海藻酸鈉微膠囊對(duì)乳酸菌產(chǎn)乙醛脫氫酶在體外胃腸消化環(huán)境中保護(hù)作用

萬茵，羅成，張鴻婷,3，郭帥玲,3，皮瀟文,3，童火艷,3，付桂明,3*

1(南昌大學(xué)，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌，330047) 2(南昌大學(xué) 食品學(xué)院，江西 南昌,330047) 3(南昌大學(xué) 中徳食品工程中心，江西 南昌,330047)

乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase,ALDH)是廣泛存在于動(dòng)植物和微生物線粒體中的一種氧化還原酶類，可在NAD+存在的條件下，催化醇、醛和酮的脫氫反應(yīng)[1]，尤其是參與乙醇及其代謝產(chǎn)物乙醛的轉(zhuǎn)化，故其在乙醇的解毒研究中受到了高度關(guān)注[2-3]。乙醛脫氫酶對(duì)熱、酸的抗逆性較差[4]，啤酒酵母線粒體乙醛脫氫酶最適pH值為9，在pH值8.0弱堿性環(huán)境下穩(wěn)定性較好[5]。因此乙醛脫氫酶要在人體內(nèi)發(fā)揮作用，如何經(jīng)受住高酸性胃酸、多種消化酶和膽汁的作用，保持在人體消化道中其酶活性是關(guān)鍵。

目前，工業(yè)化的乙醛脫氫酶來自動(dòng)物的胰腺、肝臟或肝細(xì)胞線粒體中，來源的局限性致其價(jià)格居高不下。研究表明微生物乙醛脫氫酶來源豐富，可從釀酒酵母、醋酸菌、乳酸菌等微生物中分離得到。微生物乙醛脫氫酶是一種胞內(nèi)酶[6]，微生物的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境可有效保護(hù)乙醛脫氫酶不受外部環(huán)境的影響。因此，若將產(chǎn)乙醛脫氫酶的益生菌直接進(jìn)行微膠囊包埋，利用微膠囊和益生菌的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境為乙醛脫氫酶提供雙重保護(hù)作用，可增強(qiáng)其抗逆性效果。海藻酸鈉由于具有良好的生物相容性、生物粘附性和溫和的凝膠條件已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、食品、化妝品等許多領(lǐng)域。海藻酸鈉作為壁材不僅可以包埋乳酸菌[7]，還可以包埋酶[8]等生物活性物質(zhì)。

本研究通過前期實(shí)驗(yàn)篩選得到的高產(chǎn)乙醛脫氫酶植物乳桿菌(LactobacillusplantarumFCJX 102)和嗜酸乳桿菌(LactobacillusacidophiluFCJX 104)，通過混合發(fā)酵培養(yǎng)菌體，采用微膠囊包埋乳酸菌活菌體，提高所含乙醛脫氫酶耐受胃液及腸液的能力，為高產(chǎn)乙醛脫氫酶乳酸菌及乙醛脫氫酶在調(diào)節(jié)酒后的腸道微環(huán)、解酒益生等領(lǐng)域的應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

EDTA，鹽酸，Tris，乙醛，β-巰基乙醇：分析純，國產(chǎn)試劑；海藻糖，海藻酸鈉，VC，甘油：生物試劑，國產(chǎn)試劑；NAD：生物試劑，Roche公司；胃蛋白酶，胰蛋白酶，膽鹽：生物試劑，SIGMA公司；伊利牌脫脂奶粉：市售；大豆分離蛋白：哈高科大豆食品有限責(zé)任公司；耐高溫α淀粉酶：山東蘇柯漢生物工程股份有限公司；山楂：湖北蘄春中藥材公司；葛根：江西橫峰皇同有機(jī)葛開發(fā)有限公司。

植物乳桿菌(L.plantarumFCJX 102)，嗜酸乳桿菌(L.acidophiluFCJX 104)：南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，牛肉粉5.0 g，酵母浸粉4.0 g，葡萄糖20.0 g，乙酸鈉5.0 g，檸檬酸氫二銨2.0 g，K2HPO42.0 g，七水硫酸0.2 g，MnSO40.05 g，吐溫-80 1.0 mL，加水至1 000 mL，pH 6.2～6.4，115 ℃滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：將葛根粉碎至20目，加入5倍質(zhì)量的水，并添加0.1%(v/m葛根質(zhì)量)的耐高溫α-淀粉酶，于100 ℃下酶解液化50 min，100目過濾，收集濾液作為葛根汁；將鮮山楂按1∶1的比例加水榨漿，向山楂原漿中加入0.5 g/L果膠酶(10萬U/g)，在溫度50 ℃、pH 為3.5的條件下酶解4 h，加入0.5 g/L殼聚糖沉淀，再經(jīng)過硅藻土過濾，得山楂原料汁(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%)。按山楂汁∶葛根汁按1∶2質(zhì)量比混合，調(diào)pH值至6.2～6.4，115 ℃滅菌30 min，即得發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

游標(biāo)卡尺，任丘市桂量量具有限公司；FA2004分析天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；T6型紫外-可見光分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；SORVALL高速冷凍離心機(jī)，Thermo Fisher公司；DKS-24型不銹鋼新型電熱恒溫水浴鍋，嘉興市中新醫(yī)療儀器有限公司；PHS-3C型pH計(jì)，上海精密儀器雷磁儀器廠；HJ-4A型數(shù)顯四聯(lián)磁力加熱攪拌器，常州國華電器有限公司；LDZX-50KBS型高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械有限公司；HWS-250型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；冷凍干燥機(jī)，美國LABCONCO公司。

1.4 方法

1.4.1 雙乳桿菌的混合培養(yǎng)

取篩選獲得產(chǎn)乙醛脫氫酶的植物乳桿菌(L.plantarumFCJX 102)和嗜酸乳桿菌(L.acidophiluFCJX 104)2個(gè)菌種，用種子培養(yǎng)基活化培養(yǎng)16 h，后按照兩者活菌數(shù)比例2∶1接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為5%，37 ℃培養(yǎng)16 h，收獲含乙醛脫氫酶活力高的混合菌體發(fā)酵液。

1.4.2 雙乳桿菌海藻酸鈉微膠囊的制備

采用海藻酸鈉擠壓法[9]。將1.4.1中混合發(fā)酵液在4 ℃、4 500 r/min離心10 min，去上清，無菌生理鹽水清洗菌體2次，離心后得到雙乳桿菌菌泥，按1∶5(w/v)加入保護(hù)劑(海藻糖8%，VC0.2%，乳糖8%，甘油3%)，混勻后再加4.0%脫脂乳和滅菌的2.68%海藻酸鈉溶液，充分混合均勻。用無菌滴管(直徑0.45 mm)將混合菌滴加到0.2 mol/L的滅菌CaCl2溶液中，攪拌速度600 r/min，固化30 min，無菌生理鹽水清洗后過濾，即得雙乳酸桿菌濕微膠囊。將之于-80 ℃預(yù)凍24 h，再冷凍干燥48 h，得到雙乳桿菌海藻酸鈉微膠囊成品。

1.4.3 微膠囊包埋率測(cè)定

采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定制備微膠囊前乳酸菌菌落數(shù)及上清液中未被包埋的乳酸菌菌落數(shù)，根據(jù)下列公式計(jì)算包埋率：

(1)

1.4.4 微膠囊粒徑測(cè)定

用游標(biāo)卡尺測(cè)量隨機(jī)取樣的微膠囊顆粒粒徑若干，取平均值。

1.4.5 雙乳桿菌及其微膠囊的體外模擬胃消化研究

于100 mL具塞錐形瓶中加入質(zhì)量濃度為9 g/L的NaCl溶液25 mL、0.1 mol/L HCl溶液4 mL、40 mg/mL胃蛋白酶溶液2 mL(用0.1 mol/L HCl配制)，混合均勻后，調(diào)pH值在1.5～2.0之間，制備人工胃液。加入0.200 g雙乳桿菌菌泥或含有等菌落數(shù)的微膠囊，放置于37 ℃ 160 r/min水浴振蕩180 min，其間，于0、10、20、30、40、50、60、90、120、150、180 min時(shí)，依次取出消化液測(cè)定其ALDH酶活。以等質(zhì)量未經(jīng)消化的菌泥或微膠囊作對(duì)照，將其活性視作100%。

1.4.6 雙乳桿菌海藻酸鈉微膠囊體外模擬腸溶性研究

于100 mL具塞錐形瓶中加入0.9 g/100 mL NaCl溶液25 mL，加入9 mL胰液膽汁混合液(2 mg/mL胰液，12 mg/mL膽汁均用0.1 mol/L NaHCO3溶液配制)，用0.5 mol/L NaHCO3調(diào)節(jié)pH在7.0～7.5，制備人工腸液。將經(jīng)體外模擬胃消化后的微膠囊繼續(xù)于模擬腸液中消化60 min，每10 min取一次樣，于600 nm處測(cè)定透光率，以等質(zhì)量未經(jīng)消化的微膠囊作對(duì)照，將其透光率視作100%，測(cè)定雙乳桿菌海藻酸鈉微膠囊體外腸溶性。

1.4.7 雙乳桿菌及其微膠囊體外模擬腸消化研究

向34 mL人工腸液中加入0.200 g菌泥或含有等菌落數(shù)的微膠囊，放置于37 ℃、160 r/min水浴振蕩60 min，其間，于0、10、20、30、40、50 min時(shí)，依次取出消化液測(cè)定其ALDH酶活。以等質(zhì)量未經(jīng)消化的菌泥或微膠囊作對(duì)照，將其活性視作100%。

1.4.8 乙醛脫氫酶粗酶活力測(cè)定

將微膠囊顆粒重懸于5倍質(zhì)量的磷酸緩沖鹽(pH值8.0、20 mmol/L)中，制成菌懸液，以200 W功率超聲破碎15 min(冰水浴)，再于6 000 r/min、4 ℃離心15 min，收集上清液，得到沉淀按上述處理重復(fù)1次，合并2次上清液即得乙醛脫氫酶粗酶液。

向試管中加入2.52 mL Tris-HCl緩沖液(0.05 mol/L，pH=8.0)、0.1 mL EDTA溶液(0.05 mol/L)、0.1 mL KCl溶液(3 mol/L)、0.1 mL NAD+溶液(0.02 mol/L)、0.05 mL乙醛溶液(0.1 mol/L)、0.03 mLβ-巰基乙醇溶液(0.05 mol/L)，混勻后，加入0.1 mL粗酶液，迅速混勻后，于340 nm波長下測(cè)吸光值，計(jì)算5 min內(nèi)吸光值的變化ΔA340[10]。

酶活力單位定義：25 ℃下，每分鐘催化還原1 μmol NAD+的所需要的酶量為1個(gè)酶活力單位。

2 結(jié)果與討論

2.1 雙乳酸桿菌微膠囊制備

測(cè)得雙乳酸桿菌菌懸液活菌數(shù)為4.4×1010CFU/mL，制備過程中濾液和洗滌液中活菌數(shù)僅為7.5×106CFU/mL，包埋率達(dá)99.8%以上，微膠囊制備包埋效果好。與KRASAEKOOPT等[11]用海藻酸鈉對(duì)嗜酸乳桿菌等益生菌微膠囊化的結(jié)果一致。

如圖1所示，經(jīng)擠壓法制成的雙乳酸桿菌濕微膠囊呈乳白色，顆粒均勻、圓潤飽滿。凍干后，干微膠囊顆粒粒徑變化不大，表面稍有內(nèi)陷，多為球狀，表觀顏色變?yōu)槟埸S色。這是冷凍干燥過程中，微膠囊含的水分由固態(tài)直接升華，固形物形態(tài)基本得以保持。而表觀顏色的變化，是由于壁材海藻酸鈉和脫脂乳干燥后呈現(xiàn)出來。

圖1 雙乳桿菌海藻酸鈉微膠囊Fig.1 Microcapsules of dual Lactobacillus

隨機(jī)挑取25粒已凍干的雙乳桿菌海藻酸鈉微膠囊，用游標(biāo)卡尺測(cè)量其粒徑，數(shù)據(jù)如表1所示，本實(shí)驗(yàn)制得的雙乳桿菌海藻酸鈉微膠囊平均粒徑為(1.14±0.08)mm。

2.2 雙乳桿菌及其微膠囊體外模擬胃消化研究

食物在胃中消化需歷經(jīng)4個(gè)階段，大約2～3 h，微膠囊在這段時(shí)間內(nèi)應(yīng)不溶解或囊體不破碎，方可保證雙乳桿菌耐受高酸性環(huán)境和胃消化酶消解，從而順利到達(dá)腸道發(fā)揮其益生功效[12]。故在本實(shí)驗(yàn)中，微膠囊在人工胃液中的最長消化時(shí)間定為180 min。

表1 雙乳桿菌海藻酸鈉微膠囊粒徑Table 1 Diameters of microcapsules of dual Lactobacillus

L.plantarumFCJX 102與L.acidophiluFCJX 104混合菌及其微膠囊按照1.4.8方法測(cè)定乙醛脫氫酶的酶活，如圖2所示，在模擬胃液中，未包埋的雙乳桿菌中乙醛脫氫酶活性在30 min內(nèi)急劇下降，在10 min時(shí)存活53.2%，到20 min時(shí)存活25.6%，至30 min時(shí)存活率僅為0，說明乙醛脫氫酶在pH值為1.5～2的高酸性條件下極易失活，其活力會(huì)迅速降低。這與李鑫[4]的研究一致，在人工胃液環(huán)境中，8 min時(shí)乙醛脫氫酶活性損失近50%相近。而微膠囊包埋后雙乳桿菌在體外模擬胃液環(huán)境中，前90 min內(nèi)酶活性下降不明顯，均能保持在95%以上；模擬胃消化90 min后，乙醛脫氫酶活性開始下降，至180 min時(shí)，微膠囊包埋菌體乙醛脫氫酶活性仍存留73.4%。說明海藻酸鈉和脫脂乳等保護(hù)劑制成的雙乳酸桿菌微膠囊對(duì)低pH值環(huán)境有良好的抵御作用[13]，很好地保護(hù)了雙乳桿菌體中的乙醛脫氫酶活性。

圖2 雙乳桿菌及其微膠囊體外模擬胃消化ALDH活性變化Fig.2 ALDH activity of entrapped dual Lactobacillus cells following exposure to simulated gastric juice and microencapsulation

2.3 雙乳桿菌海藻酸鈉微膠囊制劑體外模擬腸溶解性試驗(yàn)

將0.100 g經(jīng)模擬胃消化后的微膠囊繼續(xù)于模擬腸液中消化60 min，每10 min測(cè)一次透光率，結(jié)果如圖3所示。雙乳桿菌海藻酸鈉微膠囊在體外模擬的腸液環(huán)境中，隨著消化時(shí)間延長，透光率下降，即雙乳酸桿菌漸漸從膠囊顆粒中釋出。40 min后，透光率不再繼續(xù)呈較大幅度下降，曲線接近平緩，而在此時(shí)溶液中已觀察不到成型固體小顆粒，表明溶解徹底。該結(jié)果也符合《中華人民共和國藥典》(2010年版二部)中對(duì)腸溶衣片崩解時(shí)限的規(guī)定[14]。說明雙乳桿菌海藻酸鈉微膠囊有較好的腸溶性，可在消化40 min后可完全崩解釋放菌體，有利于乙醛脫氫酶發(fā)揮催化作用。

圖3 雙乳桿菌海藻酸鈉微膠囊體外模擬腸溶解性Fig.3 Release of encapsulated dual Lactobacillus from microspheres in simulated intestine juice

2.4 雙乳桿菌及其微膠囊體外模擬腸消化研究

L.plantarumFCJX 102與L.acidophiluFCJX 104混合菌及其微膠囊模擬腸消化ALDH活性變化結(jié)果如圖4所示。

圖4 雙乳桿菌及其微膠囊體外模擬腸消化ALDH活性變化Fig.4 ALDH activity of entrapped dual Lactobacillus cells following exposure to simulated intestinal juice and microencapsulation

在模擬腸液中，前30 min內(nèi)混合菌菌體中ALDH活性均能保持在85%以上，消化50 min后仍能保持63.7%以上活力，說明乙醛脫氫酶在弱堿性條件下較穩(wěn)定。在陳貴佺[15]、劉清利[7]、李文[16]等學(xué)者的研究中，pH 6.0～8.0的環(huán)境中，乙醛脫氫酶反應(yīng)活性最高，故小腸是乙醛脫氫酶發(fā)揮分解乙醛作用的主要器官。雙乳桿菌海藻酸鈉微膠囊在模擬體外腸消化的前30 min內(nèi)，微膠囊顆粒尚未完全崩解，由于海藻酸鈉等壁材對(duì)菌體和乙醛脫氫酶的保護(hù)，消化30 min酶活保存率仍達(dá)97.8%；40 min以后，隨著微膠囊顆粒崩解，雙乳酸桿菌直接暴露于人工腸液中，乙醛脫氫酶活性較之前開始下降，但消化50 min，相對(duì)活性仍能保留86.5%。

3 結(jié)論

本文研究了L.plantarumFCJX 102和L.acidophiluFCJX 104混合菌及其微膠囊在體外模擬胃腸消化中乙醛脫氫酶活性的變化。利用脫脂乳和海藻酸鈉制備的雙乳桿菌海藻酸鈉微膠囊，其包埋率為99.8%，粒徑為(1.14±0.08) mm。在體外模擬的胃液環(huán)境中，消化90 min后雙乳桿菌海藻酸鈉微膠囊乙醛脫氫酶活性能保留在95%以上，至消化180 min后微膠囊包埋菌體乙醛脫氫酶活保留率仍然達(dá)73.4%；而未經(jīng)包埋的雙乳桿菌，其乙醛脫氫酶在胃液消化30 min時(shí)就已完全失去活性；體外模擬腸消化前40 min，由于微膠囊壁材的保護(hù)作用，菌體乙醛脫氫酶均能保持95%以上的活性；40 min以后，隨著微膠囊顆粒崩解，乙醛脫氫酶開始下降，至消化50 min，乙醛脫氫酶相對(duì)活性仍能保留86.5%。

乙醇在被人體吸收后，首先在乙醇脫氫酶(ADH)的催化下脫氫氧化轉(zhuǎn)化為乙醛。生成的乙醛在乙醛脫氫酶(ALDH)的催化下氧化生成乙酸[17]，最終進(jìn)入三羧酸循環(huán)分解成水和二氧化碳排出體外[18-19]。由于乙醛具有強(qiáng)烈的毒理作用，若體內(nèi)缺少ALDH或ALDH活性較低，飲酒后容易造成乙醛在體內(nèi)累積而導(dǎo)致中毒[20-21]；乙醛脫氫酶加速乙醛在體內(nèi)的氧化分解，降低體內(nèi)乙醛的濃度，縮短醉酒時(shí)間及緩解人們因醉酒產(chǎn)生的不適應(yīng)，減少因乙醛中毒而導(dǎo)致各種疾病的誘發(fā)率[22]。雙乳桿菌海藻酸鈉微膠囊產(chǎn)品在包埋率及乙醛脫氫酶酶活保存率高，在降低飲酒后人體乙醛含量、緩解乙醇中毒癥狀具有較好的潛在的應(yīng)用前景。