重金屬污染土壤微生物的分離與研究

魏 超 ，楊定清 ，吳健英 ，代曉航 ，向 冰

（1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心，四川成都610066；2.樂山市農(nóng)業(yè)信息站，四川樂山614000）

土壤重金屬污染是指人類活動(dòng)使重金屬進(jìn)入到土壤，致使土壤中重金屬含量明顯高于背景值，并造成生態(tài)環(huán)境惡化的現(xiàn)象[1]。隨著工業(yè)三廢[2-3]和生活污水排放，礦山廢棄[4-5]的與日俱增，土壤、水體的重金屬污染日益嚴(yán)重。土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，它不僅可以指示污染土壤的生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性，而且還具有巨大的潛在環(huán)境修復(fù)功能[6]?，F(xiàn)今重金屬土壤改良大體有2種方法：理化方法和生物方法[7-8]，其中，生物方法多采用植物富集[9-10]，然后將植物去除達(dá)到減少土壤重金屬的目的，此法的優(yōu)點(diǎn)是有效去除重金屬污染，但缺點(diǎn)是耕地閑置，無法有效利用資源，生物方法的另外一個(gè)方向是采用活性微生物的富集作用，競(jìng)爭(zhēng)土壤中的重金屬元素，再利用生物固氮的方法改變土壤的營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)，達(dá)到改良土壤的作用[11]?？梢姡瑢ふ业街亟饘傥廴就寥乐型林患亟饘傥⑸锸巧锓椒ㄍ寥佬迯?fù)的關(guān)鍵步驟。此外，特殊環(huán)境中的土著微生物為適應(yīng)環(huán)境，具備特有的選擇性進(jìn)化，也是指示土壤污染程度的有效工具，對(duì)重金屬污染土壤中微生物的種群研究十分必要。

本試驗(yàn)從不銹鋼廠排污口附近土壤中分離耐高濃度重金屬的微生物，對(duì)其進(jìn)行鑒定和富集試驗(yàn)，旨在為微生物法土壤改良提供理論保障。

1 材料和方法

1.1 材料

取距不銹鋼廠（樂山）排污口直徑50 m、深度10 cm的樣品土壤100 g，取3處不同的點(diǎn)。

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱生物科技有限公司）；瓊脂（美國(guó)sanland公司）。

1.2 試劑和儀器

甲酸（色譜純），美國(guó)TEDIA公司；乙醇、乙腈（色譜純），美國(guó)Fisher Scientific公司；α-氰基-4-羥基肉桂酸（CHCA），美國(guó)SIGMA公司；MOS級(jí)硝酸，上海阿拉丁生化科技公司；氫氟酸、鹽酸，成都科隆公司。試驗(yàn)用水為雙蒸水。

原子吸收光譜儀（美國(guó)Varian公司，SpectrAA 220FS）；基質(zhì)解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）（日本島津公司，AXIMAConfidence）；生物安全柜（上海立申儀器設(shè)備有限公司，HF-safe-1200）；生物培養(yǎng)箱（寧波東南儀器有限公司，DHP-9082）。

1.3 土壤中重金屬的測(cè)定

1.3.1 樣品前處理 準(zhǔn)確稱取0.10 g土壤樣品于60 mL四氟乙烯坩堝中，加入5 mL鹽酸，放置在電熱板上低溫加熱，使樣品初步分解，當(dāng)樣品蒸發(fā)至2 mL時(shí)，取下稍冷，然后加入10 mL硝酸、5 mL氫氟酸置于200℃恒溫電熱板上加熱消解，樣品消解完全，繼續(xù)加熱至白煙冒盡，當(dāng)樣品呈黏稠狀時(shí)，用水沖洗，加2 mL硝酸溫?zé)崛芙鈿堅(jiān)?，轉(zhuǎn)移定容至10 mL待測(cè)。

1.3.2 儀器條件與回歸方程 采用火焰原子吸收法（FAAS）測(cè)定土壤中鉛（Pb）、鉻（Cr）、鎳（Ni）、銅（Cu）、鐵（Fe）、鋅（Zn）含量，儀器條件：狹縫寬 0.5mm，燃?xì)饬魉?.0 L/min，助燃?xì)饬魉?3.5 L/min，吸收波長(zhǎng)如表1所示，用0.5%的硝酸逐級(jí)稀釋單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別配制0.000，0.500，1.000，2.000，4.000mg/L的 Cu，Ni，Cr標(biāo)準(zhǔn)系列溶液；0.00，5.000，10.000，20.000，40.00μg/L的Pb標(biāo)準(zhǔn)系列溶液；0.000，0.500，0.100，0.200，0.400，0.800 mg/L 的 Zn 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液；0.000，2.000，4.000，8.000，16.000 mg/L 的 Fe標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，在優(yōu)化的儀器工作條件下測(cè)定吸光度并繪制工作曲線，工作曲線方程及相關(guān)系數(shù)列于表1。

表1 土壤重金屬檢測(cè)條件

1.4 微生物的分離

根據(jù)土壤中重金屬的檢測(cè)結(jié)果，設(shè)計(jì)高Fe選擇性培養(yǎng)基：基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)瓊脂33.0 g/L，瓊脂10.0 g/L，121℃滅菌15min，待培養(yǎng)基冷卻至65℃時(shí)，添加過膜除菌 FeSO4·7H2O（1 g/mL）溶液 50 mL，傾注 15～20mL于90mm×90mm平皿冷凝待用；設(shè)計(jì)高Cr培養(yǎng)基：基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)瓊脂33.0g/L，121℃滅菌15min，待培養(yǎng)基冷卻至65℃時(shí)，添加過膜除菌K2Cr2O7（1g/mL）溶液10 mL，傾注15～20 mL于90 mm×90 mm平皿冷凝待用；將土壤樣品在無菌生理鹽水中分別進(jìn)行1∶10，1∶100，1∶1 000 稀釋，取 0.3 mL 稀釋液分別涂布于高Fe選擇性培養(yǎng)平板和高Cr選擇性培養(yǎng)平板，36℃培養(yǎng)24h，挑取單菌落用高Fe選擇性培養(yǎng)平板和高Cr選擇性培養(yǎng)平板經(jīng)典純化2次。

1.5 微生物的鑒定

純化后微生物采用MALDI-TOFMS進(jìn)行鑒定[12]。

前處理?xiàng)l件：移取適當(dāng)菌量加入1.0mL70%乙醇水溶液，振蕩30 s后離心1 min棄溶液，加入70%乙酸水溶液0.75 mL振蕩20 s，25℃，40 kHz超聲10 min，加入0.75 mL乙腈振蕩均勻，4 000 r/min離心 1 min，取上清液 1 μL點(diǎn)至靶板，揮干，加入 1 μL CHCA，揮干。

質(zhì)譜條件：檢測(cè)器線性模式-電子倍增管（multiple dynode），電噴霧離子源（ESI），氮?dú)饧す馄?，固定聚?37 nm，激光束能頻75～80 Hz，收集范圍2 000～20 000（m/z），每樣品100次收集峰疊加，ATCC8739大腸桿菌為校準(zhǔn)品。

1.6 微生物在重金屬液體培養(yǎng)基生長(zhǎng)研究

高Fe液體培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基18 g/L，121℃滅菌15min，待培養(yǎng)基冷卻至65℃時(shí)，添加過膜除菌 FeSO4·7H2O（1 g/mL）溶液 50 mL；高 Cr液體培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基18g/L，121℃滅菌15min，待培養(yǎng)基冷卻至65℃時(shí)，添加過膜除菌K2Cr2O7（1g/mL）溶液10 mL，將微生物接種在液體培養(yǎng)基后在0，4，8，18，24，26，42，48，50，70h，取 1mL 菌液經(jīng)稀釋涂布營(yíng)養(yǎng)瓊脂進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)，并將獲得結(jié)果采用ComBase軟件進(jìn)行擬合，可獲得微生物在重金屬培養(yǎng)溶液中的生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤重金屬檢測(cè)

由表2可知，3份土壤中重金屬鐵的含量非常高，T6064樣品的鐵含量最高，可達(dá)2.0×105mg/kg，鉻也遠(yuǎn)高于一般土壤，屬于重金屬嚴(yán)重污染土壤，3份土壤中每種重金屬含量都有一定的差異，這和取樣位置有關(guān)。

2.2 微生物的分離與鑒定

因?yàn)橥寥乐需F的含量較高，固體培養(yǎng)基在金屬鹽十分高的情況下無法凝結(jié)，所以，分離培養(yǎng)基設(shè)計(jì)中降低了Fe鹽比率并額外添加了瓊脂，設(shè)計(jì)高Fe選擇性培養(yǎng)基中共分離出微生物1株，經(jīng)質(zhì)譜鑒定為希瓦氏菌（Shewanella sp.），鑒定圖譜如圖1所示；在設(shè)計(jì)高Cr選擇性培養(yǎng)基中共分離到微生物1株，經(jīng)鑒定為短小芽孢菌（Bacillus pumilus），鑒定圖譜如圖2所示。

2.3 希瓦氏菌在Fe鹽培養(yǎng)基的生長(zhǎng)狀況

希瓦氏菌在Fe鹽培養(yǎng)基的生長(zhǎng)點(diǎn)擬合生長(zhǎng)曲線如圖3所示，點(diǎn)狀圖是實(shí)測(cè)微生物濃度的對(duì)數(shù)值，擬合生長(zhǎng)曲線無延滯期的Baranyi and Roberts模型[13]如公式（1），（2），符合微生物正常生長(zhǎng)狀態(tài)。試驗(yàn)表明，分離希瓦氏菌在高鐵液體培養(yǎng)基中可耐受并且生長(zhǎng)良好。有研究表明，部分希瓦氏菌種營(yíng)養(yǎng)方式為能自養(yǎng)通過氧化Fe2+獲得自身生長(zhǎng)的能量，可用作浸礦菌種[14-17]，本試驗(yàn)中分離的希瓦氏菌（Shewanella sp.）可在高濃度鐵鹽中生長(zhǎng)，具有一定的開發(fā)意義。

式中，t為時(shí)間（h）；Y（t）為 t時(shí)的菌數(shù)（cfu/g）；Y0為初始菌數(shù)（cfu/g）；Ymax為最大菌數(shù)（cfu/g）；μmax為最大比生長(zhǎng)速率；h0為模型的參數(shù)。

2.4 短小芽孢菌在Cr鹽培養(yǎng)基的生長(zhǎng)狀況

短小芽孢菌在Cr鹽培養(yǎng)基的生長(zhǎng)點(diǎn)擬合生長(zhǎng)曲線如圖4所示，點(diǎn)狀圖是實(shí)測(cè)微生物濃度的對(duì)數(shù)值，線狀圖為芽孢菌在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)曲線（有延滯期的Baranyi and Roberts模型），但分離短小芽孢菌在富Cr鹽培養(yǎng)基中生長(zhǎng)一段時(shí)間后微生物數(shù)目減少。試驗(yàn)結(jié)果表明，分離短小芽孢菌在高鉻液體培養(yǎng)基中可耐受，但生長(zhǎng)狀態(tài)受到一定的影響。此外，營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)2種微生物2代后在富重金屬液體培養(yǎng)基中不耐受。有研究表明，芽孢桿菌科中某些種，如地衣芽孢桿菌具有吸附重金屬Cr的作用，可用于水體凈化[18-20]，本試驗(yàn)在不銹鋼廠廢水污泥中收集的短小芽孢桿菌可耐受高Cr鹽培養(yǎng)基，但生長(zhǎng)狀況不符合微生物生長(zhǎng)規(guī)律，此微生物開發(fā)和利用還需要進(jìn)一步的強(qiáng)化。

3 結(jié)論

目前土壤污染問題日趨嚴(yán)重，已威脅到農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全及生態(tài)安全，重金屬污染是土壤污染的一個(gè)主要方面。本試驗(yàn)從不銹鋼污染土壤中分離到2株可耐鐵和耐鉻的微生物，分別為希瓦氏菌和短小芽孢桿菌，試驗(yàn)證明2種微生物可在重金屬鹽培養(yǎng)基中耐受，具有一定的開發(fā)和利用價(jià)值。