基于Y形光纖的便攜式免疫熒光定量檢測(cè)系統(tǒng)*

蘇廣，胡志剛,2△，杜喆，祖向陽

(1.河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)與工程學(xué)院，河南 洛陽 471003； 2.河南省機(jī)器人與智能系統(tǒng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 洛陽 471003)

1 引 言

當(dāng)今大型自動(dòng)化分析儀與流水線的模塊組合和小型儀器簡(jiǎn)單操作的POCT(point-of-care testing,POCT)是檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)的兩大發(fā)展方向，隨著臨床檢測(cè)“去中心化”的發(fā)展趨勢(shì)，POCT以其儀器和試劑體積小、便攜、操作簡(jiǎn)單且能快速獲得結(jié)果等特點(diǎn)，正廣泛應(yīng)用于醫(yī)院及院外患者管理。

熒光免疫層析技術(shù)是熒光標(biāo)記技術(shù)與免疫層析技術(shù)創(chuàng)新性結(jié)合發(fā)展起來的一種新型POCT定量檢測(cè)技術(shù)，與以膠體金免疫層析為代表的傳統(tǒng)POCT定性檢測(cè)技術(shù)相比，不僅保留了操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)快速、便攜性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)通過熒光示蹤增強(qiáng)技術(shù)實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)結(jié)果的精確定量。該技術(shù)靈敏度高、特異性強(qiáng)，是目前POCT檢測(cè)技術(shù)的主要研究方向[1]，與該技術(shù)配套的熒光定量檢測(cè)儀器也越發(fā)受到重視[2]。在熒光定量檢測(cè)儀的設(shè)計(jì)中，激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)的光學(xué)設(shè)計(jì)方案是其中的核心部件，目前常見的設(shè)計(jì)方案有共聚焦式光學(xué)結(jié)構(gòu)檢測(cè)法[3]、光纖式光學(xué)結(jié)構(gòu)檢測(cè)法[4]、圖像處理檢測(cè)法[5]等，其中共聚焦式光學(xué)結(jié)構(gòu)組裝復(fù)雜，體積大，不利于儀器的小型化；基于圖像處理法的免疫熒光檢測(cè)系統(tǒng)成本高昂，且功耗較高。因此，本研究采用光纖式光學(xué)結(jié)構(gòu)，以激光二極管作為激發(fā)光源，Y形光纖進(jìn)行激光傳導(dǎo)及熒光收集，硅光電二極管作為熒光檢測(cè)傳感器，光路結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，設(shè)備體積?。辉O(shè)計(jì)Sallen-Key拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)三級(jí)二階具有巴特沃斯響應(yīng)的有源低通濾波器對(duì)微弱信號(hào)進(jìn)行濾波放大處理；另外，本研究采用STM32F103ZET6微處理器、ADS1255模數(shù)轉(zhuǎn)換器、TB62209步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)芯片設(shè)計(jì)了核心電路，實(shí)現(xiàn)對(duì)免疫熒光信號(hào)的掃描檢測(cè)。

2 Y形光纖結(jié)構(gòu)及檢測(cè)原理

Y形光纖成分為摻高羥基離子石英，在250～1 200 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)，光波傳播基本不受影響，無能量衰減。Y形光纖的結(jié)構(gòu)及檢測(cè)原理示意圖見圖1，兩端分別為分叉端和探頭端。分叉端一端與激光二極管相連作為光源，由直徑600 μm的單一光纖構(gòu)成，另一端與光電二極管連接，構(gòu)成熒光-電信號(hào)轉(zhuǎn)換裝置，由12根200 μm的細(xì)光纖組成；二者相交后以600 μm的大光纖為中心，12根200 μm的小光纖圍繞大光纖按衛(wèi)星式排布形成探頭端，探頭直徑為6.35 mm。

相對(duì)于鏡片式光學(xué)結(jié)構(gòu)組裝的復(fù)雜性，Y形光纖式結(jié)構(gòu)只需簡(jiǎn)單的控制探頭到待檢測(cè)樣品的距離。距離的大小與光纖的數(shù)值孔徑有關(guān)，多模光纖的數(shù)值孔徑是一個(gè)無量綱的數(shù)，能夠描述光纖端面接收光的能力，即接收光的角度范圍。數(shù)值孔徑大小NA由式(1)決定：

圖1 Y形光纖結(jié)構(gòu)圖

(1)

其中n為樣品與光纖端面之間介質(zhì)的折射率，θ為接收角的一半，只有入射角度小于θ的光線才能發(fā)生全反射被傳輸，數(shù)值孔徑的大小取值一般要兼顧光接收能力和對(duì)模式色散的影響。本系統(tǒng)不需要考慮到光線傳輸?shù)臅r(shí)延差，為了獲得更高的耦合效率，選擇數(shù)值孔徑為0.37的多模光纖，光線束的數(shù)值孔徑與所構(gòu)成的單根光纖的數(shù)值孔徑相同，因此，光纖束探頭端的數(shù)值孔徑為0.37，接收角度范圍為22°，通過實(shí)際樣本區(qū)的大小即可計(jì)算出探頭到樣本的距離。

3 系統(tǒng)硬件設(shè)計(jì)

3.1 整體方案設(shè)計(jì)

系統(tǒng)總體框圖見圖2，由微處理器核心模塊、光路結(jié)構(gòu)模塊、熒光信號(hào)采集及濾波放大模塊、模數(shù)轉(zhuǎn)換模塊、步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)模塊、激光驅(qū)動(dòng)模塊、熱敏打印機(jī)模塊等構(gòu)成。STM32F103ZET6微處理器通過脈沖信號(hào)方式控制步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)模塊，步進(jìn)電機(jī)帶動(dòng)試紙條傳動(dòng)機(jī)構(gòu)將試紙條遞送到光纖探頭所處位置；試紙條上被激發(fā)的微弱熒光信號(hào)經(jīng)過Y形光纖收集后照射到光電二極管的光接收窗口，使得光電二極管產(chǎn)生微弱的電流信號(hào)，電流信號(hào)經(jīng)過電流/電壓轉(zhuǎn)換以及放大濾波處理，由模數(shù)轉(zhuǎn)換電路處理成數(shù)字信號(hào)送至STM32F103ZET6微處理器進(jìn)行處理。微處理器再通過熱敏打印機(jī)或者電容式觸摸屏輸出熒光信號(hào)采集結(jié)果。

3.2 單元電路設(shè)計(jì)

3.2.1激光二極管驅(qū)動(dòng)電路 Y形光纖的光源端與激光二極管相連將激發(fā)光傳輸?shù)教筋^端對(duì)樣本進(jìn)行熒光激發(fā)，為了避免激發(fā)光光強(qiáng)的波動(dòng)給熒光信號(hào)的采集帶來干擾，需要輸出穩(wěn)定的電流來驅(qū)動(dòng)激光二極管。在本設(shè)計(jì)中，采用穩(wěn)壓源加三極管的方式構(gòu)建恒流源電路，通過控制發(fā)射極電流恒定使集電極輸出穩(wěn)定的激光二極管驅(qū)動(dòng)電流(見圖3)。在實(shí)際應(yīng)用中，選用波長(zhǎng)488 nm，最大輸出功率60 mw的激光二極管，其工作電流為50 mA，通過調(diào)節(jié)穩(wěn)壓源電壓和三極管發(fā)射極電阻的比值來控制輸出電流的大小。

圖2 系統(tǒng)總體框圖

圖3 恒流源驅(qū)動(dòng)電路原理圖

Fig3Digramaofexcitationsourcedrivedbyconstant-currentsource

3.2.2熒光信號(hào)采集及濾波放大電路 Y形光纖的檢測(cè)端通過濾光片和聚焦透鏡將熒光傳輸?shù)焦怆姸O管的光接收窗口。光電二極管在光伏模式下能夠?qū)晒庑盘?hào)轉(zhuǎn)換成微弱的電流信號(hào)，然而采集到的微弱電流信號(hào)通常會(huì)混雜噪聲，在對(duì)硅光電二極管光電檢測(cè)電路噪聲特性的研究基礎(chǔ)上[6]，本研究設(shè)計(jì)了光電二極管的前級(jí)I/V轉(zhuǎn)換電路和濾波放大電路。圖4為I/V轉(zhuǎn)換電路，通過調(diào)節(jié)反饋電阻的大小控制輸出電壓，在運(yùn)放同相端加入匹配電阻和匹配電容，減小輸入偏置電流、輸入失調(diào)電壓和溫漂的影響。其輸出電壓和輸出信號(hào)帶寬分別為：

VP=IP×R2

(2)

(3)

為了提高整個(gè)系統(tǒng)的信噪比，需要對(duì)采集到的電流信號(hào)進(jìn)行濾波放大處理，本部分電路采用Sallen-Key拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)三級(jí)二階有源低通濾波電路，并提供巴特沃斯響應(yīng)，在通帶范圍內(nèi)無紋波，截止頻率處具有良好的衰減效果[7]。

圖4 前級(jí)I/V轉(zhuǎn)換電路原理圖

Fig4Schematicdiagramofconversioncircuit

圖5為濾波放大電路原理圖，其各級(jí)電路參數(shù)的計(jì)算類似第一級(jí)參數(shù)的計(jì)算方法，如下：

C4=mC3

(4)

(5)

(6)

(7)

其中，m為電容擴(kuò)展系數(shù)，Q為品質(zhì)因數(shù)(第一級(jí)0.5176、第二級(jí)0.7071、第三級(jí)1.9319)，K為放大倍數(shù)，ωc為截止頻率。

圖5 三級(jí)二階有源低通濾波放大電路原理圖

Fig5Schematicdiagramoflowpassfilteramplifier

3.2.3模數(shù)轉(zhuǎn)換電路 在微弱熒光信號(hào)采集系統(tǒng)中，可能需要對(duì)多路不同波長(zhǎng)的熒光信號(hào)進(jìn)行采樣，為了方便系統(tǒng)擴(kuò)展而又不造成資源浪費(fèi)，本系統(tǒng)選用ADS1255集成24位Δ-Σ型ADC構(gòu)成單極性雙通道模數(shù)轉(zhuǎn)換電路(見圖6)，大大簡(jiǎn)化了信號(hào)調(diào)理電路，減小了電路板面積、減少了器件數(shù)量和生產(chǎn)成本。此電路使用外部精準(zhǔn)基準(zhǔn)電壓源ADR4525產(chǎn)生AD芯片的基準(zhǔn)電壓，具有高精度、低漂移、低噪聲、低靜態(tài)電流等特性。這些特性使得ADR4525非常適合便攜式設(shè)備的高精度轉(zhuǎn)換應(yīng)用，它與ADS1255相結(jié)合，能夠?qū)崿F(xiàn)具有相當(dāng)好的集成度和精度的低功耗微弱熒光信號(hào)模數(shù)轉(zhuǎn)換電路。

圖6 模數(shù)轉(zhuǎn)換電路原理圖

3.2.4步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)電路 試紙條傳動(dòng)機(jī)構(gòu)運(yùn)行的穩(wěn)定性和定位的精確性對(duì)檢測(cè)結(jié)果有著至關(guān)重要的影響。該系統(tǒng)采用東芝公司的步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)芯片TB62209設(shè)計(jì)步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)電路，具有最高16細(xì)分、峰值電流1.8 A、自動(dòng)半流鎖定和步進(jìn)脈沖驅(qū)動(dòng)等特性。另外還有兩路槽型光耦限位電路，作為試紙條傳動(dòng)機(jī)構(gòu)的零位信號(hào)和限位信號(hào)，槽型光耦設(shè)計(jì)為常閉狀態(tài)，當(dāng)運(yùn)動(dòng)超過限定位置或故障時(shí)發(fā)送報(bào)警信號(hào)。電路原理圖見圖7。

圖7 步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)電路原理圖

4 軟件設(shè)計(jì)

軟件底層驅(qū)動(dòng)部分主要有LCD驅(qū)動(dòng)模塊、微型打印機(jī)驅(qū)動(dòng)模塊、串口驅(qū)動(dòng)模塊、AD采樣驅(qū)動(dòng)模塊、步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)模塊、激光二極管驅(qū)動(dòng)模塊。實(shí)時(shí)操作系統(tǒng)采用μCOS-III內(nèi)核，它是一個(gè)實(shí)時(shí)多任務(wù)內(nèi)核，具有易移植、可擴(kuò)展、可固化、快速響應(yīng)中斷等優(yōu)點(diǎn)，適合應(yīng)用到熒光檢測(cè)平臺(tái)。軟件代碼的編寫使用C語言、調(diào)試仿真都基于Keil集成開發(fā)環(huán)境，結(jié)合ST公司的固件庫(kù)、StemWin圖形用戶接口庫(kù)、μCOS內(nèi)核、FatFs文件系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)硬件設(shè)備的控制和熒光信號(hào)的掃描檢測(cè)。系統(tǒng)的總流程圖見圖8。

圖8 系統(tǒng)軟件流程圖

5 系統(tǒng)測(cè)試結(jié)果與分析

5.1 AD精度測(cè)試

為了測(cè)試AD采樣精度，使用3個(gè)不同的參考點(diǎn)電壓作為AD的模擬輸入信號(hào)，對(duì)系統(tǒng)的模數(shù)轉(zhuǎn)換性能進(jìn)行評(píng)估。分別對(duì)3個(gè)參考電壓點(diǎn)連續(xù)采集200個(gè)數(shù)據(jù)，測(cè)試結(jié)果見表1。在較穩(wěn)定的地參考點(diǎn)和基準(zhǔn)電壓參考點(diǎn)具有很小的采樣偏差和標(biāo)準(zhǔn)差，該系統(tǒng)的模數(shù)轉(zhuǎn)換模塊具備很好的精度和重復(fù)性。

表1 AD采樣實(shí)驗(yàn)

5.2 熒光微球?qū)崪y(cè)實(shí)驗(yàn)

為了測(cè)試本系統(tǒng)的靈敏度，采用蘇州為度生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的300 nm綠色熒光微球，其激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為488 nm和520 nm，分別對(duì)其稀釋8、16、32、64、128、256倍，對(duì)不同濃度梯度的微球熒光進(jìn)行掃描檢測(cè)，得到的各個(gè)梯度濃度的熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換電壓值曲線見圖9。

圖9 微球熒光稀釋濃度與電壓值曲線圖

Fig9Thecurveoffluorescencedilutingfactorandmagnitudeofvoltage

將上述掃描檢測(cè)數(shù)據(jù)取波峰值與稀釋倍數(shù)擬合曲線(見圖10)，其乘冪趨勢(shì)良好，相關(guān)系數(shù)為0.9971，說明該熒光檢測(cè)系統(tǒng)靈敏度高，即使在稀釋倍數(shù)足夠大的情況下，仍然能夠獲取有效信號(hào)值。

圖10 光電轉(zhuǎn)換信號(hào)與稀釋倍數(shù)的線性關(guān)系

Fig10Thecorrelationbetweenphotoelectricconversionsignalanddilutingfactor

6 結(jié)束語

Y形光纖式免疫熒光定量檢測(cè)系統(tǒng)經(jīng)過平臺(tái)搭建調(diào)試，實(shí)測(cè)表明能夠很好完成免疫熒光信號(hào)的定量檢測(cè)。該系統(tǒng)使用Y形光纖作為光信號(hào)的傳輸介質(zhì)，光電二極管將熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電壓信號(hào)，在經(jīng)過有源濾波和放大之后，通過模數(shù)轉(zhuǎn)換模塊能夠穩(wěn)定精確地轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào)，試紙條傳動(dòng)機(jī)構(gòu)具有高效穩(wěn)定、低噪聲、精準(zhǔn)定位的工作表現(xiàn)，整個(gè)裝置占用空間小，功耗低，安裝結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，儀器成本低，檢測(cè)結(jié)果靈敏度高，重復(fù)性好。