遠(yuǎn)緣雜交甜菜M14野生基因相關(guān)性狀的研究

鄭佳玲，劉麗萍

摘要：通過遠(yuǎn)緣雜交的方法獲得了附加1條野生白花甜菜染色體，并且能穩(wěn)定高頻傳遞的單體附加系甜菜M14（Beta vulgaris L.，VV+1C、2n=18+1），白花甜菜染色體積極參與雜種細(xì)胞的代謝活動(dòng)，白花甜菜9號(hào)染色體是遠(yuǎn)緣雜交甜菜M14高頻傳遞與繁殖的遺傳物質(zhì)載體，具有抗寒、抗旱、高糖、抗褐斑病及叉根性等遺傳學(xué)性狀。對(duì)甜菜M14小孢子發(fā)生與雌配子體發(fā)育研究發(fā)現(xiàn)，在雄配子體發(fā)生過程中，由單核小孢子到二細(xì)胞花粉形成期間有精核退化或消失致使花粉敗育達(dá)85%以上。由于附加1條野生白花甜菜染色體嚴(yán)重影響甜菜M14雄配子體的分化與發(fā)育導(dǎo)致其結(jié)實(shí)率低下。雌配子體發(fā)育研究證明，甜菜M14屬于配子體無融合生殖中的二倍孢子體（diplospory）兼性無融合生殖體，討論了遠(yuǎn)緣雜交甜菜M14附加的白花甜菜染色體對(duì)遺傳育種及野生甜菜優(yōu)質(zhì)基因利用的價(jià)值。

關(guān)鍵詞：甜菜；遠(yuǎn)緣雜交；野生基因；相關(guān)性狀

基金項(xiàng)目：功能無機(jī)材料化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目“甜菜染色體操縱遺傳學(xué)研究”（項(xiàng)目編號(hào)：201606）；黑龍江省創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)A類訓(xùn)練項(xiàng)目“遠(yuǎn)緣雜交甜菜野生基因相關(guān)性狀的研究”項(xiàng)目編號(hào)：（201810212120）

中圖分類號(hào)： S566 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A DOI編號(hào)： 10.14025/j.cnki.jlny.2018.20.029

甜菜遠(yuǎn)緣雜交是將野生種有益基因轉(zhuǎn)移到栽培甜菜的主要措施，也是擴(kuò)大優(yōu)質(zhì)基因庫(kù)的重要途徑[1]。通過遠(yuǎn)緣雜交獲得的近100%高頻傳遞材料單體附加系甜菜M14具有非常重要的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用潛力。

Jassem B[2].（1990）報(bào)道白花甜菜組（Corollinae Section）的各物種都存在無融合生殖能力。單體附加系甜菜M14屬于配子體兼性無融合生殖材料（VV+1C，2n=2x+1=19）。從1988年開始對(duì)栽培甜菜、沿海甜菜、葉用甜菜、白花甜菜、平匐甜菜、小碗花甜菜等進(jìn)行種間遠(yuǎn)緣雜交，其中主要的雜交組合是栽培甜菜（B.vulgaris）與白花甜菜（B.corolliflora Zoss）的種間雜交。黑龍江大學(xué)郭德棟教授成功地將帶有無融合生殖基因的白花甜菜9號(hào)染色體轉(zhuǎn)移到普通栽培甜菜上，使只進(jìn)行有性生殖的栽培甜菜可高效表達(dá)無融合生殖特性[3-5]，具有非常重要的應(yīng)用前景。

核型分析結(jié)果表明[6-8]：?jiǎn)误w附加系M14中甜菜各物種的染色體是穩(wěn)定的，附加的1條白花甜菜染色體所攜帶的特異基因致使單體附加系甜菜M14的高頻傳遞特性得以表達(dá)。郭德棟等[9-12]利用“Microdissection”技術(shù)在南開大學(xué)成功分離白花甜菜9號(hào)染色體，方曉華[7]等成功構(gòu)建白花甜菜人工染色體BAC文庫(kù)并建成白花甜菜9號(hào)染色體特異性探針池，共49920個(gè)克隆，平均插入片段127kb，覆蓋染色體基因組7.5倍[13-15]。利用白花甜菜特異的散在重復(fù)序列作為探針篩選附加的第9號(hào)染色體的BAC共2377個(gè)，覆蓋附加的染色體3.4倍[16，18-19]。李海英等[20-23]利用無融合生殖甜菜花期mRNA對(duì)白花甜菜9號(hào)染色體的BAC芯片進(jìn)行差異雜交，發(fā)現(xiàn)2個(gè)BAC克隆含有M14花期特異表達(dá)的基因。戈巖等[17]對(duì)單體附加系甜菜M14進(jìn)行熒光原位雜交，供試探針被定位于附加的白花甜菜第9號(hào)染色體的長(zhǎng)臂末端[27]。胚胎學(xué)研究判定單體附加系甜菜具有兼性無融合生殖特性[24-26]。目前為止，查閱國(guó)內(nèi)外相關(guān)資料顯示，尚沒有對(duì)單體附加系甜菜M14野生基因相關(guān)性狀的研究報(bào)道。本文報(bào)道彌補(bǔ)了遠(yuǎn)緣雜交甜菜研究的不足，為甜菜遠(yuǎn)緣雜交材料的深入研究提供了基礎(chǔ)理論依據(jù)，拓展了甜菜野生基因優(yōu)勢(shì)的利用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

遠(yuǎn)緣雜交甜菜單體附加系M14由黑龍江大學(xué)提供，黑龍江大學(xué)甜菜課題組鑒定其為兼性無融合生殖材料（VV+1C，2n=2x+1=19）。

鹽酸、冰乙酸、甘油、醋酸洋紅、無水乙醇、70%乙醇、8-羥基喹啉、石碳酸、甲醛、山梨醇、中性樹膠、二甲苯。染色液為改良苯酚品紅和醋酸洋紅。

1.2 儀器與設(shè)備

OLYMPUS-BX51顯微鏡（日本OLYMPUS公司）、普通光學(xué)顯微鏡（國(guó)產(chǎn)）、解剖鏡（國(guó)產(chǎn)）。

1.3 方法

1.3.1 甜菜M14細(xì)胞及遺傳性狀調(diào)查 （1）附加白花甜菜染色體檢查：取材：早8：00取樣，取樣部位：甜菜心葉，用0.002M/L8-羥基喹啉預(yù)處理2h，卡諾固定液（乙醇與冰乙酸體積比為3∶1）固定4h，用等體積的鹽酸和乙醇解離，水洗，改良?jí)A性品紅染色，壓片，觀察，拍照。（2）花粉敗育檢測(cè)：為進(jìn)一步研究甜菜無融合生殖的機(jī)理于單體附加系M14植株田間花期取花絮固定，解剖鏡分離花藥，利用壓片技術(shù)觀察甜菜單體附加系M14品系花粉發(fā)生發(fā)育，醋酸洋紅染色觀察甜菜M14花粉母細(xì)胞的發(fā)育情況，OLYMPUS-BX51顯微觀察并拍照。

1.3.2 空中搭載實(shí)驗(yàn) 將附加1條野生白花甜菜染色體的單體附加系甜菜M14的種子通過中科院物理所進(jìn)行空中搭載實(shí)驗(yàn)后返回田間進(jìn)行種植，并調(diào)查其相關(guān)生物學(xué)性狀。

2 結(jié)果與分析

2.1 遠(yuǎn)緣雜交獲得的單體附加系甜菜M14

利用栽培甜菜（B.vulgaris L.）與白花甜菜（B.corolliflora Zoss）種間雜交及回交，獲得了1個(gè)近100%穩(wěn)定傳遞的單體附加系甜菜M14植株。栽培甜菜和白花甜菜的種間雜交，通過自然重組，成功將1條白花甜菜染色體導(dǎo)入普通栽培甜菜獲得單體附加系甜菜M14（2n=18+1），有絲分裂中期染色體形態(tài)如圖1所示。

2.2 空中搭載實(shí)驗(yàn)含糖量檢測(cè)

經(jīng)過連續(xù)4年的含糖量檢測(cè)，對(duì)單體附加系甜菜M14和空中搭載實(shí)驗(yàn)Am14材料隨機(jī)抽檢50株母根，M3為對(duì)照組普通栽培甜菜。檢測(cè)結(jié)果：對(duì)照組M3普通栽培甜菜含糖量的最高值、最低值和平均值均低于M1和M2?？罩写钶d的甜菜M2和未進(jìn)行空中搭載的M1差異不顯著。結(jié)果如表1所示。

2.3 野生基因相關(guān)性狀調(diào)查

遺傳學(xué)性狀是區(qū)分甜菜遠(yuǎn)緣雜交后代的重要標(biāo)志。對(duì)遠(yuǎn)緣雜交甜菜野生基因相關(guān)性狀研究每年都要進(jìn)行，包括：根、莖、葉；花、果實(shí)、種子；結(jié)實(shí)率、發(fā)芽率、出苗率、植株繁茂程度、植株高矮、抽薹類型、花期早晚、花藥敗育情況調(diào)查；根型、大小、叉根性等。本文對(duì)100株遠(yuǎn)緣雜交甜菜的野生基因性狀和育性特征進(jìn)行了調(diào)查，抽薹在6～7月份；花期6～8月份；結(jié)實(shí)在9～10月份；結(jié)實(shí)率調(diào)查在10～11月份；根形特征調(diào)查和含糖量檢測(cè)在冬季。甜菜M14育性特征檢測(cè)結(jié)果如表2所示。

2.4 甜菜單體附加系M14花粉育性檢測(cè)結(jié)果

單體附加系甜菜M14花粉敗育現(xiàn)象比較突出，成熟花藥為棕褐色，利用解剖鏡分離初期幼小花藥，通過壓片法對(duì)甜菜M14的花藥及花粉育性進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，普通栽培甜菜小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂步驟一致，但是，單體附加系甜菜M14的同一花藥小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂行為頻率不同。處于正常減數(shù)分裂狀態(tài)的只有3.5%左右。而85%以上的花粉敗育是絨氈層細(xì)胞過早解體，如圖所示，花粉育性檢測(cè)結(jié)果驗(yàn)證了單體附加系甜菜M14為兼性無融合生殖材料的理論基礎(chǔ)。花粉敗育絨氈層解體特征如圖2所示。

3討論

3.1遠(yuǎn)緣雜交甜菜M14附加的白花甜菜染色體對(duì)遺傳育種的影響

野生白花甜菜染色體攜帶的基因能夠穩(wěn)定高頻傳遞后代。甜菜遠(yuǎn)緣雜交可深入研究種間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。胚胎學(xué)鑒定為單體附加系甜菜M14為兼性無融合生殖體。細(xì)胞學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，有性生殖比率占3.5%，無融合生殖比率占96.5%。雖然有性生殖比率低，但是其繁殖能力超強(qiáng)，無融合生殖甜菜由于雄配子體發(fā)生過程中出現(xiàn)異常，絨氈層過早解體導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)受到阻滯，以至于花粉敗育率高、繁殖能力低下、結(jié)實(shí)率偏低的結(jié)果。推斷有性生殖體存在致死基因的可能性。無融合生殖體二倍體孢子生殖的一些報(bào)道說明少數(shù)種的卵細(xì)胞自發(fā)形成胚，同時(shí)它們的花粉發(fā)育也是敗育的。

3.2 野生白花甜菜優(yōu)質(zhì)基因的利用價(jià)值

含糖量檢測(cè)實(shí)驗(yàn)對(duì)遠(yuǎn)緣雜交甜菜的應(yīng)用性研究具有重要的參考價(jià)值，遠(yuǎn)緣雜交甜菜M14含糖量顯著高于普通栽培甜菜10%左右。所以說遠(yuǎn)緣雜交是利用和開發(fā)有益基因的重要途徑。在黑龍江這樣寒冷的低溫帶種植遠(yuǎn)緣雜交甜菜M14，形態(tài)長(zhǎng)勢(shì)良好，具有抗寒、抗旱的特性。野生白花甜菜來自英國(guó)皇家植物園，它的根形酷似人參狀，因此，雜交后的甜菜M14具有叉根的特性，同時(shí)具有高糖、抗褐斑病的優(yōu)良性狀，該甜菜具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

3.3 無融合生殖的標(biāo)志性特征

遠(yuǎn)緣雜交甜菜M14 為高頻傳遞的二倍體孢子無融合生殖的人工合成物種，傳遞率在96.5%。其花粉發(fā)生敗育比率較高的主要原因是由于附加了1條野生種白花甜菜染色體所導(dǎo)致，從而影響植株的正常結(jié)實(shí)與繁殖發(fā)育，其花藥呈褐色，外形干癟，育性檢測(cè)結(jié)果驗(yàn)證了遠(yuǎn)緣雜交甜菜M14的結(jié)實(shí)率低下的原因。單體附加系甜菜M14只有11.6%的結(jié)實(shí)率，單體附加系甜菜M14花粉敗育現(xiàn)象被認(rèn)定為是無融合生殖的重要標(biāo)志[28]。對(duì)野生白花甜菜染色體及其攜帶的基因進(jìn)行相關(guān)研究仍然是今后較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)研究的方向和重點(diǎn)。

4 結(jié)論

對(duì)遠(yuǎn)緣雜交甜菜M14野生基因相關(guān)性狀進(jìn)行研究，報(bào)告了單體附加系甜菜M14的遺傳學(xué)性狀，就花粉敗育進(jìn)行了調(diào)查和統(tǒng)計(jì)分析，附加的白花甜菜染色體導(dǎo)致絨氈層過早解體，花粉敗育也是無融合生殖的重要標(biāo)志，野生基因的相關(guān)性狀分析，單體附加系甜菜M14 的高糖和叉根性狀顯著遺傳了野生白花甜菜的特性，研究結(jié)果，為遠(yuǎn)緣雜交甜菜的應(yīng)用性研究提供了基礎(chǔ)理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]Li Z Z. Translated from contribution of cell genetics to plant breeding [J]. The fifteenth international genetics conference abstracts， 1983， 118-119.

[2]Jassem B. Apomixis in the Genus Beta [J]. Apomixis Newsletter， 1990 （02）：7-23.

[3]Nogler G A. Genetics of apospory in apomictic.Ranunculus auricomus. V. Conclusio ns [J]. Bot Helv， 1984 （94）：411-422.

[4] Adachi S M. Karyotype analysis in the Beta species[J].Bul.of Fac.Agr.Mie Univ.Tniv.Tsu.Japan，1962 （25）：25-32.

[5] Bosemark N O， Bormotov V E. Chromosome morphology in a homozygous line of sugar beet [J]. Hereditas， 1971 （69）：205-212.

[6]郭德棟，王桂芝，王繼志，等.栽培甜菜和白花甜菜種間雜交的研究（Ⅰ）種間雜種后代形態(tài)學(xué)變異[J].黑龍江大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào)，1991，18（03）：9-16.

[7]王桂芝，郭德棟，賈樹彪，等.栽培甜菜（Beta vulgaris L.）和白花甜菜（Beta corolliflora Zoss.）種間雜交及細(xì)胞遺傳學(xué)研究[J]. 中國(guó)甜菜糖業(yè)，1994：（03）：7-15.

[8]康傳紅，王桂芝，賈樹彪，等.栽培甜菜和白花甜菜種間雜交后代無融合生殖的觀察[J].中國(guó)甜菜，1995（01）：3-8.

[9] Peel M D，Carman J G，Liu Z W，Wang R C.Meiotic anomalites in hybrids beteen wheat and apomictic Elymus rectisetus（Nees in lehm.）A.Love Connor.Crop Sci，1997，37（03）：717723.

[10]Koltunov A M. Apomixis： Moleculer strategies for the generation of genetically identical seeds without fertilization. Plant Physiology.1995.180：1345-1352.

[11] Khush G S， et al. Aopmixis for Rice Improvement.InG S，Khush，ed，Apomixis：Exploiting hybrid vigor in rice，International Rice Research Institute， Manila，Thephilipines.

[12]J P Vielle Calzada. Apomixis：The asexual revolution.Science，1996，274：1322-1323.

[13]賈寧，唐研耀，曾燕如，等. 植物無融合生殖研究進(jìn)展[J].生物學(xué)通報(bào)，2015，31（12）：15-24.

[14]Nogler G A. Genetics of apospory in apomictic ranunculus auricomus. V. Conclusio ns[J]. Bot Helv， 1984 （94）：411-422.

[15]申業(yè)，申家恒，郭德棟，等.甜菜單體附加系M14無融合生殖的細(xì)胞胚胎學(xué)研究[J].西北植物學(xué)報(bào)，2006，26（5）：975-963.

[16]劉麗萍，王艷，楊峰山，等.單體附加系甜菜M14與異緣三倍體甜菜（VVC）核型比較分析[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2014，30（09）：155-159.

[17]戈巖，何光存，王志偉，等.無融合生殖甜菜M14的GISH和BAC-Fish研究[J].中國(guó)科學(xué)，C輯：生命科學(xué)，2007，37（02）：209-216.

[18]郭德棟，康傳紅，劉麗萍，等.異緣三倍體甜菜（VVC）無融合生殖的研究[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，1999（04）：113-114.

[19]Fang X H， Gu S H， Xu Z Y. Construction of a binary BAC library for an apomictic monosomic addition line of Beta corolliflora in sugar beet and identification of the clones derived from the alien chromosome [J]. Theor.Appl.Gent， 2004 （108）：1420-1425.

[20]李海英，馬春泉，于冰，等.利用mRNA差異顯示技術(shù)分離甜菜M_（14）品系特異表達(dá)基因的cDNA片段[J].植物研究，2007，27（04）：465-468.

[21]蔣德生，李海英，于冰，等.甜菜M14品系BvM14-APX、BvM14-DHAR3、BvM14-MDAR基因相應(yīng)NaCl脅迫的表達(dá)分析[J].云南大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，21（08）：180-181.

[22]申業(yè)，申家恒，郭德棟，等.甜菜無融合生殖單體附加系M14大孢子發(fā)生期間細(xì)胞壁胼胝質(zhì)的變化[J].作物學(xué)報(bào)，2006，32（06）：894-898.

[23]Savidan Y J， Carman G， Dresselhaus T. The flowering of apomisis： From Mechanisms to Genetic Engineering Mexico，DF：CIMMYT.IRD[A]. European Commission DGVI（FAIR），2001：44-63.

[24]申業(yè)，申家恒，郭德棟，等.甜菜無融合生殖單體附加系M14雌配子體的發(fā)生與發(fā)育[J].武漢植物學(xué)究，2006，24（02）：106-112.

[25]劉麗萍，方曉華，康傳紅，等.無融合生殖甜菜單體附加系的獲得和鑒定[J].哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，34（05）：1-3.

[26]康傳紅，劉麗萍， 李勇，等.通過單體附加系傳遞率分析進(jìn)行甜菜無融合生殖基因定位[J].哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，34（05）：4-6.

[27]劉麗萍，劉巧紅，唐艷，等.甜菜染色體操縱材料遺傳學(xué)特性及經(jīng)濟(jì)性狀的研究[J].黑龍江大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào)，2017，34（06）：708-713.

[28]申業(yè)，申家恒，郭德棟，等.甜菜無融合生殖單體附加系M14小孢子發(fā)生與雄配子體發(fā)育的觀察[J]. 哈爾濱師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào)，2003，19（06）70-74.

作者簡(jiǎn)介：鄭佳玲，在讀本科生，研究方向：生物技術(shù)。

通訊作者；劉麗萍，碩士，實(shí)驗(yàn)師，研究方向：植物生物學(xué)。