氧氟沙星滴眼液細(xì)菌內(nèi)毒素檢測法研究

陳日檬，梁鳳蘭，馬德運(yùn)，李 蔚，顏月娥，楊建芳

（1.湛江市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東 湛江 524022；2.肇慶學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 肇慶 526061；3.肇慶學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，廣東 肇慶 526061；4.哈爾濱工業(yè)大學(xué)后勤集團(tuán)，黑龍江 哈爾濱 150006）

《中國藥典》（2015版第二部）規(guī)定滴眼液只需進(jìn)行無菌檢測，而無菌檢測僅局限于檢查樣本中存在的活體菌株，對死亡細(xì)菌釋放出的內(nèi)毒素檢測未做規(guī)定.眼睛作為人體極為敏感的部位，如果存在創(chuàng)傷面或者處于發(fā)炎狀況，那么滴眼液中可能存在的內(nèi)毒素就會通過傷口進(jìn)入人體血液.研究顯示人體對細(xì)菌內(nèi)毒素極為敏感：極微量（1 kg體質(zhì)量中含1～5 ng）內(nèi)毒素就能引起體溫上升，發(fā)熱反應(yīng)持續(xù)約4 h后逐漸消退.內(nèi)毒素引起發(fā)熱反應(yīng)的原因是內(nèi)毒素作用于體內(nèi)的巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等，使之產(chǎn)生白細(xì)胞介素1、6和腫瘤壞死因子α等細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子作用于宿主下丘腦的體溫調(diào)節(jié)中樞，促使體溫升高發(fā)熱.當(dāng)進(jìn)入人體的細(xì)菌內(nèi)毒素超過一定劑量，可引發(fā)嚴(yán)重的內(nèi)毒素血癥，嚴(yán)重者可造成休克死亡[1].滴眼液生產(chǎn)采用了無菌生產(chǎn)工藝，一般通過過濾方式去除了活體菌株，但無法去除可能存在的內(nèi)毒素，從而極有可能使存在創(chuàng)傷面或者處于發(fā)炎狀態(tài)的眼睛受到感染.但目前滴眼液內(nèi)毒素檢測未設(shè)立相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，因此有必要建立滴眼液中細(xì)菌內(nèi)毒素檢測方法.研究采用鱟試劑凝膠法對氧氟沙星滴眼液細(xì)菌內(nèi)毒素進(jìn)行檢測，為產(chǎn)品質(zhì)量控制提供參考方法與標(biāo)準(zhǔn)，從而有效保證滴眼液產(chǎn)品的安全性.

1 材料及實(shí)驗(yàn)條件

1.1 儀器

BET-16M細(xì)菌內(nèi)毒素測定儀（天津市天大天發(fā)科技有限公司），ZH-2 BLENDER旋渦混勻器（廣州易測儀器有限公司），MX-S可調(diào)試混勻器（廣州易測儀器有限公司），GR-246熱空氣消毒箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司），SW-CJ系列潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）.

1.2 試劑和樣品

細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（凍干）（中國食品藥品檢定研究所，批號：150601-201176，規(guī)格：100 EU/支），鱟試劑（湛江博康海洋生物有限公司，批號：1302180、1406270，靈敏度：0.25 EU/mL），細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（湛江博康海洋生物有限公司，批號：1408060），堿性調(diào)節(jié)劑（湛江博康海洋生物有限公司，批號：1405270，規(guī)格：2 mL/支）.

1.3 樣品

氧氟沙星滴眼液（江蘇克勝藥業(yè)有限公司，批號：130303），氧氟沙星滴眼液（參天制藥（中國）有限公司，批號：130306），氧氟沙星滴眼液（江蘇亞邦愛普森藥業(yè)有限公司，批號：130311）.

1.4 實(shí)驗(yàn)條件

實(shí)驗(yàn)環(huán)境：SW-CJ系列潔凈工作臺，實(shí)驗(yàn)溫度：37±1°C，反應(yīng)時(shí)間：1 h.

2 凝膠法實(shí)驗(yàn)及結(jié)果

2.1 鱟試劑靈敏度復(fù)核

用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BET水）溶解細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（WES），用旋渦混勻器將WES混勻15 min制成內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度為0.5、0.25、0.125和0.0625 EU/mL，每稀釋一步都必須混勻30 s，并以BET水作為陰性對照.

2.1.1 細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制

按圖1 所示操作流程，制成2.0 λ (0.5 EU/mL)、1.0 λ (0.25 EU/mL)、0.5 λ (0.125 EU/mL)、0.25 λ (0.062 5 EU/mL)的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液.

圖1 細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)溶液配制流程

2.1.2 檢測操作與結(jié)果

取不同批號的鱟試劑各18支，分別加入BET水0.1 mL溶解，其中每批鱟試劑各取16支分別加入上述4個濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL，每個內(nèi)毒素濃度平行做4支，另2支加入0.1 mL檢查用水作為陰性對照，結(jié)果見表1.

表1 靈敏度復(fù)核結(jié)果

靈敏度計(jì)算公式：鱟試劑靈敏度的測定值λc=lg-1(∑X/4).

由表1結(jié)果可見，最大的濃度2λ均為陽性，最低的濃度0.25λ均為陰性，陰性對照為陰性，試驗(yàn)有效[2].計(jì)算2批鱟試劑的靈敏度都為0.149，處于0.5～2λ（0.125～0.5 EU/mL）范圍之間，則該2批鱟試劑可用于實(shí)驗(yàn)檢測.

2.2 供試品細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）的確定

《中國藥典》（2015版第四部）通則規(guī)定了細(xì)菌內(nèi)毒素限值的品種為注射液，而滴眼液作為細(xì)菌內(nèi)毒素檢測新品種在藥典上并沒有明確規(guī)定，故在此參照氧氟沙星原料藥細(xì)菌內(nèi)毒素限值，每1 mg樣品細(xì)菌內(nèi)毒素應(yīng)小于0.75 EU[3]，則氧氟沙星滴眼液的細(xì)菌內(nèi)毒素限值L為0.75 EU/mg.

2.3 供試品最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）的確定

按照公式MVD=L*C/λ且本品的標(biāo)示量為5 mL，供試品濃度為3 g/L，λ為0.25 EU/mL.計(jì)算可得9倍為氧氟沙星滴眼液供試品的最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）.

2.4 供試品的干擾初篩試驗(yàn)

用BET水作為稀釋液，將氧氟沙星滴眼液分別稀釋成9、7、5、3、1倍的系列濃度，再以各稀釋倍數(shù)濃度的供試液將內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（WES）制成內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度分別為0.5、0.25、0.125和0.062 5 EU/mL，加入鱟試劑混合，進(jìn)行抑制試驗(yàn).

2.4.1 氧氟沙星滴眼液樣品稀釋液制備

取樣品和檢查用水各1 mL混勻，制成1:1溶液，然后取1:1溶液的1 mL加入檢查用水0.5 mL制成1:3溶液，然后取1:3溶液的1 mL加入檢查用水0.7 mL制成1:5溶液，再取1:5溶液的1 mL加入檢查用水0.4 mL制成1:7溶液，最后取1:7溶液的1 mL加入檢查用水0.3 mL制成1:9溶液.

2.4.2 細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備

細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備的操作按照2.1.1方法.

2.4.3 檢測

每一濃度的稀釋液分別取鱟試劑各18支，分別以0.1 mL檢查用水加入于其中16支，溶解，分別加入0.1 mL相應(yīng)濃度（1、3、5、7、9倍）的供試品稀釋液，每個內(nèi)毒素濃度分別平行做4支；另外2支分別加入0.1 mL相應(yīng)濃度的稀釋液作為陰性對照，結(jié)果見表2.

表2 供試品的干擾初篩結(jié)果

如表2所示，供試品原液對實(shí)驗(yàn)?zāi)z呈抑制，供試品稀釋5倍時(shí)，符合當(dāng)最大濃度2 λ均為陽性，最低濃度0.25 λ均為陰性，陰性對照為陰性，試驗(yàn)視為有效的規(guī)定.故樣品稀釋至5倍以上時(shí)實(shí)驗(yàn)不產(chǎn)生干擾，可用做正式干擾試驗(yàn).

2.5 供試品的正式干擾試驗(yàn)

用5倍樣品稀釋液和BET水分別將內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（WES）制成內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度為0.5、0.25、0.125和0.0625 EU/mL，分別以2批鱟試劑（λ為0.25EU/mL）進(jìn)行干擾試驗(yàn).

2.5.1 氧氟沙星滴眼液的5倍稀釋液的制備

按照2.4.1方法操作.

2.5.2 細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備

按照2.1.1方法操作.

2.5.3 檢測

取2批號鱟試劑各36支，加入BET水0.1 mL溶解，分別加入0.1 mL 5倍樣品稀釋液制成的4個濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液于其中16支，實(shí)驗(yàn)平行做4支，另取2支分別加入5倍樣品稀釋液0.1 mL作為供試品陰性對照；再另取16支分別加入0.1 mL BET水制成的4個濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，陰性對照為剩余2支加0.1 mL BET水的反應(yīng)管，結(jié)果見表3.

表3 供試品的正式干擾結(jié)果

2.5.4 計(jì)算

2批鱟試劑BET水系列溶液和5倍樣品稀釋液系列溶液反應(yīng)終點(diǎn)濃度幾何平均值（Es和Et1、Et2）為

同上計(jì)算，鱟試劑批號：1302180，Et1=0.149 EU/mL;鱟試劑批號：1406270，Et2=0.177 EU/mL.

根據(jù)《中國藥典》（2015版第四部）通則規(guī)定，當(dāng)Es在0.5～2.0 λ范圍內(nèi)，且Et也均在0.5～2.0Es范圍內(nèi)（包括0.5Es和2.0Es），則認(rèn)為供試品在該濃度下無干擾.由上述計(jì)算結(jié)果可見，Es=0.149在0.5～2.0 λ（即 0.125～0.5 EU/mL）范圍內(nèi)，Et1=0.149、Et2=0.177也均在 0.5～2.0Es（即0.074 325～0.297 302EU/mL）范圍內(nèi)，則實(shí)驗(yàn)無干擾，即5倍的樣品稀釋液可以用于樣品細(xì)菌內(nèi)毒素限度檢測.

2.6 細(xì)菌內(nèi)毒素分析方法的確立

取3批不同批號氧氟沙星滴眼液樣品，分別用BET水稀釋5倍，采用2批不同批號鱟試劑對樣品稀釋液進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢測，從而確立氧氟沙星滴眼液中細(xì)菌內(nèi)毒素限度分析方法.實(shí)驗(yàn)過程如下：

2.6.1 制備5倍樣品稀釋液

依照供試品的正式干擾試驗(yàn)項(xiàng)下樣品稀釋操作.

2.6.2 內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備

2.6.3 檢測：

分別取2批鱟試劑各8支，分別加入0.1 mL檢查用水溶解，其中2支管平行加入其中一個樣品稀釋液0.1 mL，2支管平行加入供試品陽性溶液0.1 mL作為陽性對照，2支管平行加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為陽性，最后2支管平行加入檢查用水0.1mL作為陰性.同法測定另外兩批樣品，結(jié)果見表4.

從表4可見，供試品陽性對照管（PPC）和陽性對照管（PC）均為陽性，陰性對照管NC均為陰性，試驗(yàn)有效.供試品（S）管均為陰性，表明氧氟沙星滴眼液樣品中未檢測出細(xì)菌內(nèi)毒素，3批氧氟沙星滴眼液樣品中的細(xì)菌內(nèi)毒素均符合規(guī)定.

表4 氧氟沙星滴眼液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果

3 結(jié)果與討論

在內(nèi)毒素凝膠法檢測中，通過干擾試驗(yàn)得出5倍樣品稀釋濃度是可以排除干擾的，說明細(xì)菌內(nèi)毒素鱟試劑凝膠法能用于氧氟沙星滴眼液樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢測.由細(xì)菌內(nèi)毒素鱟試劑凝膠法檢查結(jié)果可見，氧氟沙星滴眼液樣品中未檢測出細(xì)菌內(nèi)毒素，3批不同氧氟沙星滴眼液樣品中的細(xì)菌內(nèi)毒素均符合規(guī)定，故鱟試劑凝膠法可應(yīng)用于氧氟沙星滴眼液細(xì)菌內(nèi)毒素檢測.

本實(shí)驗(yàn)操作過程簡便、快速、靈敏，可靠性高，鱟試劑凝膠法可作為滴眼液的內(nèi)毒素檢測手段，可供相關(guān)生產(chǎn)企業(yè)對滴眼液的質(zhì)量控制，保證產(chǎn)品的安全性.