高效液相色譜法測定傷口護理產(chǎn)品中次沒食子酸鉍含量

北京市醫(yī)療器械檢驗所（101111）王利霞 崔永平 黃永富 岳衛(wèi)華

次沒食子酸鉍具有收斂、防腐的功效，外用于濕疹等皮膚病。此外，臨床上還經(jīng)常用于治療胃潰瘍，鉍制劑在胃潰瘍的治療中有其獨特的優(yōu)勢，它可以直接殺滅幽門螺桿菌，克服幽門螺桿菌對抗生素的原發(fā)耐藥和避免繼發(fā)耐藥，對胃黏膜有保護作用[1]。此外，次沒食子酸鉍常作為一種有效成分添加在傷口護理軟膏、傷口敷料等醫(yī)療器械產(chǎn)品中，應用于燒傷傷口表面的處理，內(nèi)外痔瘡的炎癥及出血癥狀的治療。常見的產(chǎn)品代表有：復方次沒食子酸鉍栓、傷口護理軟膏、傷口敷料等等。這些產(chǎn)品的技術要求或注冊產(chǎn)品標準中對次沒食子酸鉍的含量都有明確的規(guī)定，因此建立一種準確快速測定次沒食子酸鉍含量的方法，對該類醫(yī)療器械產(chǎn)品的質(zhì)量控制十分必要。目前尚未見次沒食子酸鉍含量測定的相關報道，但應用高效液相色譜法對其原料沒食子酸的含量測定有一些報道[2-5]，研究對象多為各類中藥材中的沒食子酸含量。本研究采用HPLC法測定傷口護理產(chǎn)品類醫(yī)療器械中的次沒食子酸鉍含量，為該類產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供檢測依據(jù)。次沒食子酸鉍的合成：用沒食子酸和硝酸鉍進行反應，生成次沒食子酸鉍，經(jīng)沉淀、過濾、洗滌、干燥后得到次沒食子酸鉍，見附圖1。

附圖1 次沒食子酸鉍合成路線

附圖2 次沒食子酸鉍標準品色譜圖

1 材料和方法

Agilent 1260高效液相色譜儀，配備紫外檢測器；電子天平（梅特勒-托利多公司）；次沒食子酸鉍對照品，純度：49.1%（以三氧化二鉍計），甲醇（色譜級，F(xiàn)isher）；磷酸（優(yōu)級純，國藥集團化學試劑有限公司，批號：T20101115）；氯仿（分析純，北京化工廠，批號：20160902），鹽酸（優(yōu)級純，北京化工廠，批號：20160508），水為milli Q純化水。昆山市超聲儀器有限公司超聲波清洗儀，傷口護理產(chǎn)品（由醫(yī)療器械生產(chǎn)廠家提供）；傷口敷料（由醫(yī)療器械生產(chǎn)廠家提供）。

1.1 儀器分析條件 用Agilent 1260高效液相色譜儀進行檢測，色譜柱：SunFireTMC18分析柱，（250mm×4.6mm，5μm）；檢測波長：254nm；流動相：甲醇：0.05%（v/v）磷酸=15∶85（v/v）；流速：1.0mL/min；柱溫：35℃；進樣體積：25μL。理論塔板數(shù)以次沒食子酸鉍計應不小于2000，保留時間為5.5min，次沒食子酸鉍色譜峰與相鄰峰的分離度大于1.5。

1.2 對照品溶液的制備 精密稱取次沒食子酸鉍對照品45mg，置于燒杯中，加入10mL 6N的鹽酸，超聲處理，直至次沒食子酸鉍完全溶解，轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶，用0.06N鹽酸定容至刻度，即得450μg/mL次沒食子酸鉍標準溶液儲備液。取儲備液適量用0.06N鹽酸逐級稀釋，得到濃度為2.25μg/mL、4.5μg/mL、18μg/mL、27μg/mL和45μg/mL一系列標準溶液。

1.3 供試品溶液的制備 精密稱取樣品（1.0g±0.1）g，置于燒杯中，加20mL氯仿，振搖，直至樣品完全溶解，轉(zhuǎn)移至100mL分液漏斗中，然后加入10mL 6N鹽酸，振搖2min，靜置10min后進行分液，繼續(xù)用0.06N鹽酸反復萃取3次，合并上層濾液至100mL容量瓶，用0.06N鹽酸定容至刻度。即得樣品儲備液。取5mL樣品儲備液置于50mL容量瓶，用0.06N鹽酸稀釋至刻度并混勻，即得供試品溶液。

2 方法學考察

2.1 系統(tǒng)適用性 按“1.1”項下的色譜條件，理論塔板數(shù)按次沒食子酸鉍峰計算約為15819，不低于2000。拖尾因子1.01，表明峰對稱性良好。目標峰前后均無干擾峰。色譜圖見附圖2。

2.2 線性范圍和檢出限 取1.2項下配制的次沒食子酸鉍標準溶液，按照1.1中色譜條件進行測定，得到各濃度的峰面積值，見附表1。以峰面積值（Y）為縱坐標，次沒食子酸鉍濃度（X）為橫坐標，繪制次沒食子酸鉍標準曲線并得到線性回歸方程為y=18.56x-15.09；R=0.9994，見附圖3。該結果表明在2.25～46.95μg/mL范圍內(nèi)線性關系良好。當稀釋對照品溶液濃度至0.09μg/mL時，其信噪比（S/N）等于3.0，故檢出限約為0.09μg/mL（S/N=3.0）。

附表1 次沒食子酸鉍標準溶液濃度對應峰面積值

2.3 精密度試驗 取濃度為45μg/mL標準溶液，按“1.1”項下的色譜條件連續(xù)進樣7次，記錄色譜圖，得到其峰面積，計算變異系數(shù)為0.51%。符合中國藥典2015年版規(guī)定的高效液相色譜外標法精密度要求（RSD不大于2%）[6]。表明方法精密度良好。

2.4 重復性 配制同一濃度的對照品溶液5份，按“1.1”項下的色譜條件進樣，記錄色譜峰面積，RSD為0.64%（n=5）。

2.5 加樣回收率實驗 取已知濃度的樣品溶液9份，分別加入0.45μg/mL、4.5μg/mL、27μg/mL三種濃度的標準溶液，每個濃度平行測試3份，記錄色譜峰面積，低、中、高濃度的平均回收率均在93.3%～104.4%，總平均回收率為98.2%，相對標準偏差為3.3%（n=9）。表明回收率良好。結果見附表2。

2.6 穩(wěn)定性試驗 取“1.2”項下的同一標準溶液，室溫放置0h、2h、4h、8h和24h，48h分別按“1.1”項下的色譜條件連續(xù)進樣分析，記錄峰面積，計算次沒食子酸鉍峰面積的RSD為0.9%。該結果表明次沒食子酸鉍在0.1N鹽酸水溶液中室溫放置至少48h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 樣品測定結果 用外標法測定了三種傷口護理產(chǎn)品中的次沒食子酸鉍含量，結果均滿足產(chǎn)品技術要求的規(guī)定。

3 討論

次沒食子酸鉍在水、乙醇、乙醚或氯仿中幾乎不溶，僅溶于熱的礦酸。本次檢測用于傷口護理的樣品中除了含有次沒食子酸鉍外，其余大部分是凡士林，根據(jù)這兩種物質(zhì)的溶解特性，結合次沒食子酸鉍對照品的溶解性能，選擇了用鹽酸水溶液跟氯仿萃取的形式，分離樣品中的次沒食子酸鉍，本文對加入鹽酸溶液的量、振搖時間、靜置時間都經(jīng)過優(yōu)化，最終確定加入20mL氯仿分散樣品，先用6N鹽酸溶液10mL進行萃取，然后每次加入0.06N鹽酸溶液10mL，萃取三次，以充分提取樣品中的次沒食子酸鉍。

本研究的結果證明，高效液相色譜法（HPLC）在2.25μg/mL～45μg/mL較寬的次沒食子酸鉍濃度范圍保持良好的線性關系。不同類醫(yī)療器械產(chǎn)品中，次沒食子酸鉍含量相差較大，HPLC標準曲線較寬的線性范圍則能很好的適應產(chǎn)品特點，有利于確保檢測的可靠性。同時精密度和回收率試驗也表明此方法準確度高，精密度好，可以滿足日常檢測傷口護理產(chǎn)品中次沒食子酸鉍含量的要求，且操作簡單，分析速度快，易于推廣。