正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化姜黃油及姜黃素提取工藝

羊青,王茂媛,晏小霞,王清隆,王建榮,王祝年

(中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，農(nóng)業(yè)部華南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，海南 儋州 571737)

姜黃為姜科植物姜黃(CurcumalongaL.)的干燥根莖，產(chǎn)于我國(guó)四川、福建、云南等省區(qū)，東亞及東南亞地區(qū)廣泛栽培，為藥食同源植物，被稱為“21世紀(jì)的健康明星”，除了作為傳統(tǒng)藥物使用之外，還廣泛用作著色劑、調(diào)味品、香料及防腐劑。姜黃性味辛、苦、溫；歸心、脾、肝經(jīng)，具有活血、散瘀、疏肝解郁的功效，可用于治療胸脅刺痛、閉經(jīng)、風(fēng)濕疼痛等[1]。姜黃中含有多種成分，主要為揮發(fā)油和姜黃素類化合物，此外還含有糖類、甾醇類等成分。姜黃揮發(fā)油為帶有芳香性氣味的油狀物質(zhì)，主要成分為姜黃烯、芳姜黃酮等萜類物質(zhì)，具有抑菌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤等功效[2-6]。姜黃的黃色物質(zhì)為略帶酸性的酚類物質(zhì)，是姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素的混合體，稱為姜黃素，具有利膽保肝、降血脂、活血通經(jīng)、抗生育、抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗艾滋病毒、抗動(dòng)脈粥樣硬化、預(yù)防老年癡呆[7-12]等生理和藥理作用。姜黃揮發(fā)油的提取方法主要包括水蒸氣蒸餾法、有機(jī)溶劑萃取法、超臨界CO2流體萃取法等[13-15]，其中水蒸氣蒸餾法具有提取設(shè)備簡(jiǎn)單，簡(jiǎn)便易操作，對(duì)溶劑純度要求不高等優(yōu)點(diǎn)，在工業(yè)生產(chǎn)上更為常用。姜黃素提取方法主要有溶劑提取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法等[16-18]，其中以乙醇作為溶劑提取較為常用。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法對(duì)常用的姜黃油和姜黃素的提取方法進(jìn)行優(yōu)化，提高姜黃中有效成分的提取效率。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

UV-2100紫外可見分光光度計(jì)、AY220分析天平 日本島津公司；XL-04A中藥材粉碎機(jī) 廣州金本機(jī)械設(shè)備有限公司；N-1001(2 L)立式旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海愛朗儀器有限公司；DHG9035A電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.1.2 試劑

實(shí)驗(yàn)采用的姜黃采自海南省，由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所王祝年研究員鑒定為姜科植物姜黃的根莖。姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品(HPLC≥98%，Sigma公司)，無(wú)水乙醇(分析純，廣州化工)。

1.2 方法

1.2.1 姜黃揮發(fā)油的提取

將收集的新鮮姜黃根莖洗凈烘干，并將其粉碎，過(guò)篩，干粉備用。參照《中國(guó)藥典》2010年版一部揮發(fā)油測(cè)定法(附錄XD甲法)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)定的因素，分別提取揮發(fā)油。姜黃油得率按下式計(jì)算：姜黃油得率=讀取的揮發(fā)油體積(mL)/姜黃粉末質(zhì)量(g)×100%。

1.2.2 姜黃素的提取

姜黃素不溶于水和乙醚，易溶于乙醇和冰醋酸，工業(yè)上常用乙醇提取，因此本文采用乙醇溶液提取法。

1.2.2.1 乙醇回流法

(1)準(zhǔn)確稱量樣品，加入圓底燒瓶中，加入75%乙醇溶液，混勻；(2)連接好回流冷凝管，將水浴鍋溫度調(diào)至80 ℃，加熱1.5 h；(3)將提取液過(guò)濾，往圓底燒瓶中加入乙醇溶液，加熱1.5 h再提取2次，合并濾液，并用乙醇溶液清洗樣渣2～3次；(4)將濾液用乙醇溶液定容至250 mL，待測(cè)；(5)用分光光度計(jì)測(cè)定待測(cè)液吸光度值，并計(jì)算出姜黃素含量。姜黃素含量計(jì)算方法如下。

1.2.2.2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

將標(biāo)準(zhǔn)品配制成0.05 mg/mL 的75%乙醇溶液；

將標(biāo)準(zhǔn)品溶液與樣品溶液在300～500 nm處掃描，找出最高吸收峰，得出吸收波長(zhǎng)為430 nm；

吸取不同量的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用75%乙醇稀釋，得濃度分別為0.8，1.0，2.0，4.0，8.0 μg/mL溶液，在分光光度計(jì)上分別測(cè)定吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度與吸光度(兩者的關(guān)系見表1)分別為橫、縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：y=0.1914x+0.01615，R2=0.9998，RSD=0.00815，其中x代表溶液濃度，y代表吸光度。

表1 相對(duì)濃度與吸光度的關(guān)系

1.2.2.3 樣品含量測(cè)定

取1 mL樣品溶液用75%乙醇稀釋至10 mL，得稀釋液1。取0.5 mL稀釋液1用75%乙醇稀釋至10 mL得稀釋液2，分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度，用回歸方程計(jì)算出樣品濃度。姜黃素含量由下式計(jì)算得到：

1.3 姜黃揮發(fā)油提取正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取浸泡時(shí)間(A)、提取時(shí)間(B)、料液比(C)、粉碎粒度(D)為考察因素，以提取揮發(fā)油體積為考察指標(biāo)，進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)。每因素平行3次，RSD值均在數(shù)據(jù)可用范圍內(nèi)，結(jié)果取平均值。

1.4 姜黃素提取正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取乙醇濃度(A)、提取時(shí)間(B)、提取次數(shù)(C)、粉碎粒度(D)為考察因素，以提取姜黃素提取率為考察指標(biāo)，進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)。每因素平行3次，RSD值均在數(shù)據(jù)可用范圍內(nèi)，結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 姜黃揮發(fā)油提取正交實(shí)驗(yàn)

應(yīng)用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)選最佳提取工藝參數(shù)。在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的前提下，設(shè)置了正交實(shí)驗(yàn)表，各因素水平見表2，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表2 姜黃揮發(fā)油提取正交實(shí)驗(yàn)因素水平表L9 (34)

表3 姜黃揮發(fā)油提取正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)均值計(jì)算和極差分析得知，各因素對(duì)姜黃揮發(fā)油提取效果影響大小的順序?yàn)樘崛r(shí)間(B)>粉碎粒度(D)>料液比(C)>浸泡時(shí)間(A)。各因素水平的最佳組合為A1B2C1D3或A3B2C1D3。揮發(fā)油得率最高的組合為第8號(hào)實(shí)驗(yàn)A3B2C1D3，該組合與L9(34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。為了進(jìn)一步驗(yàn)證最佳工藝條件，對(duì)組合A1B2C1D3和A3B2C1D3再次進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。驗(yàn)證結(jié)果發(fā)現(xiàn)2組實(shí)驗(yàn)的揮發(fā)油得率基本一樣，由此可知A因素(浸泡時(shí)間)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果幾乎沒有影響，考慮到提取效率，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)方案藥材均不浸泡。最終確定最佳提取工藝為提取時(shí)間6.0 h，料液比1∶20(g/mL)，粉碎粒度80目。

2.2 姜黃素提取正交實(shí)驗(yàn)

應(yīng)用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)選最佳提取工藝參數(shù)。在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的前提下，設(shè)置了正交實(shí)驗(yàn)表，各因素水平見表4，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。

表4 姜黃素提取正交實(shí)驗(yàn)因素水平表L9(34)

表5 姜黃素提取正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)均值計(jì)算和極差分析得知，各因素對(duì)姜黃素提取效果影響大小的順序?yàn)橐掖紳舛?A)>粉碎粒度(D)>提取時(shí)間(B)>提取次數(shù)(C)。各因素水平的最佳組合為A2B3C2D3或A2B3C3D3，即乙醇濃度75%，提取時(shí)間2.0 h/次，提取次數(shù)2次或3次，粉碎粒度80目。因素C中，提取3次比提取2次姜黃素含量增加明顯，而提取4次與提取3次差異不大，為了縮短周期，決定提取3次，即選用A2B3C2D3組合。姜黃素含量最高的組合為第4號(hào)實(shí)驗(yàn)A2B1C2D3，這與正交實(shí)驗(yàn)計(jì)算出的最優(yōu)組合A2B3C2D3僅有B因素每次提取時(shí)間存在差異。為了進(jìn)一步驗(yàn)證最佳工藝條件，在不改變因素A，C，D的條件下，對(duì)B因素的3個(gè)水平同時(shí)進(jìn)行驗(yàn)證，即對(duì)組合A2B1C2D3，A2B2C2D3，A2B3C2D3進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，3個(gè)組合的姜黃素含量分別為3.20%，3.23%，3.24%，組合A2B3C2D3姜黃素含量最高，但其與A2B2C2D3組合結(jié)果差異不大，即每次提取1.5 h與提取2.0 h的結(jié)果差異不明顯。因此將每次提取時(shí)間確定為1.5 h，由此確定最佳工藝為乙醇濃度75%，提取時(shí)間1.5 h/次，提取次數(shù)3次，粉碎粒度80目。

3 結(jié)論

采用水蒸氣蒸餾法，應(yīng)用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化姜黃揮發(fā)油的提取工藝。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置了4個(gè)影響因素，即提取時(shí)間、粉碎粒度、料液比和浸泡時(shí)間，并分別設(shè)置了3個(gè)水平進(jìn)行工藝篩選。通過(guò)均值計(jì)算和極差分析得知，各因素對(duì)姜黃揮發(fā)油提取效果影響大小的順序?yàn)樘崛r(shí)間>粉碎粒度>料液比>浸泡時(shí)間。通過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)浸泡時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果幾乎沒有影響，為了提高效率，藥材均不浸泡。在通過(guò)比較實(shí)驗(yàn)后，確定了最佳工藝組合為A1B2C1D3/A3B2C1D3，即提取時(shí)間6.0 h，料液比1∶20(g/mL)，粉碎粒度80目。采用乙醇溶液回流法，應(yīng)用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化姜黃素的提取工藝。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置了4個(gè)影響因素，即乙醇溶液濃度、提取時(shí)間、提取次數(shù)和粉碎粒度，并分別設(shè)置了3個(gè)水平進(jìn)行工藝篩選。通過(guò)均值計(jì)算和極差分析得知，各因素對(duì)姜黃素提取效果影響大小的順序?yàn)橐掖紳舛?粉碎粒度>提取時(shí)間>提取次數(shù)。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)每次提取1.5 h與提取2.0 h的結(jié)果差異不明顯，為了節(jié)省時(shí)間，提高效率，將每次提取時(shí)間確定為1.5 h。由此確定采用的工藝組合為A2B2C2D3，即乙醇濃度75%，提取時(shí)間1.5 h/次，提取次數(shù)3次，粉碎粒度80目。此實(shí)驗(yàn)方法有效地提高了海南產(chǎn)姜黃有效成分的提取效率。