擴散峰度成像動態(tài)定量檢測兔輕度腦外傷模型早期變化及其與β-淀粉樣前體蛋白陽性表達的相關(guān)性

熊婧彤，伍建林，張 清，沈 晶

(1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院放射科，遼寧 大連 116023；2.大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院放射科，遼寧 大連 116001)

輕度腦外傷(mild traumatic brain injury, mTBI)約占創(chuàng)傷性腦損傷的75%，WHO將其定義為腦外傷致短暫意識喪失小于30 min，短時記憶障礙或定向障礙小于24 h，或二者同時存在[1-2]。MR擴散峰度成像(diffusion kurtosis imaging, DKI)是基于DTI的非獨立成分多 b值擴散加權(quán)成像，可進行水分子非高斯分布組織異質(zhì)性分析，彌補DTI對腦灰質(zhì)結(jié)構(gòu)擴散不敏感等缺陷[3]。本研究旨在建立兔腦mTBI模型，觀察損傷早期DKI定量指標動態(tài)變化，并探討其與β-淀粉樣前體蛋白(β-amyloid precursor protein, β-APP)陽性表達的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1實驗對象與分組 健康6月齡新西蘭白兔15只[SPF級，由大連醫(yī)科大學(xué)標準動物實驗中心提供，實驗動物許可證號：SCXK(遼)2013-0003]，雌雄不限，體質(zhì)量2.25～2.90 kg，平均(2.52±0.34)kg，采用隨機數(shù)字表法分成損傷組12只(包括傷后6 h、24 h、48 h、72 h共4個亞組，每亞組3只)和對照組3只。本實驗通過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準。

1.2 模型建立與兔行為學(xué)觀察 參閱既往文獻[4]，采用自制快速旋轉(zhuǎn)致動物腦損傷裝置建模，實驗裝置由本課題組與大連現(xiàn)代高科技發(fā)展公司共同研制。將清醒兔保定于兔籠內(nèi)，快速旋轉(zhuǎn)90°，使千斤頂壓縮彈簧于儲能狀態(tài)瞬間釋放(相當于承受損傷角速度248.50～282.58 rad/s)產(chǎn)生的剪應(yīng)力致兔腦損傷。裝置模式圖及實物圖見圖1。建模后置實驗兔于空曠處，從運動、姿勢、意識、眼功能、呼吸等進行行為學(xué)觀察與記錄。常規(guī)MR檢查(T1W、T2W及Flair序列)呈陰性表現(xiàn)而實驗兔出現(xiàn)神經(jīng)功能方面癥狀為建模成功。對照組兔直接觀察其行為，之后進行MR檢查。

1.3 MR檢查 對損傷組兔分別在建模后超急性期(6 h)、急性期(24 h、48 h)、亞急性早期(72 h)采用3%戊巴比妥鈉50 mg/kg體質(zhì)量腹腔麻醉后行MR檢查；對照組兔觀察行為學(xué)后即刻麻醉，行MR檢查。應(yīng)用Siemens 3.0T Magnetom Verio 超導(dǎo)型MR掃描儀，8通道膝關(guān)節(jié)線圈。掃描序列包括T1W、T2W、T2 FLAIR及DKI序列，主要參數(shù)見表1。其中DKI序列b值為0、1 000、2 000 s/mm2，在30個方向上施加梯度磁場。

圖1 自制快速旋轉(zhuǎn)致兔腦損傷裝置示意圖(A)及實物圖(B)

參數(shù)T1WT2WT2 FLAIRDKITR(ms)1 7104 3004 3006 800TE(ms)2.39118109120層厚(mm)1.52.02.02.0掃描層數(shù)25252525FOV(mm×mm)150×150128×128128×128128×128帶寬(kHz)170260260752NEX2534

1.4 數(shù)據(jù)處理與測量 利用基于MatLab平臺的擴散峰度測量器(diffusion kurtosis estimator, DKE)軟件處理DKI數(shù)據(jù)[3]，解讀平均擴散峰度(mean kurtosis， MK)、軸向擴散峰度(axial kurtosis， K//)與徑向擴散峰度(radial kurtosis, K┴)數(shù)據(jù)信息，生成相應(yīng)圖像，見圖2。 應(yīng)用Image J軟件對ROI數(shù)據(jù)進行讀取與測量。參照兔腦解剖[5]，于腦白質(zhì)、丘腦、中腦、橋腦及延髓皮層下選取ROI，雙側(cè)對稱性、多層面放置ROI，每個ROI大小約1～3個像素；皮層下白質(zhì)ROI包括雙側(cè)額、頂、顳、枕葉白質(zhì)，每側(cè)各腦葉不少于3個，取其平均值；避開腦室/池系統(tǒng)、大血管、骨骼等。所有ROI放置及測量均由同一名熟練實驗者完成。

1.5 病理學(xué)檢查及觀察 MR掃描后即刻處死實驗兔，并迅速取腦組織，固定、包埋，行HE染色和β-APP免疫組化染色，計數(shù)ROI區(qū)每5個高倍視野(×400)下β-APP染色陽性軸突數(shù)，以軸突出現(xiàn)棕黃色顆粒狀沉積為陽性表達，取其平均值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 16.0統(tǒng)計分析軟件。計量資料為非正態(tài)分布時以中位數(shù)(上下四分位數(shù))表示，符合正態(tài)分布則以±s表示。采用多個獨立樣本秩和檢驗比較損傷組與對照組間MK、K//及K┴值的總體差異，并以兩獨立樣本秩和檢驗兩兩比較損傷組各亞組與對照組間的差異。采用單因素方差分析比較損傷組與對照組間各測量腦區(qū)β-APP染色陽性軸突數(shù)的總體差異，并以LSD-t檢驗兩兩比較損傷組各亞組與對照組間的差異。MK、K//及K┴值與β-APP染色陽性軸突數(shù)的相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兔mTBI建模及DKI定量檢測動態(tài)演變 建模后損傷組出現(xiàn)精神不振、蹲坐、活動減少、短暫性四肢行走拖曳、閉目、呼吸紊亂急促等神經(jīng)功能損傷癥狀，未見昏睡、昏迷，提示建模成功；其中1只兔因建模意外致顱頸分離死亡，后補充建模成功，建模成功率為92.31%(12/13)。對照組未見行為異常。損傷組MK值于皮層下白質(zhì)隨損傷時間呈一過性升高后持續(xù)減低趨勢，丘腦一過性減低后持續(xù)性升高，腦干區(qū)MK值始終高于對照組(P<0.05)。K//與K┴值于皮層下白質(zhì)、丘腦及中腦均表現(xiàn)為傷后24 h內(nèi)持續(xù)升高，至48 h一過性減低后再次升高趨勢，橋腦及延髓K//與K┴值均較對照組持續(xù)性升高(P均<0.05)。見圖2、表2～4。

2.2 mTBI兔腦病理學(xué)觀察 損傷組及對照組實驗兔腦大體標本無明顯肉眼可見腦挫裂傷、腦實質(zhì)損傷或血腫等改變(圖3A)。損傷組傷后6 h亞組兔見受損軸突增粗、呈紅色深染，神經(jīng)元輕度水腫，部分軸突β-APP染色見棕黃色顆粒沉積；傷后24 h亞組神經(jīng)元腫脹顯著，胞體增大、胞質(zhì)淡染；傷后48 h亞組軸突內(nèi)棕黃色顆粒沉積減少,大多軸突藍染呈陰性表現(xiàn)；傷后72 h亞組可見較多深染增粗軸突，散在固縮神經(jīng)元，胞質(zhì)呈深紅色，部分細胞核溶解(圖3)。兔腦損傷后β-APP陽性軸突數(shù)總體上始終高于傷前，呈逐漸增加后一過性減少又增加趨勢。見表5。

表2 各組實驗兔不同腦區(qū)MK值比較[中位數(shù)(上下四分位數(shù))]

注：*：與對照組比較，P<0.05；△：與損傷組傷后6 h亞組比較，P<0.05；▲：與損傷組傷后24 h亞組比較，P<0.05；◇：與損傷組傷后48 h亞組比較，P<0.05

表3 各組實驗兔不同腦區(qū)K//值比較[中位數(shù)(上下四分位數(shù))]

注：*：與對照組比較，P<0.05；△：與損傷組傷后6 h亞組比較，P<0.05；▲：與損傷組傷后24 h亞組比較，P<0.05；◇：與損傷組傷后48 h亞組比較，P<0.05

2.3β-APP陽性軸突表達與DKI測量值相關(guān)分析 除丘腦外，各測量腦區(qū)MK值均與β-APP陽性軸突數(shù)呈正相關(guān)；中腦K//值與β-APP陽性軸突數(shù)呈正相關(guān)；中腦、橋腦及延髓K┴值均與β-APP陽性軸突數(shù)均呈正相關(guān)。見表6。

3 討論

表4 各組實驗兔不同腦區(qū)K┴值比較[中位數(shù)(上下四分位數(shù))]

注：*：與對照組比較，P<0.05；△：與損傷組傷后6 h亞組比較，P<0.05；▲：與損傷組傷后24 h亞組比較，P<0.05；◇：與損傷組傷后48 h亞組比較，P<0.05

表5 各組實驗兔不同腦區(qū)β-APP陽性軸突數(shù)比較(±s)

表5 各組實驗兔不同腦區(qū)β-APP陽性軸突數(shù)比較(±s)

組別皮層下白質(zhì)丘腦中腦橋腦及延髓損傷組(n=12) 傷后6 h亞組4.83±1.47?6.71±2.87?13.80±3.19?14.20±3.27? 傷后24 h亞組4.67±1.86?9.00±4.30?7.33±1.37?△11.33±3.67? 傷后48 h亞組3.17±1.17?7.60±2.70?6.40±2.41?△▲5.67±0.52△▲ 傷后72 h亞組6.40±2.79?△11.33±3.39?△10.50±1.05?△▲◇11.00±3.54?◇對照組(n=3)1.00±0.891.67±1.211.43±1.132.83±1.17F值8.018.4235.8216.43P值<0.01<0.01<0.01<0.01

注：每一腦區(qū)觀察5個視野(×400)，取平均值；*：與對照組比較，P<0.05；△：與損傷組傷后6 h亞組比較，P<0.05；▲：與損傷組傷后24 h亞組比較，P<0.05；◇：與損傷組傷后48 h亞組比較，P<0.05

圖2兔腦MR圖(對照組為例) A～G.分別為兔腦傷前T1WI、T2WI、T2 FLAIR、MK、K//、K┴及DKI方向圖

表6 mTBI模型兔各測量腦區(qū)MK、K//、及K┴值與β-APP陽性軸突數(shù)的相關(guān)性分析

3.1 兔腦mTBI建模與測量腦區(qū)選擇 既往研究[6]發(fā)現(xiàn)，旋轉(zhuǎn)性致腦損傷模型可較好模擬臨床上腦剪切力作用產(chǎn)生的TBI。本研究損傷組實驗兔均出現(xiàn)不同程度神經(jīng)功能損傷癥狀，但未見明顯昏睡、昏迷，符合mTBI定義，且病理觀察發(fā)現(xiàn)兔腦組織內(nèi)存在神經(jīng)軸突微結(jié)構(gòu)損傷，進一步驗證建模有效，建模成功率高(12/13，92.31%)。本研究選取TBI易受累的皮層下白質(zhì)、丘腦、腦干進行觀察。目前國內(nèi)外對腦干區(qū)TBI研究較為寬泛，本研究將其細分為中腦、橋腦及延髓，

分別進行觀察，結(jié)果證實其DKI測量值與病理學(xué)動態(tài)變化均有不同，表明此分區(qū)觀察和研究具有意義。

3.2 DKI測量值動態(tài)演變及其病理學(xué)機制 MK值可反映水分子各向平均擴散峰度，其增高提示組織結(jié)構(gòu)復(fù)雜性增加，呈非正態(tài)分布的水分子擴散受限顯著,其降低則與組織微結(jié)構(gòu)破壞、缺血缺氧性改變致腦血流量減少有關(guān)[3,7]。根據(jù)K//與K┴值可對組織微結(jié)構(gòu)不同方向彌散擴散受限情況進行分析，二者數(shù)值越大，提示非高斯分布水分子擴散受限越顯著[8]。β-APP正常情況下在神經(jīng)元內(nèi)表達水平低，發(fā)生腦機械性損傷、缺血、缺氧等情況時可被誘導(dǎo)聚集[9]。本研究中傷后6 h亞組多數(shù)測量腦區(qū)MK、K//與K┴值均較對照組增高，系瞬間剪應(yīng)力致離子泵功能障礙，造成細胞毒性水腫，擴散受限，病理表現(xiàn)為軸突及神經(jīng)元輕度腫脹；同時激活半胱氨酸蛋白酶降解軸突骨架結(jié)構(gòu)，軸突斷裂、運輸中斷，β-APP異常聚集，故陽性軸突數(shù)增多(P<0.05)[10]。部分腦區(qū)傷后48 h DKI測量值出現(xiàn)一過性減低的“拐點”，β-APP陽性軸突數(shù)減少，系軸突斷裂處軸漿外溢、代償性自發(fā)修復(fù)減輕軸突腫脹，組織微結(jié)構(gòu)擴散受限情況好轉(zhuǎn)；另一方面此階段激活β-分泌酶限制β-APP生成，間接加速其清除[11]。至傷后72 h 可見較多陽性表達的形態(tài)多樣受損軸突及神經(jīng)元，組織微結(jié)構(gòu)復(fù)雜性增加，擴散受限顯著，導(dǎo)致DKI測量升高。

圖3兔腦病理學(xué)觀察 A.正常兔腦組織大體圖； B～F.依次為正常、mTBI損傷后6 h、24 h、48 h、72 h 橋腦HE染色病理圖(×400)； G～K.依次為正常、mTBI損傷后6 h、24 h、48 h、72 h橋腦β-APP染色病理圖(×400) (箭示mTBI損傷軸突；箭頭示正常軸突)

3.3 DKI測量值與β-APP陽性表達的相關(guān)性 本研究中各腦區(qū)DKI測量值大多與β-APP陽性軸突數(shù)呈正相關(guān)，表明其可較好反映組織結(jié)構(gòu)微損傷情況，同時提示腦干對mTBI損傷敏感，與既往研究結(jié)果[12]一致。這是由于腦干白質(zhì)含量豐富、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，在灰質(zhì)與白質(zhì)間存在大面積網(wǎng)狀纖維結(jié)構(gòu)交織，包含重要生命中樞，其臨床意義在于可通過檢測腦干區(qū)功能MR測量值變化評估m(xù)TBI組織微結(jié)構(gòu)損傷情況。此外，本研究發(fā)現(xiàn)中腦、橋腦及延髓DKI測量值變化趨勢及其與病理學(xué)相關(guān)性存在差異，推測與其解剖微結(jié)構(gòu)差異有關(guān)。中腦含有紅核、黑質(zhì)等重要神經(jīng)核團，通過錯綜復(fù)雜的白質(zhì)纖維與其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)相聯(lián)系，而橋腦及延髓白質(zhì)纖維走行相對一致，故承受垂直于腦干長軸方向的剪切力作用后微結(jié)構(gòu)損傷有所差異。

本研究局限性在于：TBI模型不能完全涵蓋人TBI時所承受的加速、減速、過負荷等作用，損傷動物存活時間相對較短、數(shù)量有限，難以評估TBI遠期后遺癥。

總之,DKI技術(shù)可作為早期定量評估m(xù)TBI組織微結(jié)構(gòu)病理損傷的有效檢查方式。