槲皮素對小鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎癥的影響

賈慶運 王擁軍 梁倩倩 施杞*

1. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海 200032 2. 上海中醫(yī)藥大學(xué)脊柱病研究所，上海 200032 3. 上海中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，上海 200120 4. 筋骨理論與治法教育部重點實驗室，上海 200120

膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis, CIA)是最常用的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)的動物模型，其在臨床癥狀和病理表現(xiàn)方面與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎極為相似或相同(諸如關(guān)節(jié)滑膜增生、關(guān)節(jié)翳形成和軟骨破壞等)，因此, CIA是研究RA較為理想和常用的動物模型[1, 2]。槲皮素(Quercetin)是一種廣泛存在于自然界的的黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、清除氧自由基以及免疫調(diào)節(jié)等活性。臨床研究表明，槲皮素對緩解膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)、運動后機體疼痛具有良好的作用[3-7]。本研究以膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠為RA模型，通過觀察槲皮素對CIA小鼠的改善情況，進(jìn)一步為臨床應(yīng)用本方提供新的實驗的依據(jù)。

1 試驗材料

1.1 實驗動物

SPF級雄性DBA/1 J小鼠，40只，6-7周齡，購于北京北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心。

1.2 試劑及藥物

槲皮素(Quercetin)購成都普菲德生物技術(shù)有限公司純度>98%(批號：JOT-10049)，牛屬II型膠原(Bovine type Ⅱ collagen)(Chondrex Inc)，完全弗氏佐劑(complete Freund’s adjuvant) (Chondrex In)，不完全弗氏佐劑(incomplete Freund’s adjuvant) (Chondrex Inc), 甲氨蝶呤(上海東方藥品科技實業(yè)有限公司)。

1.3 儀器

電子天平，游標(biāo)卡尺，OLYMPUS BX50顯微鏡，制冰機等。

2 方法

2.1 藥物制備

槲皮素200 mg溶于40 mL的5%CMC-Na制成混懸液，濃度50 mg/mL甲氨蝶呤3 mg溶解于30 mL生理鹽水中，制成甲氨蝶呤溶液，濃度為0.1 mg/mL。查閱相關(guān)文獻(xiàn)確定槲皮素素小鼠給藥濃度為50 mg/kg·d灌胃，甲氨蝶呤給藥濃度為0.5 mg/kg，每3天1次腹腔注射。

2.2 CIA小鼠模型的建立

6-7周齡40只的DBA/1 J小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，運用SPSS軟件進(jìn)行隨機分為對照組、模型組、甲氨蝶呤組和槲皮素組，每組10只，除10只正常對照組外，其余30只小鼠進(jìn)行CIA造模。將10 mg牛Ⅱ型膠原溶于0.01 mmol/L的醋酸溶液5 mL，4 ℃搖床過夜，取5 mL含2 mg/mL的完全弗氏佐劑等體積混合，20 mL注射器連接裝置4 ℃來回抽吸2000次充分乳化，制得抗原乳劑，并置4 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆?。首次免疫于小鼠尾根部皮下注射Ⅱ型膠原乳劑0.1 mL，造模第21天取0.1 mLⅡ型膠原和不完全弗氏佐劑混合的乳劑進(jìn)行加強免疫1次; 正常組同法注射等體積生理鹽水。

2.3 動物分組給藥

二次免疫后第1天開始給藥，槲皮素組給予0.2 mL混懸液灌胃，甲氨蝶呤組給予 0.1 mL甲氨蝶呤溶液腹腔注射，每3天1次，正常對照組和模型組給予0.2 mL生理鹽水灌胃，各組連續(xù)給藥30天。

2.4 指標(biāo)檢測

體重：小鼠于造模第0、5、10、15、20、35、40、45、50天測體重。關(guān)節(jié)炎指數(shù)：小鼠給藥后第0、5、10、15、20、25、30天給予關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)評分，評分標(biāo)準(zhǔn)[8, 9]0分：沒有明顯的關(guān)節(jié)紅腫；1分:踝關(guān)節(jié)或趾關(guān)節(jié)輕度紅腫；2分：從趾關(guān)節(jié)到踝關(guān)節(jié)輕度紅腫；3分：從趾關(guān)節(jié)到踝關(guān)節(jié)中度紅脹；4分：嚴(yán)重的踝關(guān)節(jié)到整個足掌的紅腫，每只小鼠最高評分16分。足掌厚度：小鼠給藥后第0、5、10、15、20、25、3天0給予選取腫脹的足掌給予測腫脹的厚度，用游標(biāo)卡尺選取腫脹最甚處測量，單位為mm。受累足掌數(shù)：小鼠給藥后第0、5、10、15、20、25、30天給予記錄小鼠受累足掌數(shù)，每只小鼠最高評分4分。病理學(xué)評分： 給藥第30天后給予小鼠處死，取小鼠踝關(guān)節(jié)多聚甲醛固定，24 h后給予EDTA脫鈣、石蠟包埋、切片、HE病理學(xué)染色。顯微鏡下觀察各組小鼠關(guān)節(jié)滑膜增生、炎性細(xì)胞浸潤、血管翳形成、軟骨和骨侵蝕方面行病理學(xué)評分，按正常和輕、中、重度異常分別計 0～3 分，評分標(biāo)準(zhǔn)[10]0分：正常滑膜組織；1分: 滑膜增生，炎性細(xì)胞浸潤；2分：血管翳形成，軟骨侵蝕；3分：軟骨破壞伴軟骨下骨侵蝕。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

統(tǒng)計結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行描述，應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，進(jìn)行單因素方差分析，以P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 槲皮素對CIA小鼠體重的影響

與正常對照組相比，各造模組小鼠體重均有不同程度的降低，治療后各組體重均較模型組降低減少，各組間體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。(圖1)

3.2 槲皮素對CIA小鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響

二次免疫后第2天開始，模型組小鼠開始炎癥反應(yīng)期，前后足踝關(guān)節(jié)開始紅腫，關(guān)節(jié)炎指數(shù)明顯增加，治療30天后，與模型組相比槲皮素組和甲氨蝶呤組顯著降低小鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(槲皮素組與模型組比較*P<0.05，甲氨蝶呤組與模型組比較#P<0.05)。(圖2)

圖1 槲皮素對CIA小鼠體重的影響Fig.1 Effect of quercetin on body weight in CIA mice

圖2 槲皮素對CIA小鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響Fig.2 Effect of quercetin on the arthritis index in CIA mice

圖3 槲皮素CIA小鼠足掌腫脹厚度的影響Fig.3 Effect of quercetin on paw swelling of CIA mice

3.3 槲皮素對CIA小鼠足掌腫脹厚度的影響

造模20天后，與對照組相比各模型組小鼠出現(xiàn)不同程度足掌腫脹，治療后30天后，與模型組相比槲皮素組和甲氨蝶呤組顯著降低小鼠足掌的腫脹厚度，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(槲皮素組與模型組比較*P<0.05，甲氨蝶呤組與模型組比較#P<0.05)。(圖3)

3.4 槲皮素對CIA小鼠踝關(guān)節(jié)病理學(xué)形態(tài)及病理學(xué)評分的影響

治療后30天后，小鼠踝關(guān)節(jié)常規(guī)取材、脫水、包埋、切片、HE染色，正常組小鼠的踝關(guān)節(jié)病理切片顯示關(guān)節(jié)間隙正常清晰，軟骨表面光滑，無明顯的滑膜增生及炎癥細(xì)胞的浸潤，模型組小鼠踝關(guān)節(jié)顯示大量炎癥細(xì)胞的浸潤和滑膜的增生、關(guān)節(jié)軟骨和骨的破壞，與模型組相比槲皮素組和甲氨蝶呤組踝關(guān)節(jié)炎癥細(xì)胞的浸潤和滑膜增生、關(guān)節(jié)軟骨和骨的破壞明顯減輕，病理評分明顯降低，與模型組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(槲皮素組與模型組比較*P<0.05，甲氨蝶呤組與模型組比較#P<0.05)。(圖4)

4 討論

圖4 槲皮素對CIA小鼠踝關(guān)節(jié)病理學(xué)形態(tài)及病理學(xué)評分的影響Fig.4 Effect of quercetin on pathological morphology and pathological score

槲皮素是人類飲食中最主要的生物類黃酮類化合物，廣泛存在于植物的花、葉、果實中[11, 12]。槲皮素具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等作用[13-17]，相關(guān)研究表明槲皮素可有效減輕免疫細(xì)胞炎癥因子的分泌的作用[18-21]，這種抑制作用可能和槲皮素因抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的生物活性相關(guān)[22]。相關(guān)臨床觀察性研究表明，槲皮素對疼痛類疾病的緩解具有良好的作用，對于骨性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的疼痛的緩解同樣效果良好[4, 5, 23-30]。

膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠模型(CIA模型)是目前應(yīng)用較廣泛和成熟的動物實驗?zāi)Ｐ停湓谕庠隗w征、發(fā)病機制、病理改變及實驗室指標(biāo)等方面與人類類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)相似，是目前最適合用于研究人類RA的動物模型。本研究通過CIA小鼠模型模擬RA疾病的發(fā)生發(fā)展過程，觀察槲皮素對于CIA小鼠模型的作用，結(jié)果顯示槲皮素可有效的減輕CIA小鼠的關(guān)節(jié)炎癥，減輕關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)、足掌的腫脹厚度，同時可有效的減輕CIA小鼠關(guān)節(jié)的病理表現(xiàn)，減輕關(guān)節(jié)滑膜的增生、炎性細(xì)胞浸潤、血管翳形成、軟骨和骨侵蝕。

綜上所述，槲皮素可有效的減輕CIA小鼠的腫脹厚度，降低關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)，減輕關(guān)節(jié)的破壞從而發(fā)揮其抗炎作用，槲皮素是治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的潛在有效藥物。