紅細胞微粒與深靜脈血栓形成關(guān)系的研究進展

張喆婷 徐新 張社兵

隨著科技發(fā)展，人們對細胞微粒（microparticles，MPs）的認識不斷提高。雖然MPs的產(chǎn)生過程未被闡明，但普遍認為MPs是血液中細胞活化和凋亡過程中通過細胞的胞吐作用產(chǎn)生的一種直徑為0.1～1.0 μm的小囊泡。大量的基礎(chǔ)和臨床研究表明，血栓性疾病與凝血因子、血小板、血管內(nèi)皮細胞、組織因子有關(guān)。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，MPs也在其中發(fā)揮重要作用，其中紅細胞微粒（erythrocyte-derived microparticles，ErMPs）具有調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[1,2]及激活凝血系統(tǒng)[3,4]的作用。Wu等[5]報道，血栓性疾病患者血液中ErMPs水平明顯升高。由此可見，探究ErMPs是否可成為一種預(yù)測深靜脈血栓形成等血栓性疾病進展及預(yù)后的新標(biāo)志物顯得十分有意義。本文就微粒結(jié)構(gòu)、紅細胞微粒產(chǎn)生、促凝活性以及與深靜脈血栓形成關(guān)聯(lián)性進行闡述，以期為后續(xù)深入研究提供基礎(chǔ)。

1 深靜脈血栓形成（DVT）概述

深靜脈血栓形成（deep venous thrombosis，DVT）是指血液在深靜脈內(nèi)非正常凝結(jié)，屬于一種靜脈回流障礙性疾病，在臨床較為常見。其發(fā)病率占周圍血管疾病的40%。DVT的并發(fā)癥多為肺栓塞、股白腫或股青腫及慢性靜脈功能不全綜合征等。無論是深靜脈血栓本身還是其并發(fā)癥，均可影響患者的工作及生活質(zhì)量甚至導(dǎo)致死亡。并且據(jù)報道，約30%的靜脈血栓患者經(jīng)抗凝治療后5年間仍存在一定的復(fù)發(fā)可能性[6]。流行病學(xué)調(diào)查報道，美國靜脈血栓每年新發(fā)病例超過100萬例；在國內(nèi)尚缺乏DVT發(fā)病率確切的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，但是其發(fā)病率有逐年上升趨勢。目前由于患者對DVT意識不足、診斷缺乏早期精確指標(biāo)、抗凝治療周期長及INR值監(jiān)測頻繁等眾多因素，故患者依從性差，疾病的診治及預(yù)后并不理想。因此，尋找一種能早期精準(zhǔn)診斷DVT的生物學(xué)標(biāo)志物顯得尤為重要。

2 MPs概述

MPs是在各種刺激因素下（如血流切應(yīng)力、補體攻擊、氧化應(yīng)激及凋亡前刺激等）真核細胞活化或凋亡時的產(chǎn)物，可循環(huán)于人類外周血中。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，MPs含有豐富的母細胞的表面蛋白、脂質(zhì)和胞質(zhì)成分，如表面受體、細胞因子、磷脂、信使核糖核酸（mRNA）和小分子核苷酸（microRNA）。Rank等[7]的研究提及，MPs的生命半周期平均為5.8 h。從MPs分類而言，根據(jù)細胞來源，MPs分為血小板源性的MPs（PMPs）、白細胞源性的MPs（LMPs）、紅細胞源性微粒（ErMPs）、巨噬細胞源性MPs、內(nèi)皮細胞源性MPs（EMPs）及癌細胞源性MPs等多個類型。不同源性MPs表達不同的促凝物質(zhì)，其促凝方式也存在一定差異。

隨著MPs的臨床應(yīng)用研究越來越多，MPs的檢測技術(shù)也不斷增多，應(yīng)用最廣泛的為流式細胞儀（FACS）。同時運用免疫熒光技術(shù)還可以精確地檢測到細胞微粒的數(shù)目和來源。

Nomura等[8]的研究證實，不同起源細胞的MPs具有不同的表面標(biāo)記物，如PMPs可表達CD41a、CD62P及Annexin V等，EMPs可表達CD31、CD144及Annexin V等。而Grisendi等[9]則發(fā)現(xiàn)，ErMPs的表面標(biāo)志物為CD235a（+）及Annexin V等。故根據(jù)MPs大小和表面標(biāo)記物，可以更準(zhǔn)確地檢測出不同來源的MPs。目前人們對PMPs、LMPs及EMPs研究較多，對ErMPs的認識較少。

3 ErMPs概述

ErMPs是指紅細胞在各個因素刺激下發(fā)生活化或凋亡反應(yīng)時所釋放的一種產(chǎn)物。隨著關(guān)于ErMPs的蛋白組學(xué)研究的不斷深入，有研究報道，ErMP組成成分與紅細胞存在一定的區(qū)別，但ErMPs可表達某些紅細胞的表面蛋白抗原［如CD235a（+）］[8]。并且不同的刺激因素可引起ErMPs組成成分發(fā)生相應(yīng)的變化，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的主要成分有含Band3蛋白、血型糖蛋白A、補體蛋白和GPI錨定蛋白等。

4 ErMPs的檢測

目前ErMPs的檢測技術(shù)多種多樣，常用的方法有顯微鏡觀察、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、流式細胞儀（FACS）和蛋白組學(xué)等。FACS的操作方法簡便快捷，并且可進行熒光標(biāo)記檢測，使其成為臨床檢測ErMPs的重要方法[10]。隨著技術(shù)的發(fā)展，F(xiàn)ACS不僅可以檢測到直徑最小約0.1 μm的ErMPs，還可以對其進行定量分析。近年來，國外相關(guān)研究證明，通過CD235a（+）、膜聯(lián)蛋白V及二醋酸羥基熒光素琥珀酰亞胺脂（CFSE）三者同時與ErMPs表面蛋白抗原結(jié)合，可以更有效地測定血液中ErMPs的數(shù)量[8]。

5 ErMPs的促凝作用

5.1 ErMPs與內(nèi)皮細胞 眾所周知，正常的血管內(nèi)皮細胞具有調(diào)節(jié)凝血和抗凝血等作用，血管內(nèi)皮細胞里產(chǎn)生的一氧化氮（NO）可進入血小板細胞，使血小板活性降低，抑制其凝集和向血管內(nèi)皮黏附，從而防止血栓的形成。當(dāng)內(nèi)皮細胞功能受到損傷時可促進凝血反應(yīng)發(fā)生，進而促進血栓形成。由此推測血管內(nèi)皮細胞損傷與DVT的發(fā)生有密切關(guān)系。

當(dāng)紅細胞發(fā)生活化或凋亡反應(yīng)時，將釋放含有血紅蛋白的ErMPs及游離的血紅蛋白，其中所含有的亞鐵離子可迅速與NO結(jié)合，以比紅細胞快1000倍左右的清除速度把NO從體內(nèi)清除，進而達到降低NO生物利用度的目的[11]。當(dāng)NO生物利用度下降后，血小板便更容易被激活，從而增加血栓形成的風(fēng)險。大量研究已證實NO作用于平滑肌細胞時，平滑肌松弛，引起血管舒張作用。Camus等[12]報道，ErMPs、游離血紅蛋白具有收縮血管的作用，從側(cè)面提示ErMPs及游離紅細胞在NO清除過程中起一定作用。由此表明ErMPs可通過降低NO生物利用度而達到促凝的作用。

5.2 ErMPs與PS外翻 相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，ErMPs的膜主要為雙層磷脂，由脂類、蛋白質(zhì)及糖類組成。靜息狀態(tài)下，各種磷脂不對稱地分布于細胞膜兩側(cè)分布于細胞膜外側(cè)的為磷脂酰膽堿和鞘磷脂，而磷脂酰乙醇胺（phosphatidyiethanolamine，PE）和磷脂酰絲氨酸（hosphatidylserine，PS）則分布于內(nèi)層，這種不對稱性需要消耗能量來維持。當(dāng)紅細胞激活或凋亡后釋放ErMPs，其位于膜內(nèi)側(cè)的大量PS（帶負電荷）外翻，更易與凝血蛋白上的γ－羧基谷氨酸酶結(jié)構(gòu)域（帶正電荷）發(fā)生靜電反應(yīng)，更容易與凝血因子結(jié)合，從而進一步促進凝血反應(yīng)[13]。眾所周知PS作為凝血啟動和吞噬識別過程中重要的信號分子，可有效地促進凝血因子FX的激活和凝血酶生成，從而促進血栓的形成。Guo等[14]的研究發(fā)現(xiàn)，合并DIC的急性早幼粒細胞白血?。╝cute promyelo cytic leukemia，APL）患者血漿中PS呈高表達水平PS表達水平對評估血栓形成傾向有一定的意義Mankelow等[15]的研究表明，SCD患者的高凝狀態(tài)可能與攜有PS促凝微粒的紅細胞存在密切關(guān)系由此推測，PS外翻在深靜脈血栓形成過程中發(fā)揮著一定的促凝作用。

5.3 ErMPs與TF表達 組織因子（tissue factor TF）是一種跨膜糖蛋白，是體內(nèi)凝血途徑的主要啟動因子。TF主要以在微粒上表達的形式存在，這種微粒即為TF+MPs，其促凝作用最大。相關(guān)研究已證實TF+MPs的促凝活性高于無TF表達的MPs約10倍[16]。有研究[17]表明，MPs表面可表達組織因子TF，ErMPs也不例外。當(dāng)組織和血管損傷后釋放TF，TF與凝血因子Ⅶ/活化凝血因子Ⅶa（FⅦ/FⅦa結(jié)合，從而啟動外源性凝血反應(yīng)[18]。因為TF是FⅦⅦa的受體，其對FⅦ/FⅦa有很高的親和力，當(dāng)紅細胞活化或凋亡時產(chǎn)生ErMPs，其表面表達TF時更容易結(jié)合FⅦ/FⅦa，從而形成凝血起始復(fù)合物激活FX和FIX啟動凝血，故增強了ErMPs的促凝活性。

6 ErMPs與深靜脈血栓形成關(guān)系

DVT是臨床常見病、多發(fā)病。1946年，Virchow提出：DVT三大發(fā)病原因為靜脈壁損傷、血流緩慢和血液高凝狀態(tài)。目前對此理論有了更多新的認識，尤其是DVT發(fā)病相關(guān)高危因素受到了重視。目前普遍認為內(nèi)在和環(huán)境因素（年齡、制動、原發(fā)性高凝狀態(tài)、血型、地域差異、肥胖）、手術(shù)和創(chuàng)傷、靜脈留置導(dǎo)管、疾病因素（惡性腫瘤、SLE、炎癥性腸?。?、女性特殊因素（妊娠、口服避孕藥）等是深靜脈血栓形成的高危因素[19]，但其確切發(fā)病機制還不清楚。

目前相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，MPs已經(jīng)涉入廣泛疾病譜，包括心血管疾病、糖尿病、炎癥狀態(tài)、敗血癥、抗磷脂抗體綜合征、血栓性血小板減少性紫癜和癌癥等。而這些疾病常導(dǎo)致血栓形成的高凝狀態(tài)。Zhou等[20]提出MPs在靜脈血栓栓塞癥（VTE）的病理生理過程中發(fā)揮重要作用。從病理學(xué)角度分析，血栓性淺表靜脈炎病理變化特點是靜脈壁有不同程度的炎癥、增厚和血管腔內(nèi)血栓形成。而靜脈血流滯緩和血液高凝狀態(tài)等情況往往可引起深靜脈血栓形成，其血栓主要組成部分為紅細胞、血小板及少量纖維蛋白等。由此推測，由紅細胞釋放的ErMPs在深靜脈血栓形成中也起到一定作用。

大量的研究表明，MPs是幾種病理生理過程中的關(guān)鍵效應(yīng)物，如內(nèi)皮損傷和功能障礙、斑塊破裂、新生血管形成及急性血栓形成等。Jia等[21]的研究提及外周血中的PMPs可與ErMPs結(jié)合形成結(jié)合體，并通過試驗發(fā)現(xiàn)冠心病血淤證患者外周血中結(jié)合體呈高表達水平，由此推斷ErMPs在血淤證中發(fā)揮一定作用。而Amabile等[22]也提出，隨著患者血漿MPs水平的升高，患者發(fā)生動脈粥樣硬化、血栓形成及急性冠狀動脈疾病的風(fēng)險也隨之升高。同時也證實靜脈血栓栓塞患者的血漿中可檢測到CD31（+）-EMPs，而慢性腎衰竭合并內(nèi)皮細胞功能障礙患者的血漿中可檢測到ErMPs，但DVT與ErMPs相關(guān)性仍需不斷探究。

Suades等[23]的研究發(fā)現(xiàn)，急性ST-T段抬高型心肌梗死患者外周血中ErMPs及CD235a（+）的表達水平較健康對照組顯著升高，并且進行再灌注治療后ErMPs及CD235a（+）表達水平呈明顯下降趨勢。此研究發(fā)現(xiàn)，冠狀動脈血栓患者的外周動脈血中ErMPs水平高表達，表明外周血中ErMPs定量可用作急性期動脈血栓形成的敏感標(biāo)記物。Suades等[23]表示，將進一步深入探究CD235a（+）-ErMPs在預(yù)測靜脈血栓形成中的評估價值。

近年來，國外有研究報道，血液-骨髓細胞源性的TF在某些疾病患者外周血中呈高表達水平，尤其是靜脈血栓疾病[24]。眾所周知，APL患者為下肢靜脈血栓形成好發(fā)人群，Zhang等[25]的研究證實，APL-BM-MNC來源微粒具有明顯的促凝活性。而其中ErMPs是否亦發(fā)揮相應(yīng)作用仍需深入研究。Tesselaar等[26]首次描述了TF+MPs與急性靜脈血栓的關(guān)系。這項研究表明，合并VTE的胰腺癌和乳腺癌患者體內(nèi)TF+MPs水平最高，并且TF+MPs活性明顯高于健康個體及自發(fā)性VTE患者。Zwicker等[27]也得出相似的結(jié)論，胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、直腸癌患者體內(nèi)TF+MPs高表達，原未合并靜脈血栓的癌癥患者其1年內(nèi)發(fā)生血栓率為38%，且均為TF+MPs高表達患者，不高者發(fā)生率為0。Thaler等[28]則提及TF與癌癥組織學(xué)分級、血管相關(guān)侵襲、血管生成和靜脈血栓栓塞的發(fā)生具有相關(guān)性，并證實高活性的TF-MP存在于低分化的胰腺癌表型中，其可浸潤胰周血管。因此，TF+ErMPs可能參與靜脈血栓形成的過程。

最近國外有關(guān)MPs的研究報道，MPs高表達可能增加自身免疫性疾病患者發(fā)生血栓事件的風(fēng)險。Niccolai等[29]報道，ErMP可能在血栓形成中具有一定作用，尤其是慢性溶血性疾病，如地中海貧血（halassemia）、鐮狀細胞?。╯ickle cell disease，SCD）及陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿（paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH）等。相關(guān)研究證實，溶血過程中紅細胞裂解所產(chǎn)生的ErMPs能夠激活內(nèi)源性凝血途徑，促進凝血酶的生成[30]。

近年來，人們對ErMPs與慢性溶血性疾病患者合并血栓性疾病的關(guān)注不斷增加。例如Sun等[31]報道中提及，中間型地中海貧血患者脾切術(shù)后，血漿中ErMPs數(shù)量較術(shù)前急劇增多。

Camus等[32]通過大鼠模型實驗證實，SCD來源的ErMPs可引起大鼠血管閉塞及腎、腦血液灌流的減少，且隨著MPs劑量的增加，其血管閉塞持續(xù)時間延長。Kozuma等[33]的研究表明，PNH患者發(fā)生溶血反應(yīng)時常伴有血栓形成，其外周紅細胞釋放的MPs的促凝活性促進PNH的血栓形成。而最近相關(guān)研究報道，PNH細胞通過補體沉積的非鈣離子依賴途徑釋放ErMPs，從而增加血栓形成風(fēng)險[34]。

綜上所述，深靜脈血栓形成是一種臨床常見病、多發(fā)病，近年來我國DVT的發(fā)病率呈上升趨勢。初診DVT主要通過患者的臨床癥狀、臨床體征、相關(guān)輔助檢查（如D-二聚體、血管B超）等多個方面綜合考慮，但診斷存在一定的滯后性，這將延誤治療的最佳時機并影響患者的預(yù)后。如果可以尋找到一種可早期預(yù)測DVT的生物標(biāo)志物，無疑是診治DVT的福音。目前隨著人們對ErMPs的關(guān)注不斷增加，其在血栓性疾病中的作用不斷被發(fā)現(xiàn)[8]，如調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞功能、激活凝血系統(tǒng)及調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)等。但ErMPs具體的促凝機制及與深靜脈血栓形成的關(guān)系仍未被闡明，仍需我們進行大量科研研究及臨床應(yīng)用。相信在不久的未來，ErMPs將為深靜脈血栓的預(yù)防和治療開拓一個全新的視野。

［1］Radwanski K，Garraud O，Cogasse F，et al．The effects of red blood cell prepartion method in vitro markers of red blood cell aging and inflammatory response．Transfusion，2013，53：3128-3138．

［2］Belizaire RM，Prakash P，Richter JR，et al．Microparticles from stored red blood cells activate neutrophils and cause lung injury after hemorrhage and resuscitation．J Am Coll Surg，2012，214：648-655．

［3］Koshiar RL，Somajo S，Norstrm E，et al．Erythrocyte-derived microparticles supporting activated protein C-mediated regulation of blood coagulation．PLoS One，2014，9：104-200．

［4］Tantawy AA，Adly AA，Ismail EA，et al．Circulating platelet and erythrocyte microparticles in young children and adolescents with sickle cell disease：Relation to cardiovascular complications．Platelets，2013，24：605-614．

［5］Wu ZH，Ji CL，Li H，et al．Membrane microparticles and diseases．Eur Rev Med Pharmacol Sci，2013，17：2420-2427．

［6］Nakamura M，Yamada N，Ito M．Current anagement of venous thromboembolism in Japan：Current epidemiology and advances in anticoagulant therapy．J Cardiol，2015，66：451-459．

［7］Rank A，Nieuwland R，Crispin A，et al．Clearance of platelet microparticles in vivo．Platelets，2011，22：111-116．

［8］Nomura S，Shimizu M．Clinical significance of procoagulant microparticles．J Intensive Care，2015，3：2．

［9］Grisendi G，F(xiàn)inetti E，Manganaro D，et al．Detection of microparticles from human red blood cells by multiparametric flow cytometry．Blood Transfus，2015，13：274-280．

［10］Van der Pol E，Coumans FA，Grootemaat AE，et al．Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy，flow cytometry，nanoparticle tracking analysis，and resistive pulse sensing．Thromb Haemost，2014，12：1182-1192．

［11］ LiaoHX，ZhangWL，MaX．CurrentAdvancementsof Erythrocyte-derived Microparticles in Coronary Heart Disease．Adv Cardiovasc Dis，2016，37：525-528．

［12］ CamusSM，GausseresB，BonninP，etal．Erythrocyte microparticles can induce kidney vaso-occlusions in a murine model of sickle cell disease．Blood，2012，120：5050-5058．

［13］Rubin O，CrettazD，Tissot JD，et al．Microparticles in stored red blood cells：submicron clotting bombs?Blood Transfus， 2010，8：31-38．

［14］Guo F，Meng DM，Zhang N，et al．Role of TF+MP and Ps i thrombogensis of acute promyelocytic leukemia．Chin J Clin Pat 2013，5：222-225．

［15］Mankelow TJ，Griffiths RE，Trompeter S，et al．Autophagi vesicles on mature human reticulocytes explain phosphatidylser ine-positive red cells in sickle cell disease．Boold，2015，126 1831-1834．

［16］Xu J，Meng WT．Role of tissue factor positive microparticles i coagalation and thrombosis．IJBTH，2016，39：174-179．

［17］易曉榕，桂曉美，馮江．微粒與凝血．實驗與檢驗醫(yī)學(xué)，2016 34：322-326．

［18］Geddings JE，Mackman N．New players in haemostasis an thrombosis．Thromb Haemost，2014，111：570-572．

［19］Zhang BY，Xue GH．Causes and risk factors of deep venou thrombosis．Chin J Surg，2003，23：197-200．

［20］Zhou L，Qi XL，Xu MX，et al．Microparticles：new light she on the understanding of venous thromboembolism．Acta Pharma col Sin，2014，35：1103-1110．

［21］Jia QL，Meng H，Hu YH，et al．Microparticles aggregates o peripheral blood in the unstable angina pec-toris patients with blood stasis pattern．J B Univ Tradit Chin Med，2017，40：59 64．

［22］Amabile N，Rautou PE，Tedgui A，et al．Microparticles：ke protagonists in cardiovascular disorders．Semin Thromb Hemost 2010，36：907-916．

［23］Suades R，Padro T，Vilahur G，et al．Growing thrombi releas increased levels of CD235a（+）microparticles and decrease levels of activated platelet derived microparticles．Validation in ST-elevation myocardial infarction patients．J Thromb Haemost 2015，13：1776-1786．

［24］Manly DA，Boles J，Mackman N．Role of tissue factor in ve nous thrombosis．Annu Rev Physiol，2011，73：515-525．

［25］Zhang YM，Chen B，Wu LY，et al．Role of Microparticles De rived from Acute Promyelocvtic Leukemia Cells in Coagulopathy J Exp Hematol，2017，25：693-698．

［26］Tesselaar ME，Romijn FP，Van Der Linden IK，et al．Mi croparticle associated tissue factor activity in cancer patient with and without thrombosis．J Thromb Haemost，2009，7：1421 1423．

［27］Zwicker JI，Liebman HA，Neuberg D，et al．Tumor-derive tissue fator-bearing microparticles are associated with venou thromboembolic events in malignancy．Clin Cancer Res 2009，15：6830-6840．

［28］Thaler J，Cihan AY，Mackman N，et al．Microparticleassociated tissue factor activity in patients with pancreatic cancer：correlation with clinicopathological features．Eur J Clin Invest，2013，43：277-285．

［29］Niccolai E，Emmi G，Squatrito D，et al．Microparticles：Bridging the Gap between Autoimmunity and Thrombosis．Semin Thromb Hemost，2015，41：413-422．

［30］Stief TW．Thrombin generation by hemolysis．Blood Coagul Fibrinolysis，2007，18：61-66．

［31］Sun N，Cheng P，Deng DH．Advances in Pathogenesis and Related Clinical Research of Thromboembolism in Patients with Thaiassemia after Splenectomy．J Exp Hematol，2016，24：949-953．

［32］Camus SM，De Moraes JA，Bonnin P，et al．Circulating cell membrane micmparticlestransferheme to endofhelialcells activation and vaso-occlusions in sickle cell disease．Blood，2015，125：3805-3814．

［33］Kozuma Y，Sawahata Y，Takei Y，et al．Procoagulant properties of microparticles released from red blood cells in paroxysmal nocturnal haemoglobinuria．Br J Haematol，2011，152：631-639．

［34］Su X，Cheng P，Deng DH．Research Advance of Microparticles in Hypercoagulation of Hemolvtic Anemia．J Exp Hematol，2017，25：622-626．