槲皮素分子印跡聚合物合成及識別研究

豆鵬飛

(長慶油田公司，陜西 榆林 718100)

槲皮素（Quercetin）其學(xué)名為3,3,4,5,7-五羥基黃酮是一類天然具有多種活性的黃酮類化合物[1]。槲皮素分子含有羥基，具備了與功能單體形成氫鍵的條件，但分子中含有5個羥基，造成了它的極性大而不溶于非極性或弱極性溶劑。槲皮素廣泛存在于水果、蔬菜、核桃、茶、和多種天然活性產(chǎn)物中，具有抗氧化、抗病毒、抗腫瘤和調(diào)節(jié)免疫等多種功能。因其有極高的藥用價值，國內(nèi)外的學(xué)者都對槲皮素的藥理進行了研究。

雖然槲皮素的來源廣泛，但是如何獲得純度較高的槲皮素提取方法還沒有一個標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)行的提取方法中還存在一些技術(shù)上的缺陷，分離成本高，選擇性分離效率低，在提取的過程中往往還將槲皮素的類似物一并提取出來。解決這些問題的根本就是研究出新的提取分離方法，解決了核心問題也將使得槲皮素的價值能夠充分發(fā)揮出來。因此，近年來，許多學(xué)者開始探索利用分子印跡技術(shù)制備槲皮素的分子印跡聚合物并將其制作成分離提取材料。

天然植物中往往存有很多活性物質(zhì)以及他們的類似化合物，從天然植物中提取分離一種物質(zhì)時常常會伴隨著類似化合物被提取出來的情況[3]。如本實驗中從油茶殼中提取槲皮素時往往會伴有蘆丁，異鼠李素等類似物。所以本課題以槲皮素為模板分子，應(yīng)用分子印跡技術(shù)制備槲皮素分子印跡聚合物。探討最佳的制備方法以獲得具有選擇識別能力的槲皮素分子印跡聚合物。這將更高效地選擇性提取分離油茶殼中的槲皮素，同時對提取分離其他活性物質(zhì)提供了一個參考，對今后高效選擇性地提取分離更多活性組分提供一種新的途徑。

1 實驗內(nèi)容

1.1 儀器

主要實驗設(shè)備見表1。

1.2 試劑

主要實驗試劑見表2。

1.3 槲皮素MIPs和非印跡聚合物（NIPs）的制備

在100 mL錐形瓶中加入0.5 mmol槲皮素和5.0 mL甲醇超聲溶解，再加入適量AM或4-VP和一定量的乙腈，充分振蕩后，于室溫下靜置12 h, 然后加入8.0 mmol交聯(lián)劑TRIM和0.02 g引發(fā)劑AIBN，超聲振蕩脫氣5 min，并通氮氣15 min，密封后置于80℃水浴中，聚合反應(yīng)12 h。聚合產(chǎn)物緩慢冷卻至室溫，抽濾分離得到聚合物沉淀。用200 mL甲醇/乙酸(V:V=9:1)混合溶液索氏提取，除去聚合物中的模板分子及未反應(yīng)的單體，提取完畢后用超純水水洗，直至pH為7.0為止。于80℃真空干燥箱中干燥24 h，得到 MIPs。

表1 主要實驗設(shè)備

表2 主要實驗試劑

非印跡聚合物(NIPs)制備方法與MIPs制備方法相同，只是在反應(yīng)體系中不加入模板分子槲皮素。得到一系列的MIPs和NIPs用于后備實驗。

1.4 槲皮素MIPs和NIPs性能測試

1.4.1 槲皮素MIPs和NIPs吸附容量實驗

（1）吸附動力學(xué)曲線的制作

分別稱取0.10 g制備的MIPs和NIPs置于100 mL磨口錐形瓶中，加入10 mL 0.2 mg槲皮素甲醇溶液，于室溫下25℃恒溫振蕩吸附不同時間，離心分離后取上清液，用高效液相色譜儀測定上清液中槲皮素的濃度，根據(jù)吸附前后溶液濃度的變化，計算出MIPs和NIPs的吸附量。

（2）靜態(tài)吸附等溫線的制作

分別稱取一組等量的MIPs和NIPs 50 mg，置于10 mL 的離心管中，依次加入 0.02～1.0 mmol/L 的槲皮素甲醇溶液 5.0 mL，置于恒溫震蕩器中保持25℃振蕩 12 h，根據(jù)吸附前后的濃度變化計算出單位質(zhì)量聚合物的結(jié)合量，從而得出MIPs和NIPs對槲皮素的吸附等溫線。

1.4.2 槲皮素MIPs和NIPs吸附選擇性實驗

分別稱取一組等量的MIPs和NIPs 0.10 g放入100 mL錐形瓶中，加入10 mL 0.2 mg槲皮素和蘆丁的甲醇混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，于25℃室溫下恒溫振蕩12 h，然后將此混合物轉(zhuǎn)入離心機中，在12 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心10 min。測定槲皮素和蘆丁的平衡濃度，根據(jù)吸附前后溶液濃度的變化計算MIPs對底物的結(jié)合量。

1.5 用高效液相色譜對槲皮素的定量測定實驗

用Agilent 1100 高效液相色譜儀分離分析經(jīng)固相萃取后上樣液，淋洗液和洗脫液中的槲皮素及其類似物。液相條件為，色譜柱：Hypersil C18柱(5 μm,4.6 mm×250 mm)；流動相A:乙腈，B:質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的磷酸水溶液；梯度洗脫條件:0～4 min，20%A；4～10 min，20%A→60%A；柱 溫 :25℃，流速 :1.0 mL/min，進樣量 ：20 μL，檢測波長 :280 nm、360 nm雙波長檢測。

1.6 槲皮素MIPs的固相萃取實驗

1.6.1 槲皮素MIPs固相萃取柱的制備

采用濕法裝柱，稱取槲皮素MIPs 0.3 g，加入5.0 mL甲醇制成漿液，裝入容量為5.0 mL、直徑為8.0 mm的聚丙烯固相萃取空柱中，裝填均勻后再用10 mL甲醇沖洗。

1.6.2 槲皮素MIPs固相萃取柱的選擇性實驗

配置濃度為0.2 mg的槲皮素蘆丁混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，移取1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液置于固相萃取柱中，上樣液收集完后，用一定體積甲醇溶液洗脫，收集淋洗液；最后用一定體積的甲醇/乙酸(V:V=9:1)的溶液洗脫固相萃取柱，并收集洗脫液。上樣液、淋洗液和洗脫液分別用氮吹儀濃縮至干，用甲醇定容至1.0 mL，以備測定。

1.7 槲皮素MIPs的再生識別能力測試

用槲皮素MIPs吸附劑制備的固相萃取柱重復(fù)固相萃取實驗，將上樣液、淋液、洗脫液收集后用高效液相色譜測定其峰面積計算槲皮素的回收率。

1.8 槲皮素MIPs對油茶殼提取樣品的應(yīng)用實驗

將油茶殼提取物蒸干后用甲醇定容至10.0 mL，移取1.0 mL于固相萃取柱中，上樣液收集完后，用一定體積甲醇溶液洗脫，收集淋洗液；最后用一定體積的甲醇/乙酸(V:V=9:1)的溶液洗脫固相萃取柱，并收集洗脫液。上樣液、淋洗液和洗脫液分別用氮吹儀濃縮至干，用甲醇定容至1.0 mL，以備測定。

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 槲皮素MIPs制備方法的比較

分別采用本體聚合法和沉淀聚合法制得槲皮素MIPs，測定其最大吸附容量及結(jié)合槲皮素和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品測得其分離因子如表3所示。取沉淀聚合法制得的槲皮素MIPs做吸附動力學(xué)曲線如圖1所示。

表3 不同制備方法制得的槲皮素MIPs比較

圖1 沉淀聚合合成MIPs的吸附動力學(xué)曲線

考察沉淀聚合法和傳統(tǒng)本體聚合法對槲皮素分子的吸附容量和選擇性。目前大部分槲皮素印跡聚合物采用本體聚合法制備[4]，采用此聚合方式普遍存在的問題是：MIPs吸附容量低、印跡分子識別速率慢和選擇性不高等等。采用本體聚合制備槲皮素分子印跡聚合物，如表3所示其最大吸附容量為1.60 μmol/g，吸附9 h后才基本達到吸附平衡，他們以槲皮素和蘆丁進行結(jié)合實驗，得到其分離因子α為1.84；而采用本方法得到槲皮素最大吸附容量為6.93 μmol/g，是其吸附容量的3.08倍；其分離因子α為4.33，并且在120 min內(nèi)即能達到吸附平衡；其吸附動力學(xué)曲線由圖1所示，可以看出：MIPs在前10 min的吸附速率很快，吸附量已經(jīng)占到總吸附量的82.3%。吸附平衡在60 min左右即能達到吸附飽和。與傳統(tǒng)本體聚合法相比，沉淀聚合合成的MIPs對模板分子的吸附速率要快得多，這可能是因為：MIPs較快的吸附速率與聚合物顆粒的粒徑較小有關(guān)，由于沉淀聚合得到的MIPs顆粒粒徑小，模板分子傳輸?shù)組IPs上的傳質(zhì)阻力大大減小，因而識別空穴的時間要短，而表觀的總吸附速率也要快得多。

2.2 槲皮素MIPs功能單體的選擇

2.2.1 功能單體種類對槲皮素MIPs吸附效果的影響

采用沉淀聚合法分別用AM，4-VP，AM/4-VP做功能單體制備槲皮素MIPs，將制得的槲皮素MIPs作為吸附劑用槲皮素蘆丁混合標(biāo)準(zhǔn)液做固相萃取實驗得出其回收率如表4所示。不同功能單體混合比例制備槲皮素MIPs固相萃取實驗回收率如表5所示。不同功能單體制備槲皮素MIPs的吸附量對比結(jié)果如圖2所示。

表4 槲皮素和蘆丁的回收率(n=3)

表5 不同比例混和功能單體的回收率

一般來說，印跡酸性的模板分子，適合選用堿性功能單體；印跡堿性的模板分子，則適合選用酸性功能單體。由于槲皮素分子含有多個酚羥基，具有一定的酸性，從理論而言，選擇堿性的功能單體會有利于模板分子和功能單體形成穩(wěn)定的主客體復(fù)合物。本實驗采用堿性的AM和4-VP做功能單體，考察這兩種功能單體對模板分子及其類似物的吸附性和選擇性的影響。其結(jié)果表明：采用4-VP為功能單體，對模板分子識別效果較AM更強、選擇性也更高；其用作固相萃取吸附劑對模板分子槲皮素及其類似物的保留能力也更強，導(dǎo)致難于洗脫。如表3所示，用4-VP做功能單體的吸附劑對槲皮素的回收率僅為61.7%，遠小于用AM做功能單體的回收率，達到103.3%；而對類似物蘆丁的回則收率遠低于AM。究其原因，可能是4-VP和槲皮素之間除了氫鍵、離子間作用力外，吡啶環(huán)的疏水效應(yīng)和模板分子槲皮素及其類似物間也有相互作用，這幾種作用使得4-VP對槲皮素分子的保留強于AM。而采用AM和4-VP混合功能單體對模板分子的選擇性和吸附量較高，其固相萃取回收率和特異性選擇性明顯高于商品化的C18固相萃取柱。

圖2 不同功能單體合成聚合物的吸附量

圖2比較了分別用AM，4-VP，AM/4-VP做功能單體時聚合物的吸附量，發(fā)現(xiàn)使用混和功能單體獲得的吸附容量最大，達到其吸附容量6.0 μmol/g；這可能是因為AM和4-VP都屬于堿性功能單體，它們之間具有協(xié)同作用，不容易產(chǎn)生自身締合，從而和槲皮素分子能夠較好的形成復(fù)合物，并在MIPs中產(chǎn)生更多的、具有特異選擇性的活性印跡位點。實驗中發(fā)現(xiàn)當(dāng)AM的比例較大時，經(jīng)過固相萃取后模板分子槲皮素的回收率較低，歸因于用AM作功能單體時對模板分子的保留弱；而當(dāng)4-VP的比例較大時，經(jīng)固相萃取后模板分子槲皮素的回收率相比AM來說也較低，這是因為用4-VP作功能單體對模板分子的保留太強、難于洗脫所導(dǎo)致的。因此，根據(jù)表4和表5的實驗結(jié)果，合成MIPs時選擇1:1比例下的AM和4-VP為1:1的混和功能單體。

2.2.2 功能單體（AM）濃度對槲皮素MIPs的影響

通過固定槲皮素的濃度(0.02 mg)，改變AM的濃度 (從 a～h 分別為：0；0.005；0.01；0.02；0.04；0.05；0.1；0.25 mg)而測得槲皮素分子和功能單體AM預(yù)聚合后的紫外光譜圖如圖3所示。

圖3 不同AM濃度溶液的紫外吸收光譜圖

由圖可知：隨著AM的濃度增大，預(yù)聚合后溶液的吸光度也逐漸增大，并且最大吸收波長發(fā)生紅移，說明AM與槲皮素分子發(fā)生了作用。這可能是由于AM是堿性的功能單體，而槲皮素是多酚類的酸性化合物，含有較多的羥基，它們之間具有離子間作用；另外由于它們之間形成的氫鍵也使得相互之間發(fā)生作用，形成復(fù)合物。并且由于N原子上的富余電子對槲皮素芳香環(huán)的供電子基效應(yīng)，使得AM最大吸收波長發(fā)生紅移。

2.3 致孔劑的用量對吸附效果的影響

由圖4對比不同體積得到MIPs的吸附量，發(fā)現(xiàn)當(dāng)乙腈用量為40 mL時，吸附量可以達到較高的水平，因此在聚合反應(yīng)過程中致孔劑乙腈的加入量為40 mL。其原因可能是隨著致孔劑量的減少，反應(yīng)體系(包括溶劑、單體和其他溶解組分)中的連續(xù)相對聚合物鏈的溶解度增強、聚合物臨界鏈長增加，導(dǎo)致核聚集而成的聚合物粒子數(shù)目下降，因而聚合后粒子的粒徑減小。

2.4 槲皮素MIPs和NIPs性能測試結(jié)果

2.4.1 槲皮素MIPs和NIPs的靜態(tài)吸附實驗及Freumdlich分析

在濃度范圍為0.02～1.0 mmol /L的槲皮素甲醇溶液中，加入等量的MIPs和NIPs做吸附試驗，根據(jù)吸附前后的濃度變化計算出單位質(zhì)量聚合物的結(jié)合量，從而得出MIPs和NIPs對槲皮素的吸附等溫線如圖5所示。

圖4 不同溶劑體積合成聚合物的吸附容量

圖5 槲皮素在MIPs 和 NIPs 上靜態(tài)吸附等溫曲線

由圖5中的曲線可知，隨著槲皮素濃度的增大，單位質(zhì)量MIPs的吸附量也增大，而NIPs在槲皮素初始濃度大于0. 4 mmol /L 時的吸附量已趨于飽和，并且在相同初始濃度下單位質(zhì)量MIPs 的吸附量遠大于在單位質(zhì)量 NIP s的吸附量，證明了這種沉淀聚合得到的MIPs對槲皮素具有很好的吸附效果效果。這說明在印跡過程中，模板分子在MIPs中選擇性鍵合產(chǎn)生的印跡孔穴及孔穴上的活性結(jié)合位點，決定了MIPs對模板分子的高度親合力和特異識別性遠大于非選擇性鍵合作用。

在分子印跡的研究中，常用Freumdlich模型來印跡聚合物的吸附能力強弱，評價分子印跡聚合物的結(jié)合特性，F(xiàn)reumdlich模型方程式lgQ= lgα+mlgC。

式中：Q—單位質(zhì)量聚合吸附分析物的量，μmol/g；

C—分析物在溶液中平衡時的濃度，μmol/mL；

α和m是Freumdlich方程的兩個常數(shù)[40]。其中m表示吸附能力的強弱，當(dāng)m的值在0～1的范圍內(nèi)，說明吸附比較容易進行。

經(jīng)Freumdlich模型擬合的結(jié)果如圖9所示：MIPs對槲皮素的吸附方程為：lgQ= 0.943 23+0.829 92 lgC，R=0.9986；而NIPs對槲皮素的吸附方程為：lgQ= 0.731 19+0.675 89 lgC，R=0.98 87；由α值可知MIPs比NIPs具有更大的吸附容量，而由m值可以明顯得出MIPs的同質(zhì)的吸附位點的相比NIPs更多。這可能是由于功能單體和模板分子之間存在多種相互作用，使得制備的MIPs對模板分子的特異性吸附更強所導(dǎo)致的。

圖6 槲皮素在MIPs和NIPs吸附的Freumdlich模型曲線

2.4.2 槲皮素MIPs和NIPs的吸附選擇性實驗結(jié)果

在底物濃度為2.0 mmol/L時，用槲皮素和蘆丁混合標(biāo)準(zhǔn)液測定MIPs和NIPs的結(jié)合分離系數(shù)KD(見表6)。

表6 MIPs和NIPs對槲皮素和蘆丁的分離系數(shù)KD和選擇性識別因子α

由表6可知MIPs對槲皮素和蘆丁分別為95.24 mL/g和26.63 mL/g，分離因子=3.53；而NIPs的KD分別為26.63 mL/g和24.43 mL/g，分離因子α=1.10。說明MIPs對槲皮素具有較好的選擇性，其因為MIPs的模板分子為槲皮素，能夠識別槲皮素并對其有選擇性地保留，而對蘆丁沒有特別的選擇性。

2.5 槲皮素MIPs在固相萃取中的應(yīng)用結(jié)果

2.5.1 固相萃取條件優(yōu)化

（1）淋洗條件的優(yōu)化

當(dāng)采用含槲皮素的甲醇溶液為上樣溶液時，由于MIPs和NIPs都存在著非選擇性吸附，所以為了消除非選擇性吸附，選擇合適的淋洗液尤為重要。本實驗采用甲醇作淋洗劑，考察了不同體積甲醇淋洗劑對槲皮素類似物蘆丁的除去效果，發(fā)現(xiàn)用較少體積的甲醇淋洗時，對蘆丁的去除效果較差，這說明淋洗劑量少時，不足以破壞槲皮素及其類似物蘆丁與聚合物間的疏水環(huán)境；而用較大體積的甲醇淋洗時，雖然對蘆丁的去除效果較好，但是也會將大量的槲皮素分子除去，如圖7所示；發(fā)現(xiàn)用2.0 mL甲醇淋洗時，既能使模板分子槲皮素的回收率保持在較高水平，又能把蘆丁盡可能地去除。

圖7 淋洗劑體積對槲皮素蘆丁回收率的影響

(2)洗脫條件的優(yōu)化

使用甲醇乙酸的混合溶液作為洗脫劑，由圖8可以看出，當(dāng)乙酸的比例小于15%時，對槲皮素的回收率較低，這可能是因為乙酸比例較小時，洗脫劑還不足于克服槲皮素與聚合物特異性吸附作用力，而當(dāng)乙酸的比例增加至20%時，發(fā)現(xiàn)槲皮素的回收率能達到較高的水平，說明此比例下的洗脫劑能夠克服模板分子和吸附劑之間的特異性吸附作用，因而能使槲皮素有較高的回收率，而蘆丁的回收率較低的原因是前面已用淋洗劑甲醇充分淋洗，去除了大部分因非特異性吸附而保留的蘆丁。

綜上所述：選用2.0 mL甲醇作淋洗劑，20%的乙酸甲醇溶液作洗脫劑，可使槲皮素的回收率保持在較高的水平，同時去除蘆丁的效果也較好，使得MIPs的選擇性盡可能高。

圖8 乙酸比例對槲皮素蘆丁回收率影響

2.5.2 槲皮素MIPs固相萃取柱的選擇性實驗結(jié)果

由槲皮素MIPs用作固相萃取吸附劑對槲皮素和蘆丁的SPE色譜圖，由圖9可以發(fā)現(xiàn)：上樣液和淋洗液中只有蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的峰，沒有出現(xiàn)槲皮素的峰，說明槲皮素被槲皮素MIPs吸附劑選擇性地保留，洗脫液中只有槲皮素的峰沒有出現(xiàn)蘆丁的峰，說明蘆丁在淋洗過程中已基本被淋洗完，槲皮素和蘆丁被分離開來。說明槲皮素MIPs吸附劑的確對槲皮素分子具有較好的選擇性和保留效果。

圖9 槲皮素蘆丁混合標(biāo)準(zhǔn)溶液SPE色譜圖

2.6 槲皮素MIPs的再生識別能力結(jié)果

為了考察槲皮素MIPs的再生識別能力，使用槲皮素MIPs作為吸附劑制作的固相萃取柱重復(fù)固相萃取實驗，并計算得出其回收率對比如圖10所示。

作為分離材料的MIPs，具備良好的再生識別能力是非常重要的，實驗對槲皮素MIPs的穩(wěn)定性和潛在的再生識別能力作了考察，圖10為槲皮素MIPs作為固相萃取吸附劑重復(fù)使用的結(jié)果。由圖可知：重復(fù)使用10次后吸附容量雖然有所降低，但是仍然能保持在較高的水平，回收率達到50% 以上，這說明重復(fù)使用對MIPs的吸附能力沒有非常明顯的影響。再生后吸附量下降，這可能是因為：一方面重復(fù)使用過程中MIPs的部分吸附位點遭到了破壞；另一方面再生的過程中部分強保留的物質(zhì)沒有被完全洗脫下來，這兩方面導(dǎo)致了吸附容量的下降。

圖10 槲皮素MIPs的再生識別性能

2.7 槲皮素MIPs在油茶殼實際樣品中的應(yīng)用結(jié)果

對實際油茶殼樣品的固相萃取效果如圖11所示，對比固相萃取前后的色譜圖發(fā)現(xiàn)經(jīng)過固相萃取后不僅能將雜質(zhì)組分大量的除去。經(jīng)過測定，用MIPs固相萃取處理后的油茶殼提取液中槲皮素的含量能達到83%，說明了槲皮素分子印跡固相萃取對實際油茶殼樣品中槲皮素具有較好的選擇性提取分離、純化效果。

圖11 實際油茶殼提取液樣品SPE色譜圖

3 結(jié)論

（1）通過對比沉淀聚合法與傳統(tǒng)本體聚合法的最大吸附容量和分離因子，沉淀聚合的最大吸附容量達到6.93 μmol/g，分離因子α為4.33，均優(yōu)于本體聚合。

（2）分別以AM，4-VP，AM和4-VP混合功能單體成功制備了槲皮素分子印跡聚合物，考察它們的形貌，發(fā)現(xiàn)，當(dāng)致孔劑乙腈的體積為40 mL時能得到粒徑均一、分散性好的MIPs。

（3）采用AM和4-V混和功能單體制備的MIPs作為固相萃取吸附劑，具有更好的選擇性和更高的回收率。

（4）最終得到制備槲皮素MIP的最優(yōu)方法為：以槲皮素為模板分子，40 mL乙腈為致孔劑、1:1AM/4-VP混合功能采用沉淀聚合法制備。

（5）對比MIPs和NIPs的靜態(tài)吸附量和吸附選擇性能，說明MIPs具有比NIPs更好的吸附能力和選擇性。

（6）從多次重復(fù)實驗結(jié)果中可以得出槲皮素MIPs具有良好的再生識別能力。

（7）使用槲皮素MIP作為固相萃取吸附劑材料在固相萃取實驗中表現(xiàn)良好。

（8）對實際油茶殼樣品中的槲皮素進行了分離純化實驗，證明了這種印跡聚合物用于選擇性分離油茶殼提取液中的槲皮素具有較好的效果，為復(fù)雜天然產(chǎn)物中黃酮類物質(zhì)的選擇性富集及分析檢測提供了一條新的途徑。