如圖6所示,該酶經固定化后,最適反應pH仍為6.0,但pH適用范圍變寬,在pH3.5～8.5間,相對酶活均高于50%,而游離酶在pH3.5和pH8.5下則完全失活。

圖6 pH對游離酶和固定化酶相對活性的影響Fig.6 Effects of pH on the relative activity of the free and immobilized enzyme

固定化酶在pH3.5～8.5范圍內放置20 min后,相對酶活均高于60%,尤其在pH3.5中放置20 min后,固定化酶相對酶活還有62.36%,而游離酶完全喪失活性。由以上研究可知,該酶經固定化后,酸堿穩(wěn)定性增強,且酸穩(wěn)定性明顯高于游離酶,如圖7所示。

圖7 pH對游離酶和固定化酶穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effects of pH on the stability of the free and immobilized enzyme

2.3.3 重復使用性 游離酶由于不易從反應體系中分離出來,因此不具有可重復操作的特性[14],而固定化酶則具有可重復使用的優(yōu)勢[15]。為了驗證本次固定化酶的重復使用穩(wěn)定性,進行了9次重復使用酶活試驗。從圖8可知,酶活性的下降主要發(fā)生在第一次反應和第二次反應之間,降低了19.48%,這可能是由于載體殼聚糖的穩(wěn)定性較差[16],此后多次重復使用對酶活影響不大,經9批次重復使用之后,酶活殘留率為64.64%。因此該固定化海藻糖合酶具有一定的重復使用穩(wěn)定性,可重復使用,能降低工業(yè)化的使用成本。

圖8 固定化海藻糖合酶的重復使用性Fig.8 Reusability of the immobilized TreS

2.3.4 反應進程曲線 圖9描述了固定化酶和游離酶的反應進程,從中可以看出,固定化酶與麥芽糖在反應2 h時,海藻糖的生成量最高,最大得率為61.4%;隨著反應時間的增加,海藻糖的含量有所下降,這可能由于反應的持續(xù)進行,海藻糖發(fā)生了部分水解造成。而游離酶的酶促反應較固定化酶平緩,在反應4 h時,海藻糖的生成量達最高,最大得率為60%。經比較可知,固定化酶的轉化率與游離酶相當,但反應速率比游離酶快。

圖9 固定化酶和游離酶催化麥芽糖反應的進程曲線Fig.9 Reaction progress curves of maltose catalyzed by the free and immobilized enzyme

3 結論

本實驗利用大腸桿菌工程菌表達海藻糖合酶,純化后,利用殼聚糖為載體直接吸附制備成固定化酶,探索出最適給酶量為32.0 mg/g,最適吸附時間為2.5 h。利用該固定化方法,固定化酶最適反應溫度為40 ℃,最適反應pH為6.0,酶活回收率為40.17%,重復使用9次之后,酶活殘留率為64.64%。與游離海藻糖合酶相比,固定化酶在4～60 ℃范圍內放置20 min后,相對酶活均高于87%,溫度穩(wěn)定性兩者沒有顯著變化;但固定化酶在pH3.5～8.5范圍內放置20 min后,相對酶活均高于60%,酸堿穩(wěn)定性優(yōu)于游離酶。反應進程試驗表明,固定化酶在反應2 h時,有最大海藻糖得率為61.4%,反應速率較游離酶快。綜上所述,固定化的海藻糖合酶不僅酸堿穩(wěn)定性明顯改善,而且具有可重復使用性,有利于酶的工業(yè)化生產和儲存,為工業(yè)化酶法生產海藻糖提供一定理論依據。

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