楊樹芽總黃酮的提取工藝及其抗氧化活性研究

高喜霞,程 妮, 2,曹毛毛,趙浩安,劉彩云,曹 煒, 2

(1.西北大學(xué) 化工學(xué)院, 陜西 西安 710069;2.陜西省蜂產(chǎn)品工程技術(shù)研究中心,陜西 西安 710065)

楊樹芽是楊柳科(Salicaceae)楊屬(Populus)植物中尚未充分發(fā)育和伸長(zhǎng)的枝條或花,是自然界中廣泛存在的一種膠源物質(zhì),也是生物活性化合物的來源之一[1-2]。大量研究表明,楊樹芽是楊樹型蜂膠的主要植物源[3-4],楊樹型蜂膠具有抗菌、抗炎和細(xì)胞抑制等性質(zhì)[5]。已有研究表明,楊樹芽提取物富含多酚類物質(zhì)[6-7],包括類黃酮[8]、酚酸及其酯類化合物[9]。楊樹芽一直作為民間藥用于治療皮炎,上呼吸道感染和風(fēng)濕類疾病[10-11]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,楊樹芽具有調(diào)節(jié)免疫、保護(hù)肝臟、抗炎和抗菌等生物活性[12-14]。由此可見,楊樹芽的研究具有重要的開發(fā)利用價(jià)值。

本文基于單因素實(shí)驗(yàn),以提取時(shí)間、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)為自變量,楊樹芽總黃酮提取率為響應(yīng)值,利用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法,對(duì)楊樹芽總黃酮提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,同時(shí)考察楊樹芽總黃酮提取物的抗氧化活性。旨為楊樹芽資源的高值化開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

楊樹芽 陜西省佳縣;蘆丁(AR) Aladdin(上海生化股份有限公司);乙醇、苯、甲醇(國(guó)產(chǎn)分析純，新萬達(dá)科教儀器廠);正常熔點(diǎn)瓊脂糖(微克生物有限公司);1,1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH) 得研實(shí)驗(yàn)生物試劑耗材;pBR322DNA 生工生物工程股份有限公司;HCL(AR，渤海集團(tuán)化工有限公司);Trolox、菲洛嗪(AR) SIGMA-ALDRICH公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-2J恒溫水浴鍋 萊悅納格儀器制造廠;101-00A型鼓風(fēng)干燥箱 鼎昌儀器;RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 亞榮生化儀器;SHZ-III循環(huán)水式真空泵 玖藍(lán)科學(xué)儀器;060ST超聲波清洗器 潔盟電器;722可見分光光度計(jì) 力辰實(shí)驗(yàn)儀器;UVP Gelstudio touch凝膠成像儀 德國(guó)耶拿分析儀器股份公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 楊樹芽總黃酮的提取方法 楊樹芽經(jīng)自然光晾曬至干,用粉碎機(jī)粉碎成末狀并經(jīng)過250μm的篩子,得到楊樹芽粉末。將楊樹芽粉末與一定濃度的乙醇溶劑按比例混合,置于固定在水浴鍋上的圓底燒瓶中,通過熱回流的方式,同時(shí)設(shè)置溫度和時(shí)間進(jìn)行提取。將所得提取液通過抽濾的方式得到其上清液并進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,對(duì)濃縮液進(jìn)行冷凍干燥,即為楊樹芽提取物,儲(chǔ)藏于-4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 楊樹芽中總黃酮的測(cè)定方法 楊樹芽提取物中總黃酮的測(cè)定參考孫麗萍等人的方法[15]。楊樹芽總黃酮的含量以蘆丁計(jì)。稱取0.5 g楊樹芽,用乙醇溶解并補(bǔ)充體積至25.0 mL,混勻后超聲提取0.5 h,取1.0 mL上清液置于蒸發(fā)皿中,并加入1 g聚酰胺粉,于40℃水浴下?lián)]掉乙醇,并移至層析柱,先用20.0 mL苯洗脫,以脫除實(shí)驗(yàn)過程中的雜質(zhì),后用甲醇洗脫,收集甲醇溶液并定容至25 mL,于360 nm處測(cè)定吸光度。楊樹芽總黃酮含量按公式(1)計(jì)算,提取率按公式(2)計(jì)算。

(1)

式中:X為楊樹芽提取物中的總黃酮含量,單位mg/100g;A為由標(biāo)曲算得被測(cè)液黃酮量,單位μg;M為楊樹芽活性成分提取物質(zhì)量,單位g;V1為測(cè)定用試樣體積,單位mL;V2為試樣定容總體積,單位mL。

(2)

式中：Z為提取物中總黃酮的質(zhì)量,單位g;Y為楊樹芽質(zhì)量,單位g。

1.3.3 楊樹芽總黃酮提取工藝優(yōu)化

1)單因素實(shí)驗(yàn)

分別考察料液比、提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)楊樹芽提取物總黃酮提取率的影響。因素水平見表1。

表1 單因素實(shí)驗(yàn)因素及水平Tab.1 Factors and levels used in single factor analysis

2) 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

基于單因素實(shí)驗(yàn),選擇提取時(shí)間X1、料液比X2和乙醇體積分?jǐn)?shù)X3為自變量,以楊樹芽提取物中總黃酮提取率為響應(yīng)值,對(duì)楊樹芽提取工藝進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。具體的因素水平見表2。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素及水平Tab.2 Factors and levels used in response surface analysis

1.3.4 楊樹芽提取物體外抗氧化活性的測(cè)定方法

1)DPPH·清除活性

測(cè)定方法參考Zhao等人的方法[16-17]。移取1 mL楊樹芽提取物配置的濃度不同的楊樹芽提取液于試管中,各加入5 mL濃度為0.1 mmol/L的DPPH甲醇溶液,室溫避光反應(yīng)1 h,以甲醇為空白,以Vc為陽性對(duì)照,于517 nm處測(cè)定吸光度。DPPH·清除率按下式計(jì)算。

式中:A樣品為樣品的吸光度;A空白為空白的吸光度。

2)Fe3+還原能力(ferric reducing ability of plasma,FRAP)的測(cè)定方法

參考ZHANG X等人的方法[18]。將0.3 mol/L醋酸鹽緩沖液(pH=3.6),0.01 mol/L TPTZ溶液(0.4 mol/L HCl)和0.02 mol/L氯化鐵溶液以體積比10∶1∶1的比例配成FRAP試劑,37 ℃保存?zhèn)溆?。移?.76 mL一定濃度的楊樹芽提取物配置的楊樹芽提取液于試管中,加入7.24 mL FRAP試劑使總體積為8 mL,常溫狀態(tài)下反應(yīng)15 min,以Trolox為陽性對(duì)照,于593 nm處測(cè)吸光度。

3)Fe2+絡(luò)合力的測(cè)定方法

測(cè)定方法參考Rajapakse等人的方法[19]。準(zhǔn)確吸取經(jīng)適當(dāng)稀釋的楊樹芽提取物配置的楊樹芽提取液200 μL,置于小離心管中,依次加入0.1 mL 1 mmol/L的FeSO4溶液,0.3 mL濃度為1 mmol/L的菲洛嗪(Ferrozine),并用甲醇補(bǔ)充體積至3 mL,反應(yīng)0.17 h,以乙二胺四乙酸二鈉為標(biāo)準(zhǔn),于562 nm處測(cè)其吸光度。

4)楊樹芽提取物對(duì)OH·介導(dǎo)的DNA鏈氧化損傷的保護(hù)作用

采用本實(shí)驗(yàn)室建立的方法。實(shí)驗(yàn)組加入0.5 μg pBR322質(zhì)粒DNA，1 μL 1.0 mmol/LFeSO4，l μL 1%(體積分?jǐn)?shù))H2O2和4 μL濃度不同的楊樹芽樣品溶液(1，5，15 μg/mL),并用50 mmol/L的磷酸緩沖液(pH=7.0)補(bǔ)充體積至15 μL;模型組不加楊樹芽樣品溶液;正常組不加誘導(dǎo)劑FeSO4、H2O2和楊樹芽樣液。待體系混勻后在37℃溫浴反應(yīng)30 min；然后加入Loading buffer;再將0.8%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠熱熔后向其中加入Golden ViewR,乘熱倒膠,凝固后點(diǎn)樣,即可開始電泳。電泳時(shí)間為90min,電泳所需電壓為50V,電泳方向從負(fù)極到正極。結(jié)果用呈像儀拍照,Quantity One軟件分析電泳條帶,定量分析雙螺旋結(jié)構(gòu)剩余含量,以評(píng)價(jià)楊樹芽提取物對(duì)OH·誘導(dǎo)的DNA氧化損傷的抑制作用。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Design-Expert 8.0.6，Origin8.0及Quantity One軟件進(jìn)行處理,實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 楊樹芽總黃酮的提取結(jié)果

2.1.1 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響 固定料液比(1∶10，g/mL)及乙醇濃度(75%，體積分?jǐn)?shù)),本文研究了提取時(shí)間對(duì)楊樹芽總黃酮提取率的影響,結(jié)果見圖1。由圖1可知,在一定范圍內(nèi),楊樹芽總黃酮提取率與時(shí)間的延長(zhǎng)呈正相關(guān),2.0 h時(shí)達(dá)到最高。原因可能在于熱回流提取過程中,楊樹芽粉末中的黃酮類化合物濃度高于乙醇中的黃酮類化合物濃度,形成一定濃度梯度,致使其提取率在時(shí)間小于2.0 h時(shí)增幅較大,另一方面,熱回流提取過程中,物質(zhì)與條件之間的相互作用加速了分子之間的運(yùn)動(dòng),導(dǎo)致楊樹芽細(xì)胞壁破損,從而加速楊樹芽中活性成分的析出。當(dāng)提取時(shí)間大于2.0 h時(shí),提取率受提取時(shí)間的影響較小。這可能是隨著時(shí)間的延長(zhǎng),部分黃酮類化合物的析出已達(dá)極限,形成穩(wěn)定狀態(tài)。綜上所述,選擇2.0 h為楊樹芽的最優(yōu)提取時(shí)間。

圖1 提取時(shí)間對(duì)楊樹芽總黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of extraction time on the extraction rate of total flavonoids from poplar buds

2.1.2 料液比對(duì)總黃酮提取率的影響 固定提取時(shí)間(1.5h)和乙醇濃度(75%，體積分?jǐn)?shù)),本文考察了料液比對(duì)楊樹芽總黃酮提取率的影響,結(jié)果見圖2。由圖2可知,在一定范圍內(nèi),提取率與料液比的增加呈正相關(guān),料液比為1∶15時(shí),提取率達(dá)到最高。可能是溶劑體積不斷增加過程中,溶劑傳質(zhì)動(dòng)力增大,傳質(zhì)效率增大,使得楊樹芽總黃酮提取率增大[20]。但是，料液比繼續(xù)增加后其提取率變化趨勢(shì)平穩(wěn)。這可能是溶劑體積的增加致使傳質(zhì)擴(kuò)散達(dá)到一種飽和穩(wěn)定狀態(tài)。鑒于過高的料液比會(huì)使實(shí)驗(yàn)過程中回收困難,損耗增加,綜合考慮,本研究選取1∶15為最優(yōu)料液比[21]。

圖2 料液比對(duì)楊樹芽總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of solid-to-liquid ratio on the extraction rate of total flavonoids from poplar buds

2.1.3 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響 固定料液比(1∶10，g/mL)和提取時(shí)間(1.5h),本文考察了乙醇濃度對(duì)楊樹芽總黃酮提取率的影響。結(jié)果如圖3所示,隨著乙醇濃度的增加,提取率呈遞增趨勢(shì)。當(dāng)乙醇濃度大于85%時(shí),提取率增幅較小。這可能與楊樹芽中黃酮類化合物的劑性有關(guān)。已有研究表明,楊樹芽富含黃酮類物質(zhì)[22],其中一些平面性強(qiáng)的分子,因分子間排列緊湊,引力較大,故難溶于水,易溶于有機(jī)溶劑?？紤]到乙醇濃度過高會(huì)使楊樹芽中的一些極性較小的物質(zhì)如脂溶性色素等容易溶出[21],因而采用體積分?jǐn)?shù)為85%的乙醇提取楊樹芽中的黃酮類化合物比較適宜。

圖3 不同濃度乙醇對(duì)楊樹芽總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of different concentrations of ethanol on the extraction rate of total flavonoids from poplar buds

2.2 楊樹芽總黃酮提取的工藝優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)模型的建立與分析 響應(yīng)面分析法是將一個(gè)體系的響應(yīng)作為一個(gè)或多個(gè)因素的函數(shù),通過圖形的方式將此函數(shù)關(guān)系顯現(xiàn),以方便實(shí)驗(yàn)人員選擇試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的最優(yōu)條件。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。

利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合,得到該模型方差分析結(jié)果,見表4。對(duì)表4的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合,得到如下回歸方程:Y=-224.15+16.14X1+603.98X2+4.51X3-62.40X1X2-0.032X1X3-2.67X2X3-2.09X12-1899.20X22-0.024X32。

從表4方差分析可以看出,該模型回歸極顯著(P<0.000 1),失擬項(xiàng)不顯著(P=0.148 8>0.05),說明該模型符合標(biāo)準(zhǔn);R2為0.989 9,說明楊樹芽總黃酮提取率的實(shí)際實(shí)驗(yàn)值與理想預(yù)測(cè)實(shí)驗(yàn)值之間有較好的擬合度。該模型可用于推測(cè)提取率的實(shí)際情況。

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.3 Experimental design and results for RSM

表4 回歸模型方差分析Tab.4 Analysis of variance of regression model

注:P<0.05,差異顯著;P<0.01,差異極顯著。

從表4回歸系數(shù)檢驗(yàn)結(jié)果可知,在回歸方程的一次項(xiàng)中,X2和X3差異極顯著(P<0.01),表明其對(duì)該模型的響應(yīng)值有極大影響,X1差異顯著(0.01X2>X1,即乙醇濃度>料液比>提取時(shí)間。交互項(xiàng)X1X2和X2X3差異極顯著(P<0.01),二次項(xiàng)差異均極顯著(P<0.01)。

2.2.2 響應(yīng)面分析結(jié)果 響應(yīng)面圖形中的曲面斜率越大,考察因素對(duì)響應(yīng)值影響越大;等高線圖形中的曲線越向中心靠攏,即形狀越相似于橢圓形,交互作用越顯著,否則則表示交互作用不顯著[23]。由圖4可知,提取時(shí)間與料液比的響應(yīng)面曲面斜率較大,等高線圖形呈橢圓形,說明其對(duì)提取率的交互作用影響極顯著(P<0.01),且從響應(yīng)面曲面斜率大小可知,料液比對(duì)提取率的影響更大;料液比與乙醇體積分?jǐn)?shù)的曲面斜率較大,等高線圖形呈橢圓形,說明其對(duì)提取率影響的交互作用極顯著(P<0.01),且從響應(yīng)面曲面斜率大小可知,乙醇濃度影響作用大于料液比;與方差分析結(jié)果相符。

圖4 各因素間交互作用對(duì)楊樹芽總黃酮提取率影響的響應(yīng)面和等高線Fig.4 Response surface plots showing the effect of interactions among various factors on the total flavonoid extraction rate of poplar bud

2.2.3 最優(yōu)提取工藝驗(yàn)證 通過響應(yīng)面軟件的數(shù)據(jù)分析,得出最佳工藝條件為:提取時(shí)間2.16 h、料液比1∶16.31 (g/mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù)86.26%,楊樹芽總黃酮提取率的預(yù)測(cè)值為13.00%。為了驗(yàn)證該模型的可靠性,對(duì)得到的工藝條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,考慮到各方面條件,將其調(diào)整為:提取時(shí)間2 h、料液比1∶16 (g/mL)、乙醇濃度85%,該條件下實(shí)驗(yàn)3次,得到楊樹芽總黃酮提取率均值為13.14%,接近預(yù)測(cè)值,這說明優(yōu)化得到的楊樹芽提取工藝條件可靠,預(yù)測(cè)性好,合理可行。

2.3 楊樹芽總黃酮的體外抗氧化活性

2.3.1 DPPH·清除能力 DPPH·是一種穩(wěn)定的自由基,色澤透亮呈深紫色[24],自由基清除劑可與DPPH·生成穩(wěn)定的黃色化合物,體系色澤度與抗氧化劑的供氫能力有關(guān)[25-27]。DPPH·清除率與抗氧化能力呈正相關(guān)。如圖5所示,在一定范圍內(nèi),楊樹芽提取物對(duì)DPPH·的清除率與質(zhì)量濃度有一定的量效關(guān)系,濃度不斷增加的過程中,清除能力也增加。經(jīng)計(jì)算,楊樹芽提取物清除DPPH·的IC50值是0.15 mg/mL,Vc的IC50值是0.023 mg/mL,IC50值越低,對(duì)應(yīng)物質(zhì)的抗氧化活性就越強(qiáng)。結(jié)果表明，楊樹芽提取物對(duì)DPPH·有較好的清除能力。

圖5 DPPH·清除能力Fig.5 The DPPH·scavenging ability

2.3.2 還原力 FRAP法測(cè)定還原力的原理是在pH<7的環(huán)境下,抗氧化物可還原鐵離子-三吡啶基三嗪(Fe3+-TPTZ),得到藍(lán)色的Fe2+-TPTZ,隨后在593 nm處測(cè)定吸光度即可通過計(jì)算得到樣品的還原力。以Trolox(水溶性抗氧化劑)作為標(biāo)準(zhǔn)品與楊樹芽提取物進(jìn)行比較,可評(píng)價(jià)楊樹芽提取物的總抗氧化活性。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,楊樹芽提取物的總抗氧化能力為152.1 g Trolox/kg,表明其具有較強(qiáng)抗氧化活性。

2.3.3 Fe2+絡(luò)合力 Ferrozine與Fe2+反應(yīng)可生成藍(lán)色絡(luò)合物,而抗氧化劑與Fe2+可生成無色絡(luò)合產(chǎn)物,因此可將溶液色澤度作為抗氧化劑濃度的一種評(píng)價(jià)方式。抗氧化劑濃度越大,絡(luò)合力越強(qiáng)時(shí),體系的藍(lán)色越淺。以Na2EDTA為標(biāo)準(zhǔn),比較樣品的絡(luò)合力[28]。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明楊樹芽提取物具有絡(luò)合Fe2+的能力,絡(luò)合力為271.03 g Na2EDTA/kg。這說明楊樹芽提取物具有很好的Fe2+絡(luò)合力。

2.3.4 OH·介導(dǎo)的DNA鏈氧化損傷的保護(hù)作用 模型組:質(zhì)粒DNA+H2O2+FeSO4;實(shí)驗(yàn)組:質(zhì)粒DNA+H2O2+FeSO4+楊樹芽提取物(S1-S3)。

在一定場(chǎng)強(qiáng)下,DNA分子的遷移速率與其自身的大小和構(gòu)型有一定關(guān)系,質(zhì)粒DNA在通常情況下為雙螺旋結(jié)構(gòu)(0號(hào)泳道),移動(dòng)較快,當(dāng)受損后,DNA可能變?yōu)殚_環(huán)或線性結(jié)構(gòu),條帶移動(dòng)較慢。OH·對(duì)pBR322質(zhì)粒DNA損傷程度的不同,直觀反映的便是雙螺旋在3種構(gòu)象中的比例,雙螺旋結(jié)構(gòu)比例越大,則OH·對(duì)DNA的氧化損傷程度越小[29,30]。本文結(jié)果如圖6，5所示,在H2O2和FeSO4的存在下,空白組中的1.95%DNA轉(zhuǎn)化為開鏈或線狀,而模型組中的68.77%DNA轉(zhuǎn)化為開鏈或線狀, 高出空白對(duì)照組約35倍。S1，S2，S3中分別是不同濃度的楊樹芽提取物,可得出，楊樹芽提取物對(duì)pBR322DNA的氧化損傷具有保護(hù)作用。隨著楊樹芽提取物濃度的增加,pBR322質(zhì)粒DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)從40.69%增加至94.42%,最高可保護(hù)94.42%的DNA免受氧化應(yīng)激損傷,說明楊樹芽提取物對(duì)OH·介導(dǎo)DNA氧化損傷具有顯著的保護(hù)作用。這可能與楊樹芽總黃酮提取物對(duì)過渡金屬亞鐵離子有較強(qiáng)的絡(luò)合能力有關(guān),也可能與楊樹芽提取物中黃酮類化合物對(duì)OH·的清除作用有關(guān),其機(jī)理有待進(jìn)一步深入研究。

注:0號(hào)泳道0.5 μgpBR322質(zhì)粒DNA;1號(hào)泳道0.5 μg pBR322質(zhì)粒DNA+1 μL1%H2O2+1 μL1.0mMFeSO4;2-4號(hào)泳道0.5 μg pBR322質(zhì)粒DNA+1 μL1%H2O2+1 μL1.0mMFeSO4+4 μL濃度分別為1，5，15 μg/mL楊樹芽提取物。圖6 楊樹芽提取物對(duì)OH·介導(dǎo)pBR322DNA鏈氧化損傷的保護(hù)作用Fig.6 Protective effect of poplar bud extract on hydroxyl radical-induced cleavage of pBR322 plasmid DNA

3 結(jié) 論

本研究通過熱回流提取方法,以總黃酮提取率和抗氧化活性為考察指標(biāo),在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,利用響應(yīng)面方法優(yōu)化了楊樹芽總黃酮的熱回流提取工藝,得出楊樹芽總黃酮的最佳提取工藝為:提取時(shí)間2 h、料液比1∶16 (g/mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù)85%,該條件下楊樹芽總黃酮的提取率為13.14%。體外抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,楊樹芽提取物不僅可以有效地清除自由基,對(duì)過渡金屬Fe2+離子也有較強(qiáng)的絡(luò)合能力,楊樹芽提取物對(duì)OH·介導(dǎo)pBR322DNA氧化損傷也有顯著的的保護(hù)作用。本文的研究結(jié)果為楊樹芽生物資源的開發(fā)利用提供了依據(jù)。

表5 楊樹芽提取物對(duì)OH·介導(dǎo)pBR322DNA鏈氧化損傷的保護(hù)作用Tab.5 Protective effects of poplar bud extract on hydroxyl radical-induced pBR322DNA oxidative damage

注:表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差;3種狀態(tài)DNA所占比例是根據(jù)相對(duì)光密度計(jì)算得到?？瞻捉M:質(zhì)粒DNA。