煙酒成癮者基因差異性表達(dá)及成癮機(jī)理研究*

徐紹凱，陳洪波，范琳，劉喻

(桂林電子科技大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，廣西 桂林 541004)

1 引 言

近年來人工智能技術(shù)的爆發(fā)，大大加快了機(jī)器學(xué)習(xí)、數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用[1-2]。主要方法是通過對(duì)基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)的挖掘以實(shí)現(xiàn)特征基因的提取、疾病相關(guān)基因的發(fā)掘、疾病分類、疾病發(fā)現(xiàn)等[3-5]。目前，對(duì)煙酒成癮者的基因研究大多是基因位點(diǎn)分析和基因文獻(xiàn)薈萃分析，它們能夠得到一些特定的基因或基因位點(diǎn)與煙酒成癮的關(guān)系，卻無法從基因間的共同作用和功能上發(fā)掘基因與煙酒成癮的相關(guān)性[6-7]。一些常用的差異表達(dá)基因提取方法目前也尚未被運(yùn)用于煙酒成癮相關(guān)基因的提取[8-10]。本研究采用NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫所提供的煙酒成癮者的基因表達(dá)微陣列數(shù)據(jù)，通過基于R語言的方差分析，試圖找到與吸煙和飲酒高度相關(guān)的基因以及探索吸煙成癮與飲酒成癮的內(nèi)在聯(lián)系。對(duì)于煙酒成癮的治療和探尋與煙酒成癮相關(guān)的疾病有著十分重要的意義。

2 材料與方法

2.1 數(shù)據(jù)來源

本研究數(shù)據(jù)取自于美國國立生物技術(shù)信息中心(national center for biotechnology information，NCBI)的GEO數(shù)據(jù)庫，收錄號(hào)為GSE20568，為吸煙與飲酒成癮者的腦組織基因表達(dá)微陣列數(shù)據(jù)[11]。GEO數(shù)據(jù)庫是NCBI基因表達(dá)匯編計(jì)劃所建立的數(shù)據(jù)庫，是目前世界上最大的基因表達(dá)數(shù)據(jù)倉庫和在線資源，其所收錄的數(shù)據(jù)擁有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的格式以及關(guān)于數(shù)據(jù)的詳盡的介紹，在使用起來十分方便。數(shù)據(jù)共包括20個(gè)樣本，分別為吸煙且飲酒組、吸煙不飲酒組、不吸煙不飲酒組以及不吸煙飲酒組四組樣本，數(shù)據(jù)集中包含的基因探針數(shù)為8829個(gè)。對(duì)于每個(gè)樣本，原實(shí)驗(yàn)中均可獲得完整的疾病史。所有飲酒者均有慢性過度飲酒的歷史，所有吸煙者根據(jù)其嚴(yán)重吸煙記錄，均被歸類為“煙草濫用者”[12]。所有樣本均沒有任何其他混雜的潛在的精神疾病的報(bào)告。數(shù)據(jù)中的20個(gè)樣本為原實(shí)驗(yàn)中經(jīng)過篩選后的病例，病例之間在年齡，死亡間隔和PH方面沒有任何顯著差異。數(shù)據(jù)在原實(shí)驗(yàn)中已進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

2.2 雙因素方差分析對(duì)差異表達(dá)基因的篩選

采用雙因素方差分析法對(duì)基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，篩選對(duì)吸煙和飲酒敏感的基因。在建立方差分析模型時(shí)，每一個(gè)表達(dá)數(shù)據(jù)稱為一個(gè)觀測(cè)值，基因的表達(dá)量稱為觀測(cè)變量，吸煙與飲酒是兩個(gè)控制變量，對(duì)基因表達(dá)微陣列數(shù)據(jù)中每一行基因進(jìn)行雙因素方差分析。將樣本是否吸煙成癮作為一個(gè)控制變量，將樣本是否飲酒成癮作為另一個(gè)控制變量，利用方差分析分別求得每一條基因?qū)τ谑欠裎鼰煶砂a呈差異表達(dá)的P值以及對(duì)于是否飲酒成癮呈差異表達(dá)的P值。P<0.01被認(rèn)為存在顯著差異。

2.3 使用DAVID軟件對(duì)差異表達(dá)基因做GO功能注釋與KEGG信號(hào)通路映射

原始數(shù)據(jù)中每一條基因的信息由EST數(shù)據(jù)庫的genebank收錄號(hào)給出，使用NCBI自帶的BLAST工具將經(jīng)過方差分析篩選出來的基因批量的與nucleotide數(shù)據(jù)庫中的基因序列進(jìn)行對(duì)應(yīng)，將所得結(jié)果保存為XML文件，通過解析XML文件取得與每條基因相似度最高的nucleotide已知序列，得到該序列的genebank收錄號(hào)。將所得基因的genebank收錄號(hào)傳入DAVID分析網(wǎng)站中，得到GO功能注釋的生物過程(BP)和KEGG信號(hào)通路。DAVID分析操作步驟如下：提交基因集，選擇基因標(biāo)識(shí)名為“GENEBANK_ACCESSION”，選擇基因集類型為“Gene List”；得到注釋結(jié)果摘要，包括多種注釋數(shù)據(jù)；選擇“GOTERM_BP_DIRECT”和“KEGG_PATHWAY”，并得到分析結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1 吸煙(飲酒)成癮樣本的差異表達(dá)基因

在方差分析中，共得到197 (77)個(gè)與吸煙(飲酒)成癮相關(guān)的基因。使用層級(jí)聚類方法對(duì)吸煙(飲酒)成癮相關(guān)基因進(jìn)行聚類分析， 20個(gè)樣本被聚成兩大類，第Ⅰ類樣本均為不吸煙(飲酒)的樣本，第Ⅱ類樣本均為吸煙(飲酒)成癮的樣本，篩選出的基因在兩類樣本中呈現(xiàn)明顯的差異性。197 (77)條基因共被聚成兩大類，第Ⅰ類基因在不吸煙(飲酒)樣本中普遍呈現(xiàn)高表達(dá)，在吸煙(飲酒)樣本中普遍呈現(xiàn)低表達(dá)，第Ⅱ類基因在吸煙(飲酒)樣本中普遍呈現(xiàn)高表達(dá)，在不吸煙(飲酒)樣本中普遍呈現(xiàn)低表達(dá)。

利用DAVID軟件對(duì)吸煙(飲酒)成癮相關(guān)基因進(jìn)行分析。吸煙成癮相關(guān)基因GO功能注釋的生物過程(BP)見表1(P<0.05)。根據(jù)表1可以看出與吸煙相關(guān)的功能注釋大多與物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞遷移、信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)。飲酒成癮相關(guān)基因GO功能注釋的生物過程(BP)見表2(P<0.05)。從表2中可以看出飲酒相關(guān)的功能注釋同樣包括信號(hào)傳導(dǎo)、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。吸煙與飲酒相關(guān)的功能注釋中均包括細(xì)胞外基質(zhì)的調(diào)節(jié)功能。

3.2 煙酒成癮中均呈差異表達(dá)的基因

對(duì)比吸煙成癮相關(guān)基因與飲酒成癮相關(guān)基因，有七個(gè)基因在二者中均有出現(xiàn)，分別為TMEM53、IGFBP7、FN1、HNRNPA2B1、FLJ59422、SYNJ1、TLN2。

將七個(gè)基因?qū)τ诟髯缘乃念悩颖镜谋磉_(dá)量變化趨勢(shì)進(jìn)行構(gòu)圖，見圖1，根據(jù)圖中每條線段斜率的正負(fù)可以得到飲酒與基因表達(dá)量之間的定性關(guān)系；比較圖中虛線段與實(shí)線段的相對(duì)位置可以得到吸煙與基因表達(dá)量之間的定性關(guān)系。

表1 吸煙成癮相關(guān)基因的GO功能注釋(BP)

從圖1中可以看出，TMEM53基因和TLN2基因的表達(dá)量對(duì)吸煙與飲酒均成明顯的負(fù)相關(guān)趨勢(shì)， IGFBP7、FN1、HNRNPA2B1、FLJ59422、SYNJ1基因?qū)ξ鼰熍c飲酒均成明顯的正相關(guān)趨勢(shì)?？傮w來看，七個(gè)基因在吸煙樣本中呈現(xiàn)高表達(dá)的，其在飲酒樣本中也必然呈現(xiàn)高表達(dá)，反之亦然。

表2 飲酒成癮相關(guān)基因的GO功能注釋(BP)

圖1 7條交叉的基因?qū)ξ鼰煛嬀频慕】蹬c成癮樣本表達(dá)趨勢(shì)對(duì)比圖(NS在0處的點(diǎn)代表非吸煙非飲酒樣本，NS在1處的點(diǎn)代表非吸飲酒煙樣本，S在0處的點(diǎn)代表吸煙非飲酒樣本，S在1處的點(diǎn)代表吸煙飲酒樣本)

Fig1Comparisonoftheexpressionof7crossedgenesonsmokinganddrinkingbetweenhealthandaddiction(Thepointattheintersectionof0andNSrepresentsnon-alcohol-non-smokingsamples,thepointattheintersectionof1andNSrepresentsalcohol-non-smokingsamples,thepointattheintersectionof0andSrepresentsnon-alcohol-smokingsamples,thepointattheintersectionof1andSrepresentsalcohol-smokingsamples)

4 討論

吸煙與飲酒成癮和基因之間的關(guān)系已經(jīng)越來越明顯，但目前尚不能確定與煙酒成癮相關(guān)的基因以及其發(fā)病機(jī)理。利用生物信息學(xué)方法對(duì)煙酒成癮相關(guān)基因進(jìn)行篩選是目前十分有效的方法之一。本研究選用雙因素方差分析分別提取對(duì)吸煙成癮和飲酒成癮呈現(xiàn)差異表達(dá)的基因，其中共有的差異表達(dá)基因有七條。

TMEM53基因編碼跨膜蛋白53(transmembrane protein 53)，該基因同其他跨膜蛋白一樣在轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)及信號(hào)傳導(dǎo)方面具有一定的作用，與該基因有關(guān)的表型有增加痘苗病毒(VACV)感染、增加γ-H2AX磷酸化、降低CFP-tsO45G細(xì)胞表面轉(zhuǎn)運(yùn)、增加轉(zhuǎn)鐵蛋白(TF)內(nèi)吞作用、減少IL-8分泌等[13-14]。

TLN2基因位于人類15號(hào)染色體，編碼與Talin 1相關(guān)的蛋白質(zhì)，是一種細(xì)胞骨架蛋白，在肌動(dòng)蛋白絲的裝配和各種細(xì)胞類型的遷移中有著重要的作用[15]。IGFBP7基因編碼胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7(insulin like growth factor binding protein 7)，與其相關(guān)的信號(hào)通路是細(xì)胞衰老和自噬，與該基因相關(guān)的GO功能注釋包括胰島素樣生長因子結(jié)合。FN1基因編碼纖維連接蛋白1(fibronectin 1)該蛋白參與了基質(zhì)重塑及細(xì)胞黏附和遷移過程[16]。HNRNPA2B1基因編碼的蛋白質(zhì)為不均一型核糖核蛋白A2B1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2B1,HNRNPA2B1)。HNRNPA2B1蛋白參與很多重要的生理過程，包括RNA的轉(zhuǎn)錄、外顯子剪接、PremRNA的成熟降解、細(xì)胞分化及細(xì)胞凋亡等[17]。已有許多研究表明TLN2、IGFBP7、FN1和HNRNPA2B1基因與多種人類癌癥的發(fā)病、治療和預(yù)后有很強(qiáng)的關(guān)系，包括肝癌、乳腺癌、甲狀腺癌、胰腺癌、胃癌、食管鱗癌、口腔癌等惡性腫瘤[18-22]。本研究顯示這些基因與煙酒成癮具有很強(qiáng)的相關(guān)性，據(jù)此可初步推斷吸煙或飲酒會(huì)直接或間接影響此類惡性腫瘤的發(fā)病和治療，煙酒成癮與癌癥發(fā)病在基因?qū)用嫔系南嚓P(guān)性與發(fā)病機(jī)理有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

FLJ59422基因編碼的蛋白質(zhì)高度相似于含GRAM結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)3，,其余信息暫無相關(guān)研究和文獻(xiàn)資料[23]。

SYNJ1編碼一種磷酸肌醇磷酸酶蛋白(synaptojanin 1)，其在突出小泡的內(nèi)吞后循環(huán)中有重要作用，這種酶的表達(dá)可能影響突觸傳播和膜運(yùn)輸[24]。已知的與SYNJ1基因相關(guān)的疾病包括早發(fā)性帕金森病和非典型青少年帕金森綜合征[25]。本研究顯示SYNJ1基因的表達(dá)同吸煙與飲酒具有相關(guān)性，其在吸煙與飲酒者中的表達(dá)量均為明顯的高表達(dá)。已有研究顯示吸煙者患帕金森病的風(fēng)險(xiǎn)比不吸煙者低63%，而既往吸煙者(已戒煙者)比不吸煙者低41%[26]。本研究通過對(duì)基因表達(dá)譜的分析，再次證實(shí)SYNJ1基因表達(dá)趨勢(shì)的變化可能對(duì)吸煙與飲酒者患帕金森病的幾率產(chǎn)生影響。

本研究發(fā)現(xiàn)的煙酒成癮相關(guān)基因均在物質(zhì)運(yùn)輸、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞周期中發(fā)揮一定的作用，長期吸煙與飲酒會(huì)引起這些基因表達(dá)量發(fā)生顯著變化，從而對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)與細(xì)胞物質(zhì)運(yùn)輸能力產(chǎn)生一定影響，當(dāng)短時(shí)間戒斷時(shí)，機(jī)體內(nèi)神經(jīng)系統(tǒng)與物質(zhì)運(yùn)輸能力減弱，從而使人產(chǎn)生不適感，這很可能是煙酒成癮者產(chǎn)生戒斷反應(yīng)的原因之一。在整個(gè)腦區(qū)域，酒精具有許多潛在的目標(biāo)，包括膜和幾個(gè)離子通道，而尼古丁通過特異性受體或結(jié)合蛋白起作用，長期使用酒精和尼古丁會(huì)使得大腦區(qū)域中產(chǎn)生適應(yīng)性變化，最終導(dǎo)致成癮[27]。已有大量研究證實(shí)多巴胺信號(hào)傳導(dǎo)和吸煙成癮有著重要的相關(guān)性，與之相關(guān)的基因包括DRD2、DAT1、NACHR等[28-29]。

5 總結(jié)

研究中使用雙因素方差分析對(duì)吸煙與飲酒者的基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)基因提取，用層級(jí)聚類的方法對(duì)篩選出的特征基因繪制熱圖，觀察特征基因在四類樣本中的表達(dá)趨勢(shì)變化。取吸煙成癮者的特征基因與飲酒成癮者的特征基因的交集后，二者共有的基因包括TMEM53、IGFBP7、FN1、HNRNPA2B1、FLJ59422、SYNJ1、TLN2。根據(jù)DAVID分析結(jié)果以及對(duì)七個(gè)交叉基因的分析，認(rèn)為煙酒成癮與信號(hào)傳導(dǎo)與物質(zhì)運(yùn)輸之間存在重要的相關(guān)性，這對(duì)于臨床治療煙酒成癮具有一定的指導(dǎo)意義。通過對(duì)七個(gè)交叉基因的分析以及結(jié)合已有研究成果，查閱國內(nèi)外數(shù)據(jù)庫資料得知，其中IGFBP7、FN1、HNRNPA2B1基因與癌癥的發(fā)病與治療存在密切的聯(lián)系，SYNJ1基因與帕金森綜合征存在密切聯(lián)系。綜合這些基因的生物學(xué)功能及已有研究結(jié)果，推知吸煙與飲酒極有可能與惡性腫瘤的發(fā)病和預(yù)后存在直接或間接的相關(guān)性，對(duì)于疾病的預(yù)防和治療具有重要意義。