低氧環(huán)境下SDF-1對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞遷移影響的初探

姜楊 ，李永濤 ，徐桂清 ，郭林娜 ，張彧婷 ，沈雷 ，姚立杰 ，王玉

1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161006；3.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室，黑龍江齊齊哈爾 161006

肌腱損傷是常見的運(yùn)動(dòng)性損傷，疾病多見于大量運(yùn)動(dòng)和年齡老化人群，主要表現(xiàn)為肌腱斷裂、腫脹、運(yùn)動(dòng)受限，嚴(yán)重影響患者的身體健康。據(jù)報(bào)導(dǎo)，全球每年大約有3 000萬肌腱損傷患者，由于肌腱組織缺少血液和細(xì)胞，再生修復(fù)能力較弱，很多患者存在嚴(yán)重后遺癥。肌腱治療方法主要是自體肌腱移植、異體肌腱移植、外科手術(shù)治療，但存在異體排斥反應(yīng)、移植后再次斷裂等不良反應(yīng)。目前利用干細(xì)胞組織工程移植到損傷肌腱部位修復(fù)技術(shù)日益彰顯良好的診療效果，并有報(bào)道其可對(duì)損傷肌腱愈合有促進(jìn)作用[1]。間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal Stem Cells,MSCs）是骨髓主要來源的多向能分化細(xì)胞，受到誘導(dǎo)可分化為骨組織、軟骨組織、脂肪組織。多向MSCs是較理想肌腱損傷修復(fù)的種子細(xì)胞。SDF-1又稱基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1，是CXC類趨化因子，與受體CXCR4受體結(jié)合激活[2]。研究顯示，損傷部位高表達(dá)SDF-1可有效募集循環(huán)系統(tǒng)或損傷部位留存的CXCR4激活間充質(zhì)細(xì)胞到達(dá)損傷部位，修復(fù)受損組織[3]。目前利用組織工程修復(fù)損傷肌腱的研究不是很多，如何招募體內(nèi)MSCs歸巢到組織工程肌腱，促進(jìn)宿主自身MSCs參與肌腱修復(fù)。如何激發(fā)宿主自身MSCs參與再生修復(fù)、降低免疫排斥反應(yīng)、加速肌腱修復(fù)。該實(shí)驗(yàn)在2017年3月—2018年3月期間利用體外實(shí)驗(yàn)?zāi)M體內(nèi)低氧微環(huán)境觀察一定濃度SDF-1刺激間充質(zhì)干細(xì)胞遷移及細(xì)胞活性，為臨床研究提供有力的研究支撐。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

DMEM 培養(yǎng)基（HyClone，美國），胎牛血清（Gibco，美國），青鏈霉素（Gibco，美國），胰蛋白酶，4%多聚甲醛，大鼠 SDF-1（Abcam，美國），MTT 試劑盒（Sigma，美國）。

超凈工作臺(tái)，CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱，O2/CO2/N2三氣培養(yǎng)箱，倒置相差顯微鏡（Olympus，日本），Transwell（Corning，美國），高速離心機(jī)（Eppendorf，德國），震蕩儀（躍進(jìn)儀器廠），Emax酶標(biāo)儀為美國 Molecular Devices。公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

4～6周齡SD大鼠雄性購自齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞低氧微環(huán)境 利用三氣培養(yǎng)箱建立低氧微環(huán)境。

1.3.2 間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定 大鼠斷頸處死，無菌處理取大鼠股骨兩端剪開，5 mL DMEM培養(yǎng)基沖洗骨髓腔3～5次，收集細(xì)胞懸液1 000 r/s，離心10 min，上清液倒掉，用培養(yǎng)液吹均勻離心管下層組織，在25 cm2培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，48 h換液，觀察細(xì)胞培養(yǎng)瓶有霧狀細(xì)胞集落，去除未貼壁細(xì)胞，以后每3 d換液。顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)、狀態(tài)，細(xì)胞長滿80%～90%進(jìn)行消化、傳代，使用第3代間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)分組 低氧環(huán)境下培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞為低氧對(duì)照組，在低氧環(huán)境下加入120 ng/mL SDF-1為實(shí)驗(yàn)組，正常環(huán)境下培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞為正常對(duì)照組。

1.3.4 Transwell實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn)方法[4]，將第3代MSC用0.25%胰酶消化1～2 min，調(diào)整細(xì)胞密度1×105cells/mL，Transwell小室的上室加入 200 μL 細(xì)胞懸液，24孔板加入120 ng/mL濃度SDF-1的DMEM培養(yǎng)液500 μL，對(duì)照組為500 μL DMEM培養(yǎng)液，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，其分別放入37℃和5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)和低氧環(huán)境37℃培養(yǎng)箱，12～15 h進(jìn)行培養(yǎng)，上室培養(yǎng)液倒掉，PBS沖洗3遍，將聚碳酸酯膜上細(xì)胞擦拭掉，4%多聚甲醛固定，PBS沖洗3遍，20 min蘇木精染色，倒置相差顯微鏡下觀察拍照，每個(gè)復(fù)孔隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。

1.3.5 MTT實(shí)驗(yàn) 將第3代間充質(zhì)干細(xì)胞用胰酶消化1～2 min，1×105cells/mL 種于 96 孔板， 每孔 200 μL，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)過夜，24 h后加入含120 ng/mL SDF-1培養(yǎng)液培養(yǎng)和不含SDF-1培養(yǎng)液培養(yǎng)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱和低氧培養(yǎng)箱內(nèi)，每孔加入 5%MTT 20 μL，避光孵育 4 h，然后添加 100 μL二甲基亞砜(DMSO)，490 m波長測定每個(gè)樣品吸光度(OD值)。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，計(jì)量資料以（±s）表示，行t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn):檢測正常對(duì)照組、低氧對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明細(xì)胞遷移率實(shí)驗(yàn)組（43.5±8.4）×103與正常對(duì)照組（26.7±5.6）×103比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01）；低氧對(duì)照組（37.5±7.2）×103與正常對(duì)照組（26.7±5.6）×103相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 低氧環(huán)境下120 ng/mL SDF-1對(duì)MSCs趨化作用

MTT實(shí)驗(yàn)檢測正常對(duì)照組、低氧對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組間充質(zhì)干細(xì)胞活性的影響。在低氧環(huán)境下加入120 ng/mL SDF-1因子對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖能力。結(jié)果是實(shí)驗(yàn)組加入120 ng/mL SDF-1因子對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖數(shù)量比較正常對(duì)照組和低氧對(duì)照組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 低氧環(huán)境下120 ng/mL SDF-1對(duì)MSCs相對(duì)吸光度的影響（±s）

表1 低氧環(huán)境下120 ng/mL SDF-1對(duì)MSCs相對(duì)吸光度的影響（±s）

注：與正常對(duì)照組相比較 *P＜0.05，**P＜0.01。

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3 討論

肌腱損傷是目前醫(yī)學(xué)較難解決的問題之一，是運(yùn)動(dòng)性損傷治療的瓶頸問題，臨床治療方案主要停留在手術(shù)治療，雖有一定治療效果，但只能恢復(fù)原肌腱力學(xué)的40%，還伴有肌腱斷裂、粘連等一些列并發(fā)癥，給患者帶來較大的身體、心理及精神創(chuàng)傷。近年來，組織工程技術(shù)的日漸成熟，前景廣闊[5]，許多研究者運(yùn)用干細(xì)胞復(fù)合支架來修復(fù)損傷組織、器官。間充質(zhì)干細(xì)胞取材簡單方便，易于培養(yǎng)，適應(yīng)生存在微環(huán)境，具有免疫源性低，而且分化能力強(qiáng)，是理想的種子細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)通過模擬體內(nèi)肌腱損傷周圍低氧微環(huán)境加入趨化因子SDF-1來觀察間充質(zhì)干細(xì)胞遷移能力和活性。目前趨化因子共50多種，有CXC、CC、C和CX3C四大亞家族[6]。SDF-1是應(yīng)用較多是趨化因子，屬于CXC家族，SDF-1與CXCR4結(jié)合，激活受體蛋白，并下一步激活下游蛋白，募集間充質(zhì)干細(xì)胞到損傷部位，參與修復(fù)再生。

郝璐等[7]研究發(fā)現(xiàn)：在不加入SDF-1因子低氧環(huán)境下BMSCs遷移能力增強(qiáng)，加入趨化因子SDF-1后BMSCs遷移能力加強(qiáng)。該實(shí)驗(yàn)通過Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：低氧對(duì)照組較正常氧對(duì)照組的MSCs遷移效果增強(qiáng)，在加入120 ng/mL濃度SDF-1趨化因子在低氧環(huán)境下MSCs趨化現(xiàn)象也明顯增強(qiáng)于低氧對(duì)照組，同時(shí)在低氧的環(huán)境下，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長MSCs細(xì)胞的趨化能力也高于正常氧的環(huán)境。因此，該研究認(rèn)為SDF-1及低氧環(huán)境對(duì)MSCs細(xì)胞有趨化作用，進(jìn)而推測在低氧環(huán)境下及低氧環(huán)境下加入SDF-1因子能夠使MSCs細(xì)胞趨化至損傷肌腱部位，從而參與修復(fù)損傷肌腱，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)開展提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

以往研究資料表明[8]可以利用MTT實(shí)驗(yàn)檢測在不同濃度下 10、50、100 ng/mL和 200 ng/mLSDF-1因子在低氧環(huán)境下細(xì)胞的增殖活性。黃曉等[8]報(bào)道，在SDF-1濃度小于100 ng/mL時(shí)，對(duì)BMSCs細(xì)胞活力無影響；在SDF-1濃度等于100 ng/mL時(shí)，BMSCs細(xì)胞活力減弱。該實(shí)驗(yàn)通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)：在低氧環(huán)境下加入120 ng/mL濃度SDF-1組細(xì)胞增殖活性相對(duì)比正常氧MSCs組，低氧SDF-1組細(xì)胞增殖活性明顯增高，表明低氧加入120 ng/mL SDF-1能夠有效地加強(qiáng)MSCs細(xì)胞增殖活性；低氧對(duì)照組細(xì)胞增殖活性與正常對(duì)照組相比較也有差別，低氧對(duì)照組MSCs細(xì)胞增殖活性也明顯強(qiáng)于正常對(duì)照組。

綜上所述，上述的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果可作為臨床肌腱損傷招募肌腱干細(xì)胞歸巢并修復(fù)損傷部位奠定了理論支撐。但SDF-1因子招募細(xì)胞歸巢機(jī)制目前尚不明確，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，以及間充質(zhì)干細(xì)胞在損傷組織發(fā)揮修復(fù)作用機(jī)理等，尚需要進(jìn)一步討論研究。