添加GSH對氟中毒小鼠腎臟SOD和CAT活性的影響

張慧慧，李 瑞，王 婧，王曉菲，孫子龍

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山西太谷030801）

氟是一種反應(yīng)性能極高的鹵族化學(xué)元素，也是人畜生長必不可少的微量元素，主要以氟化物的形式廣泛存在于自然界中[1]。如果大量的氟被攝入機體后，則會引起氟中毒。有研究顯示，氟中毒除造成牙齒、骨骼等結(jié)構(gòu)的毒副作用外，同時還可以造成腦、肝腎、肺等軟組織的損害[2-3]。

腎臟是氟排泄的主要器官[4]，因此，氟中毒對腎臟的損害作用是多方面的。氟中毒會對腎臟組織結(jié)構(gòu)造成一定的破壞，改變腎臟組織中酶的活性與含量，對腎臟功能指標(biāo)和離子代謝也會產(chǎn)生一定影響[5]。氟中毒可引起脂質(zhì)過氧化作用增強，抗氧化酶活力受到抑制，造成腎氧化與抗氧化防御機制的失衡，誘發(fā)腎臟的過氧化損傷，也可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，引起自由基損害，改變腎酶活性，導(dǎo)致體內(nèi)鈣代謝平衡紊亂[6]。谷胱甘肽抗氧化系統(tǒng)是機體抗氧化體系的重要組成部分，主要由還原型谷胱甘肽（GSH）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、谷胱甘肽還原酶（GR）構(gòu)成，其對有害物質(zhì)引起的氧化損傷具有防御作用[7]。當(dāng)生物有機體受到過氧化物損傷時，GSH可加快對過氧化物的清除，減輕組織細(xì)胞的氧化損傷，維持機體抗氧化防御能力[8]。因此，在此基礎(chǔ)上探討添加GSH對氟中毒小鼠腎臟損傷的緩解作用。

本試驗建立NaF＋GSH模型，研究氟中毒對小鼠腎臟SOD和CAT活性的影響，以及添加GSH的緩解作用。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 本試驗所選取的動物為3周齡SPF級雄性ICR小鼠，共50只，體質(zhì)量為20～25 g，購自北京海淀興旺實驗動物養(yǎng)殖場。小鼠飼料為標(biāo)準(zhǔn)的顆粒飼料，由中國輻射防護研究院提供。

1.1.2 藥品 氟化鈉（NaF），購自天津市化學(xué)試劑三廠；谷胱甘肽（GSH），購自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3 試劑 總蛋白定量測定試劑盒（BCA法）、超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒、過氧化氫酶（CAT）檢測試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所；雙蒸水，冰醋酸。

1.1.4 主要儀器 高速勻漿儀，購自德國IKA公司；37℃恒溫水浴鍋，購自世安科興科技開發(fā)有限公司；旋渦混合器，購自海門市其林貝爾儀器制造有限公司；722s可見分光光度計，購自上海菁華科技儀器有限公司；Therm Scientific VarioskanRFlash，購自美國ThermoForma公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗動物模型的建立 氟中毒＋還原型谷胱甘肽模型：50只雄性小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機分成5組，每組10只，分籠飼養(yǎng)。對照組飲用蒸餾水，其余4組為染氟組，供給含100 mg/L NaF的純化水。飼喂30 d后，在100 mg/L NaF組隨機選取3組分成100mg/LNaF＋200mg/kgGSH組、100 mg/L NaF＋400mg/kgGSH組和100 mg/LNaF＋800 mg/kg GSH組，這3組小鼠自分組起，每日固定時間，按200，400，800 mg/kg GSH 的劑量進(jìn)行小鼠灌胃，同時飲用含100 mg/L NaF純化水，共30 d。

小鼠飼養(yǎng)期間，鼠房保持環(huán)境干凈整潔，溫度20℃左右，濕度適宜，每日按時飼喂飼料，各組小鼠自由飲水、采食。每10 d更換一次鋪墊飼料，并對鼠籠進(jìn)行充分消毒。

1.2.2 小鼠生長狀態(tài)的觀察 飼養(yǎng)期間，每日觀察并記錄各組小鼠的活動情況和精神狀態(tài)。

1.2.3 腎臟的采集 氟中毒＋還原型谷胱甘肽組小鼠飼養(yǎng)結(jié)束后，脫頸椎方式處死小鼠，摘取小鼠腎臟組織，使用高壓消毒過的試驗器械，盡可能剔除腎臟表面其他雜物。試驗組織暫時放在液氮中保存，之后放入超低溫冰箱（-80℃）長期保存。

1.2.4 小鼠腎臟總蛋白濃度、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）的測定 按照南京建成試劑盒說明書制備各項指標(biāo)的腎臟勻漿液。按說明書將腎臟組織勻漿后采用化學(xué)BCA法測定總蛋白濃度，然后采用分光光度計檢測SOD，酶標(biāo)儀檢測CAT。試驗過程中用到的各種型號槍頭、EP管等耗材及試驗儀器剪子、鑷子等均需高溫高壓、干燥處理，以減少污染。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗結(jié)果應(yīng)用Graphpad Prism5統(tǒng)計分析軟件的ANOVA方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，事后檢驗采用Newman-keuls，結(jié)果以柱狀圖表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 氟對小鼠生長狀態(tài)的影響

在飼養(yǎng)期間，對照組小鼠的食欲旺盛，飲水正常，體毛光滑，反應(yīng)敏捷。而染氟組小鼠的被毛無光澤，躁動不安，喜歡撕咬同伴背部及尾部皮毛。

2.2 氟中毒小鼠腎臟總蛋白比較分析

與對照組相比，100 mg/L NaF組總蛋白質(zhì)量濃度降低；與100 mg/L NaF組相比，添加GSH組總蛋白質(zhì)量濃度逐漸升高，但均無顯著性變化（圖1）。

2.3 氟中毒小鼠腎臟SOD活性比較分析

從圖2可以看出，與對照組相比，100 mg/L NaF組的SOD活性降低，差異顯著；與100 mg/L NaF組相比，添加GSH組的SOD活性隨著GSH含量增加而逐漸升高，400 mg/kg GSH組和800 mg/kg GSH組SOD活性升高，且差異達(dá)極顯著。

2.4 氟中毒小鼠腎臟CAT活性比較分析

從圖3可以看出，與對照組相比，100 mg/L NaF組的CAT活性降低；與100 mg/L NaF組相比，添加GSH組的CAT活性隨著GSH含量增加而呈現(xiàn)一定程度的升高，但均沒有顯著性變化。

3 討論

3.1 氟中毒對腎臟的損傷作用

氟中毒是一種慢性全身性疾病，長時間、過量的氟攝入會導(dǎo)致機體組織和臟器的損傷[9]。腎是機體的排泄器官，機體攝入的氟有50%以上經(jīng)腎臟由尿排出體外，所以，腎成為氟中毒損害的主要靶器官之一[3]。氟能妨礙許多酶的合成，抑制酶的活性。酶活性降低，自由基作用增強，導(dǎo)致機體受到損傷[10]。自由基是某些化學(xué)物質(zhì)通過熱解、光解、輻射分解金屬離子的偶聯(lián)反應(yīng)，它在體內(nèi)可損傷機體各系統(tǒng)[11]，而酶又可清除自由基。氟化物損傷機體各系統(tǒng)，引起細(xì)胞膜滲透和膜結(jié)合酶的變化，氟自由基攻擊不飽和脂肪酸共價鍵處，造成脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)生[12]。

3.2GSH與SOD和CAT活性相關(guān)性分析

GSH是機體內(nèi)重要的非酶性抗氧化物，它可以清除體內(nèi)的過氧化氫和脂質(zhì)過氧化物，阻斷活性氧自由基對機體的進(jìn)一步損傷，是生物體內(nèi)重要的活性氧自由基清除劑[13-14]，所以，添加谷胱甘肽能夠緩解氟中毒對小鼠腎臟的損傷。SOD和CAT是機體抗氧化體系的關(guān)鍵酶蛋白[15-16]。

SOD是生物抗氧化酶類的重要成員，也是一種金屬酶，其性質(zhì)不僅取決于蛋白質(zhì)部分，而且還取決于結(jié)合到活性部位的金屬離子，在機體內(nèi)普遍存在，能去除超氧化物陰離子自由基，催化超氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)檫^氧化氫[17]，從而減少脂質(zhì)過氧化作用引發(fā)劑的生成，以減弱脂質(zhì)過氧化作用，清除并維持氧自由基的平衡[18]，防止生物體的損傷，因此，其被稱為生物體抗氧化系統(tǒng)的第一道防線。本研究表明，SOD在氟攝入后活性降低，添加GSH后其活性逐漸升高，并呈顯著性變化。證明了添加GSH后對氟中毒小鼠腎臟損傷有緩解作用。

CAT是一類能夠催化氧化還原反應(yīng)的氧化還原酶，也是機體抗氧化酶體系的一個重要組成部分，它可以將代謝過程以及歧化反應(yīng)所產(chǎn)生的副產(chǎn)品過氧化氫轉(zhuǎn)變?yōu)檠鹾退甗19]，清除體內(nèi)的過氧化氫，從而使細(xì)胞免于遭受過氧化氫的毒害[20]，減輕氧化損傷，是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一[21]。本試驗結(jié)果顯示，CAT在氟攝入后活性降低，添加GSH后活性升高，但沒有顯著性變化，可能是受到劑量、試驗動物和作用時間等因素的影響。因此，試驗證明SOD和CAT均具有解毒作用，添加GSH后可以緩解氟中毒小鼠腎臟的損傷。

4 結(jié)論

本試驗研究表明，氟中毒對腎功能造成了一定的損傷，攝入氟之后SOD和CAT活性降低，添加GSH后活性都有所升高，說明添加GSH后確實能夠緩解氟中毒對小鼠腎臟的損傷作用。