建立測(cè)定槲皮素及其甲基化產(chǎn)物的高效液相色譜-質(zhì)譜法

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院（100038）李素云 吉琳琳

軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院環(huán)境醫(yī)學(xué)與作業(yè)醫(yī)學(xué)研究所（300050）李素云 高蔚娜 郭長(zhǎng)江

軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所（100850）李崢 張振清

槲皮素及其糖苷衍生物是一類(lèi)廣泛存在于植物性藥物和食物中的黃酮化合物之一[1]，普遍存在于水果、蔬菜、茶葉及中草藥中，是黃酮家族中重要的成員，具有多樣的生物學(xué)效應(yīng)，如抗氧化、抗炎癥反應(yīng)、抗肥胖、抗生物膜及抗腫瘤等活性[2]。槲皮素及其糖苷衍生物在腸道吸收過(guò)程中即發(fā)生廣泛的代謝，門(mén)靜脈中幾乎檢測(cè)不到原形的存在，其中甲基化反應(yīng)是其最基本的代謝形式，進(jìn)一步的葡糖糖醛酸化和/或硫酸化使其代謝產(chǎn)物眾多、數(shù)量極少、難于定性和定量[3]，且由于槲皮素在自然環(huán)境下極不穩(wěn)定，易被氧化，因此，槲皮素及其代謝產(chǎn)物的分析成為槲皮素及其糖苷衍生物研究中的難點(diǎn)之一。目前，槲皮素及其糖苷衍生物和相關(guān)代謝產(chǎn)物主要采用HPLC、HPLC-MS/MS等分析方法，但樣品處理方法復(fù)雜，對(duì)槲皮素及其代謝產(chǎn)物的影響不易評(píng)估。筆者參考國(guó)內(nèi)外有關(guān)文獻(xiàn)，建立了HPLC-MS檢測(cè)法，可同時(shí)測(cè)定槲皮素及其甲基化代謝產(chǎn)物異鼠李亭和檉柳黃素，并初步應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)條件下的樣品測(cè)定，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（SANYO，日本）；倒置電子顯微鏡（Olympus，日本）；萬(wàn)分之一電子天平（BS 110S），北京賽多利斯天平有限公司；Agilent 1100 LC/MSD SL 型液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent，美國(guó))；Milli-Q Gradient A10超純水器(Millipore Inc.美國(guó))。

丁螺環(huán)酮(buspirone，內(nèi)標(biāo)，批號(hào)0803021，純度99.9%)北京華素制藥股份有限公司提供；槲皮素（quercetin）、異鼠李亭（isorhamnetin）；檉柳黃素（tamarixetin）、L-谷氨酰胺、胰蛋白酶（美國(guó)Sigma公司）；色譜純甲醇（美國(guó)Fisher公司）；DMEM 培養(yǎng)基（美國(guó)Gibico公司）；胎牛血清、非必需氨基酸（美國(guó)Hyclone公司）；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

附圖1 槲皮素及其甲基代謝產(chǎn)物異鼠李亭和檉柳黃素的HPLC-MS標(biāo)準(zhǔn)色譜圖

附圖2 槲皮素在Caco-2細(xì)胞單層上A→B跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)中B側(cè)溶液中HPLC-MS檢測(cè)色譜圖

1.2 高效液相色譜-質(zhì)譜（HPLC-MS）分析

1.2.1 色譜條件：選擇Agilent-C18色譜柱(2.1mm×100mm，3.5μm)；柱溫為室溫；流動(dòng)相為甲醇∶乙腈（1∶1），含0.1%甲酸；流速為0.2ml/min，進(jìn)樣量為20μl。

1.2.2 質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，霧化氣壓力30psi，干燥氣流速8L/min，干燥氣溫度35℃，毛細(xì)管壓力為3000V，四極桿溫度99℃，增益為1，峰寬為0.10min，正離子模式，采用選擇離子監(jiān)測(cè)（SIM）。槲皮素、異鼠李亭和檉柳黃素的m/z分別為303、317和317，丁螺環(huán)酮（內(nèi)標(biāo)）為386.2。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制：精確稱取槲皮素、異鼠李亭和檉柳黃素標(biāo)準(zhǔn)品，溶劑為DMSO，配制濃度為3.0mg/ml的母液，取等量槲皮素、異鼠李亭和檉柳黃素母液混合，漩渦震蕩使充分混勻，再配制成濃度為1.0mg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-80℃?zhèn)溆谩?/p>

混合標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液配制：用采樣器精確吸取混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用磷酸緩沖液（PBS溶液）配制成2.0、4.0、10.0、20.0、40.0、100、200、400、1000、2000、4000μg/L，作為混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。同時(shí)用PBS溶液配制濃度為18μg/L的槲皮素溶液，作為細(xì)胞孵育液備用。

內(nèi)標(biāo)溶液的配制：精確稱取丁螺環(huán)酮5mg，用乙腈配制成1.0μg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用流動(dòng)相稀釋為20μg/L，作為標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液備用。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精確量取上述各濃度混合標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液和內(nèi)標(biāo)丁螺環(huán)酮標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液各200μl，漩渦振蕩30s使充分混合，3000r/min離心3min，取上清液，20μl進(jìn)樣，LC/MS測(cè)定。以各標(biāo)準(zhǔn)物濃度為橫坐標(biāo)，各標(biāo)準(zhǔn)物與內(nèi)標(biāo)丁螺環(huán)酮的峰高比值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 細(xì)胞培養(yǎng)條件和方法Caco-2細(xì)胞株購(gòu)自ATCC，代數(shù)在40～50代之間，采用DMEM高糖培養(yǎng)基（10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1%L-谷氨酰胺及青霉素-鏈霉素雙抗液）、置于37℃、5%CO2、90%相對(duì)濕度下培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)樣品制備與測(cè)定 實(shí)驗(yàn)前以37℃PBS液（pH7.2）浸泡接種在12孔Millicell板上的細(xì)胞15min，輕微沖洗除去細(xì)胞表面附著物。在頂側(cè)（A）加入濃度為18μg/L的槲皮素溶液600μl，基底側(cè)（B）加入空白PBS液（pH7.2）1200μl，n=3，放入37℃、5%CO2、90%相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中孵育150min，于B側(cè)采樣50μl，精確加入等量?jī)?nèi)標(biāo)溶液并充分混勻，20μl直接進(jìn)樣測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)譜圖 通過(guò)優(yōu)化條件，槲皮素、異鼠李亭、檉柳黃素的保留時(shí)間tR分別為2.976min、5.063min、10.951min，丁螺環(huán)酮保留時(shí)間tR為1.585min，細(xì)胞孵育液中實(shí)測(cè)樣品各化合物保留時(shí)間稍有變化，見(jiàn)附圖1。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 槲皮素、異鼠李亭、檉柳黃素在1.0～1000μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程依次為：Y=0.0209891X+0.002801，r=0.99996；Y=0.0153413X-0.0005867，r=0.99955；Y=0.0175301X-0.0004946，r=0.99983。

附表 槲皮素孵育150min B側(cè)槲皮素、異鼠李亭和檉柳黃素的測(cè)定(n=3)

2.3 最低檢測(cè)限 槲皮素、異鼠李亭、檉柳黃素最低檢測(cè)限均為1.0μg/L。

2.4 細(xì)胞培養(yǎng)樣品 由附表可知，在目標(biāo)峰保留時(shí)間左右，細(xì)胞孵育液中無(wú)雜質(zhì)峰干擾樣品測(cè)定。細(xì)胞孵育液測(cè)定結(jié)果表明，槲皮素在A→B跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)中，在Caco-2細(xì)胞單層基底側(cè)（B），可以檢測(cè)到槲皮素原形。同時(shí)B側(cè)溶液中可以檢測(cè)到槲皮素的甲基化代謝產(chǎn)物異鼠李亭和檉柳黃素。其中，3'-OH位置甲基化產(chǎn)物異鼠李亭約是4'-OH位置甲基化產(chǎn)物檉柳黃素的2倍左右。

3 討論

槲皮素、異鼠李亭和檉柳黃素的HPLC和HPLC-MS/MS測(cè)定方法已有報(bào)道，在同一溶液體系中同時(shí)測(cè)定槲皮苷、槲皮素、異鼠李亭和檉柳黃素的HPLC-MS方法也有報(bào)道[4]。但由于槲皮素為脂溶性，槲皮苷為水溶性，實(shí)現(xiàn)同一體系中同時(shí)測(cè)定二者的同時(shí)，也會(huì)損失槲皮素的測(cè)定精度。文獻(xiàn)報(bào)道，槲皮素在腸道吸收和代謝過(guò)程中會(huì)發(fā)生脫糖基和進(jìn)一步的代謝反應(yīng)，如甲基化、硫酸化、葡萄糖醛酸化等反應(yīng)。但由于槲皮素在體外環(huán)境中不穩(wěn)定，在有氧條件下極易發(fā)生氧化等反應(yīng)[5]，因此，實(shí)驗(yàn)樣品在檢測(cè)前的處理方法會(huì)對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生很大的影響。以往文獻(xiàn)中測(cè)定槲皮素及其甲基代謝產(chǎn)物一般采用結(jié)構(gòu)相似的類(lèi)黃酮物質(zhì)做內(nèi)標(biāo)[6]，但類(lèi)黃酮物質(zhì)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，體外環(huán)境下易氧化降解，因此，選擇一個(gè)穩(wěn)定的內(nèi)標(biāo)對(duì)考察槲皮素及其代謝產(chǎn)物的含量很重要。丁螺環(huán)酮在常溫下穩(wěn)定，室溫下放置72小時(shí)、4℃放置1周，測(cè)定值的標(biāo)準(zhǔn)偏差均不超過(guò)5%，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[7]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用丁螺環(huán)酮做內(nèi)標(biāo)，解決了同類(lèi)物質(zhì)不穩(wěn)定對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，在此基礎(chǔ)上建立了可以同時(shí)測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)體系中上述3種化合物的HPLC-MS定量檢測(cè)方法。

本研究選擇Agilent-C18色譜柱（2.1mm×100mm，3.5μm），并考察了不同流動(dòng)相體系對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在甲醇-水（0.1%甲酸）、乙腈-水（0.1%甲酸）、甲醇+乙腈（1∶1）[8]等流動(dòng)相體系中，三種化合物和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)均分離良好，但在甲醇+乙腈（1∶1）流動(dòng)相體系中干擾較小，ESI離子化效果較好，因此流動(dòng)相選擇甲醇+乙腈（1∶1）。

本研究發(fā)現(xiàn)，異鼠李亭和檉柳黃素在正、負(fù)離子監(jiān)測(cè)模式下離子化效率均佳，槲皮素和丁螺環(huán)酮在正離子檢測(cè)模式下離子化效率優(yōu)于負(fù)離子檢測(cè)，因此選擇正離子檢測(cè)。在ESI(+)離子化方式下，槲皮素、異鼠李亭、檉柳黃素生成的[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰分別為m/z303、m/z317和m/z317，丁螺環(huán)酮為386.2。

在以往的研究中，樣品處理大多選用提取、揮干、復(fù)溶或酶解等方式，以達(dá)到提高待測(cè)樣品濃度的目的。但由于槲皮素及其代謝化產(chǎn)物物特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)，在體外環(huán)境下極不穩(wěn)定，給樣品處理造成極大困難，同時(shí)由于槲皮素的大部分代謝產(chǎn)物均沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)品，且含量甚微，因此樣品處理過(guò)程對(duì)研究結(jié)果的影響很大。

本方法采用細(xì)胞培養(yǎng)液經(jīng)一倍稀釋直接進(jìn)樣測(cè)定，不僅使樣品處理更簡(jiǎn)單易行，同時(shí)也減少了樣品處理過(guò)程對(duì)測(cè)定結(jié)果可能產(chǎn)生的不利影響。從本研究的實(shí)驗(yàn)樣品測(cè)定結(jié)果分析，槲皮素可以完整分子形式透過(guò)Caco-2 細(xì)胞單層，同時(shí)在跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中會(huì)發(fā)生進(jìn)一步的代謝轉(zhuǎn)化，其中，3′-OH 位置的甲基化反應(yīng)較4′-OH位置更廣泛[9]。

綜上所述，本研究建立的同時(shí)測(cè)定細(xì)胞孵育體系中槲皮素及異鼠李亭和檉柳黃素的HPLC/MS測(cè)定方法，靈敏度高，樣品處理方法簡(jiǎn)單，解決了因常規(guī)樣品處理過(guò)程耗時(shí)、復(fù)雜以及對(duì)不穩(wěn)定化合物測(cè)定結(jié)果的影響，且與高效液相色譜比較，大大提高了檢測(cè)的靈敏度。