siRNA下調(diào)THBS4對人骨肉瘤MG63增殖的影響

謝冰穎 李生強(qiáng) 謝麗華 陳娟 葛繼榮

福建省中醫(yī)藥研究院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 骨質(zhì)疏松證候基因組學(xué)研究室，福建 福州 350003

血小板反應(yīng)蛋白(Thrombospondin)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)產(chǎn)生的一類機(jī)體在受損、重建或重修飾的組織細(xì)胞中產(chǎn)生的蛋白，它能調(diào)控其他蛋白的表達(dá)，幫助糾正或清除錯誤折疊、無功能意義的蛋白。課題組前期的人骨組織芯片檢測中，我們發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)疏松癥患者股骨血小板反應(yīng)蛋白4(Thrombospondin 4，THBS4)表達(dá)出現(xiàn)降低[1]，已有報道THBS4在心臟功能[2,3]、血管新生[4]、腫瘤[5]中起著重要作用，但其在成骨過程中的作用需要進(jìn)一步研究。本研究采用siRNA敲低MG63細(xì)胞中THBS4的表達(dá)，觀察其對MG63細(xì)胞株成骨功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人骨肉瘤細(xì)胞株MG63購自武漢大學(xué)細(xì)胞庫。DMEM培養(yǎng)基購自美國Thermol，胎牛血清、胰蛋白酶購自美國Gibco公司。二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司。鼠抗人Thbs4、兔抗β-actin以及兔抗TGF-beta1購自美國Thermol。Primer Script Rtreagent kit, Real time PCR kit 購自寶生物工程(大連)公司，THBS4-siRNA及陰性對照，轉(zhuǎn)染試劑均購自廣州市銳博生物科技有限公司。ECL試劑購自Thermol。多功能酶標(biāo)儀(美國賽默飛Thermol)，實時熒光定量PCR儀ABI 7500fast(美國ABI公司),多功能成像工作站FluorChem M(美國Proteinsimple公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

MG63培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于5% CO2、37 ℃中傳代培養(yǎng)，并取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗。

1.3 siRNA瞬時轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前24 h將細(xì)胞以每孔0.8×105的密度接種于24孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞處于對于生長期并且融合度達(dá)60%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分為實驗組，陰性對照組和空白組。前兩組分別轉(zhuǎn)染特異性Thbs4 siRNA和陰性對照siRNA，空白對照組細(xì)胞不做任何處理。轉(zhuǎn)染方法參照廠家說明書進(jìn)行。實驗重復(fù)3次。轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞用于定量PCR實驗，72 h收集細(xì)胞用于蛋白質(zhì)印跡實驗。

1.4 CCK-8增殖實驗

在24孔培養(yǎng)板中進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，在細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24、48、72、96 h，每孔分別加入2 μL CCK-8，放回CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1 h，于多功能酶標(biāo)儀上檢測450 nm吸光度。

1.5 實時熒光定量PCR檢測mRNA表達(dá)水平

采用Trizol方法抽提總RNA后，逆轉(zhuǎn)錄過程按照SYBR Prime ScriptTMRT-PCR Kit II試劑盒說明操作。以GAPDH為內(nèi)參，并設(shè)3個重復(fù)管，進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測。PCR反應(yīng)體系的反應(yīng)步驟：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)，并增加熔解曲線程序，以觀察PCR產(chǎn)物是否單一。各基因引物序列，產(chǎn)物大小見表1。各樣品的目的基因和管家基因分別進(jìn)行定量 PCR反應(yīng)。mRNA相對表達(dá)量以2-△△Ct表示， △Ct=(Ct 目的基因 - Ct GAPDH)； 以對照組作為基線，采用以下公式計算目的基因 mRNA表達(dá)差異倍數(shù)(folds change)=2-△△Ct， 其中△△Ct=(Ct 目的基因-Ct GAPDH)實驗組 -(Ct目的基因- Ct GAPDH)對照組。

表1 定量PCR實驗引物序列Table 1 Sequences of primers for Real-time PCR

1.6 蛋白表達(dá)水平檢測

轉(zhuǎn)染72 h后，胰蛋白酶消化MG63細(xì)胞，收集細(xì)胞，置冰上采用細(xì)胞裂解液進(jìn)行細(xì)胞裂解、提取總蛋白，以BCA法進(jìn)行蛋白定量。上樣30μg/孔， SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，100 V濕轉(zhuǎn)60 min，含5%脫脂奶粉的TBST液封閉2h，鼠抗THBS4(1∶400)、兔抗TGF-beta(1∶500)、兔抗β-actin(1∶1000)4℃孵育過夜。第二天，TBST洗滌10 min×3次后，羊抗兔二抗(1∶1000)室溫孵育2 h，洗滌后Thermol ECL顯色，置入多功能成像工作站進(jìn)行曝光記錄。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 MG63的鑒定

在相差顯微鏡下，人骨肉瘤細(xì)胞貼壁生長，細(xì)胞呈梭形。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，由于轉(zhuǎn)染試劑的毒性，有少量細(xì)胞死亡，大部分MG63仍呈梭形，見圖1。

2.2 THBS4 siRNA轉(zhuǎn)染后對細(xì)胞增殖的影響

在轉(zhuǎn)染后不同時間點，采用 CCK-8檢測3組吸光度值 (optical density，OD)，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染后48 h，72 h，實驗組OD值高于陰性對照組(P<0.05)，差異具有顯著性。表明siRNA轉(zhuǎn)染后能促進(jìn)骨肉瘤 MG63 增殖，見圖2。

圖2 CCK-8檢測不同階段對MG63細(xì)胞增殖的影響與陰性對照組相比，*P<0.05Fig.2 The proliferation of MG63 cells at different stages detected with CCK-8 Compared with negative control group,*P<0.05

2.3 THBS4 siRNA對 mRNA表達(dá)影響

Real-time PCR檢測結(jié)果顯示，siRNA轉(zhuǎn)染后，與陰性對照組相比，實驗組THBS4 mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)。陰性對照組與空白組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。轉(zhuǎn)染后，實驗組TGF-beta1 mRNA表達(dá)水平顯著提高(P<0.01)，見圖3。

圖3 THBS4 siRNA對 MG63細(xì)胞mRNA表達(dá)影響與陰性對照組相比，**P<0.01Fig.3 Effect of THBS4 siRNA on the expression of mRNA in MG63 cells Compared with negative control group,**P<0.01

2.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測THBS4 siRNA轉(zhuǎn)染后蛋白表達(dá)

結(jié)果顯示， siRNA轉(zhuǎn)染后，與陰性對照組相比，實驗組THBS4 蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)。陰性對照組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。轉(zhuǎn)染后，實驗組TGF-beta1 蛋白表達(dá)水平顯著提高(P<0.01)，比陰性對照組提高1.7倍。

圖4 THBS4 siRNA對 MG63細(xì)胞蛋白表達(dá)影響與陰性對照組相比，**P<0.01Fig.4 Effect of THBS4 siRNA on the expression of proteins in MG63 cell Compared with negative control group,**P<0.01

3 討論

血小板反應(yīng)蛋白家族(Thrombospondins family, THBS)是一組進(jìn)化保守的，可以短暫的或長期的與細(xì)胞外其他間質(zhì)發(fā)生作用，需要鈣結(jié)合的細(xì)胞外間質(zhì)蛋白，參與眾多生物過程，發(fā)揮包括細(xì)胞間橋接，細(xì)胞與基質(zhì)的相互作用[2]。目前發(fā)現(xiàn)的—共有5個成員，分別是THBS1、THBS2、THBS3、THBS4和THBS5[6]。

THBS4是一種分泌型蛋白，最早由Lawler J[7]于1993年發(fā)現(xiàn)。THBS4有明顯的組織表達(dá)差異性，在心臟、骨骼肌及肌腱[8]中大量表達(dá)。它能與膠原和非膠原結(jié)合，可以調(diào)控細(xì)胞遷移、細(xì)胞增殖、連接、粘附、血管生成、神經(jīng)發(fā)育、組織架構(gòu)、器官發(fā)育，在疼痛信號傳導(dǎo)和腫瘤[9-11]的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。近年來，THBS4在腫瘤中的研究越來越多，它在胃癌[12,13]、前列腺癌中[14]高表達(dá)，具有識別腫瘤生物學(xué)特性的潛能并可能用于臨床腫瘤早期診斷和預(yù)后判斷。課題組前期的人骨組織芯片檢測中，骨質(zhì)疏松癥患者股骨THBS4表達(dá)下調(diào)[1]。在本研究中，THBS4特異性siRNA可以顯著降低THBS4的mRNA及蛋白表達(dá)，CCK-8實驗表明對細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用。

轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)是骨組織中重要的細(xì)胞因子[15]，廣泛存在于正常組織及轉(zhuǎn)化細(xì)胞中，以骨組織和血小板中的含量最為豐富，TGF-β有5 種異構(gòu)體，即TGF-β1-5，其中最早發(fā)現(xiàn)和研究最充分的是TGF-β1。研究證實[16]，TGF-β1 能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化，刺激細(xì)胞外基質(zhì)合成，同時還能降低骨轉(zhuǎn)換，促進(jìn)骨與軟骨的形成，加快破骨細(xì)胞的凋亡。TGF-β對骨的生長發(fā)育及重建都有重要的調(diào)節(jié)功能，是參與調(diào)節(jié)骨重建最重要、最基本的細(xì)胞因子之一[17]。Muppala S 等發(fā)現(xiàn)THBS4參與了TGF-β1誘導(dǎo)的血管新生，說明THBS4能夠參與TGF-β1信號通路[18]。本實驗中，實驗組采用siRNA敲低THBS4后，TGF-β1能顯著提高，表明敲低THBS4后可以激活TGF-β1信號通路。考慮到TGF-β對骨的生長發(fā)育的重要性，敲低THBS4可能提高M(jìn)G63成骨能力。后期實驗可檢測成骨過程中的關(guān)鍵基因、蛋白的變化，證實對成骨的影響。

THBS4作用機(jī)制比較復(fù)雜，也存在著對立的報道。在腫瘤的研究中，多種腫瘤研究數(shù)據(jù)顯示THBS4過表達(dá)，至少在轉(zhuǎn)錄水平上存在差異。多數(shù)數(shù)據(jù)支持可能起到刺激腫瘤細(xì)胞增殖，有利于腫瘤細(xì)胞浸潤和轉(zhuǎn)移的作用，但也有數(shù)據(jù)顯示可能發(fā)揮著抑癌基因的作用[11]。在最近的報道中，Anke J[19]等發(fā)現(xiàn)基因敲除小鼠THBS4并沒有影響骨骼的生長，但會引起短暫的軟骨厚度減少。這與本文的結(jié)果有些不一致。分析原因，可能是基因發(fā)揮生物學(xué)功能不但取決于細(xì)胞類型、細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，還受到激素的控制[20]。THBS4在骨組織中的功能，尤其在軟骨發(fā)育中的作用還需要進(jìn)一步研究。