外源一氧化氮與水楊酸對鹽脅*迫下小麥幼苗生理特性的影響

張 倩 賀明榮 陳為峰 代興龍 王振林 董元杰? 諸葛玉平?

（1 山東農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院，土肥資源高效利用國家工程實驗室，山東泰安 271018）

（2山東農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，山東泰安 271018）

土壤鹽漬化是影響植物生長、導致農(nóng)作物減產(chǎn)的主要因素之一［1］。鹽脅迫會引起植物形態(tài)、生理、生物化學等多方面變化［2］。高濃度NaCl會使植物根部土壤水勢降低，根系吸取水分困難從而產(chǎn)生滲透脅迫。同時鹽脅迫條件下葉片氣孔關(guān)閉，植物體內(nèi)電子運輸與光合器官受損，導致光合作用及生產(chǎn)率下降。鹽脅迫同樣會使植物體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧，造成脂類、蛋白質(zhì)和氨基酸的氧化損傷，引起代謝紊亂，最終導致作物產(chǎn)量下降［3］。

一氧化氮（Nitric oxide, NO）和水楊酸（Salicylic acid, SA）是植物體內(nèi)普遍存在的兩種小分子信號物質(zhì)，且均在植物抵抗生物和非生物逆境脅迫反應中起重要作用［4］。SA與NO的信號應答途徑并非孤立的，二者在很多抗逆反應中均存在交互作用［5］。研究表明，SA能夠誘導擬南芥中NO的合成，且在一定范圍和時間內(nèi)NO合成量隨SA濃度升高而增加［6］。而在煙草的系統(tǒng)獲得抗性信號通路中，NO活性完全依賴于SA功能作用［7］。Singh等［8］研究認為，NO與SA能夠協(xié)同調(diào)節(jié)植物體內(nèi)亞砷酸鹽脅迫反應信號。在對NO和SA減輕紅花的鋅毒害作用的研究中發(fā)現(xiàn)，復合施用較單獨施用緩解毒害效果更加顯著［9］。此外，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)外源施加SA與NO均能緩解鎳對龍爪稷幼苗［10］及甘藍型油菜［11］的毒害作用，但其復配處理效果更具優(yōu)勢。

小麥作為三大糧食作物之一，具有較高的營養(yǎng)價值。有研究顯示SA和NO能夠提高小麥中波紫外線脅迫抗性，且二者結(jié)合施用時效果最佳［12］。而有關(guān)外源NO與SA復合調(diào)控對鹽脅迫下小麥幼苗生長影響的相關(guān)研究尚少見報道。因此本試驗以小麥為研究對象，以硝普鈉（Sodium nitroprusside,SNP）為NO供體，研究鹽脅迫下外源NO和SA單獨及復合施用對其幼苗生長、光合色素合成及抗氧化酶系統(tǒng)的影響，以期了解外源NO、SA及其復合施用對鹽脅迫下小麥幼苗生長的緩解效應，并揭示其緩解機理，為鹽堿土壤上的小麥高產(chǎn)栽培和鹽漬化土地的開發(fā)利用提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗于2017年9月在山東農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院植物營養(yǎng)學實驗室進行。供試小麥（Triticum aestivum L.）品種“山農(nóng)22號”，該品種為山東省栽培面積較廣的一種優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的小麥品種但耐鹽性較差。選取籽粒飽滿、大小均勻、無病蟲害的種子，經(jīng)0.1%的NaClO消毒10 min，然后用蒸餾水反復漂洗干凈，置于SPX-2501C型人工智能氣候箱中25℃下恒溫培養(yǎng)。待種子露白后，播于洗凈的濕潤蛭石中，萌發(fā)后用1/2 Hoagland營養(yǎng)液澆灌。待小麥長出兩片葉后挑選長勢一致的植株洗凈根部蛭石后，移栽至盛有1/2 Hoagland營養(yǎng)液的玻璃器皿中，每盆25株，營養(yǎng)液調(diào)pH至6.5～6.8，幼苗生長條件的室內(nèi)晝/夜溫度為25/18 ℃，光強為100μmol·m-2·s-1，光照時間14 h·d-1。

1.2 試驗設(shè)計

試驗設(shè)6個處理：1) CK: Hoagland營養(yǎng)液處理；2) NaCl: Hoagland營養(yǎng)液+120 mmol·L-1NaCl；3) SA: Hoagland營養(yǎng)液+120 mmol·L-1NaCl+100 μmol·L-1SA；4) SNP: Hoagland營養(yǎng)液+120 mmol·L-1NaCl+100 μmol·L-1SNP；5) 1/2(SA+SNP): Hoagland營養(yǎng)液+120 mmol·L-1NaCl+50 μmol·L-1SA +50 μmol·L-1SNP；6) SA+SNP : Hoagland營養(yǎng)液+120 mmol·L-1NaCl+100 μmol·L-1SA+100 μmol·L-1SNP，每個處理重復3次，每盆每次用250 mL 配制的混合液進行處理。每隔2 d換一次混合液，處理14 d后進行各項指標的測定。

1.3 測定項目及方法

鮮重和干重的測定：采取各部分植株樣，用去離子水將其沖洗干凈，再用吸水紙吸干，直接測定各部分鮮重（FW）。將新鮮材料放于105℃烘箱中殺青30 min后，在 70 ℃下烘干至恒重，然后測定植株干重（DW）。

光合色素含量的測定：用96%的乙醇將采取的幼葉研磨成勻漿，并在25 mL容量瓶內(nèi)定容，搖勻后用分光光度計分別測定在665、649和470 nm下的吸光度值，然后利用相關(guān)公式計算出葉綠素和類胡蘿卜素的含量。

電解質(zhì)滲出率的測定：相對電導值(%)=第一次電導值/殺死后電導值×100%；

電解質(zhì)滲出率(%)=（樣品相對電導值－對照相對電導值）/（100%－對照相對電導值）×100%。

N、P、K、Na、Ca、Mg含量測定：植株樣品經(jīng)烘干、研磨過篩后，H2SO4-H2O2消化，凱氏定氮法測定全氮含量、鉬銻抗比色法測定全磷含量，火焰光度計法測定全鉀、全鈉含量。植株Ca、Mg含量采用HNO3-HClO消煮，并用原子吸收分光光度計進行測定［13］。

H2O2含量測定：參照Patterson等［14］的方法，采用三氯乙酸（Trichloroacetic acid, TCA）進行冰浴研磨，低溫離心后加入磷酸緩沖液和KI溶液于390 nm下進行比色測定。

抗氧化酶活性的測定［15］：取樣品加入磷酸緩沖液冰浴研磨，低溫離心后超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase, SOD）活性測定采用氮藍四唑（Nitro-blue tetrazolium, NBT）法，過氧化物酶（Peroxidase, POD）活性測定采用愈創(chuàng)木酚法，過氧化氫酶（Catalase , CAT）活性測定采用紫外吸收法。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003軟件處理數(shù)據(jù)和繪表，采用DPS 7.05軟件進行統(tǒng)計分析，采用最小顯著極差法（LSD）進行差異顯著性檢驗（P ＜ 0.05）。

行動主張：建議學院優(yōu)先從教學管理組織結(jié)構(gòu)進行控制，強調(diào)及加強教研室的管理功能，加強教師團隊建設(shè)及對教師個人能力提升的支持與鼓勵，當然也應建立相應淘汰機制。教學單位應合理安排好課程結(jié)構(gòu)，結(jié)合學院硬件實施（以及及時申購或添置必要實訓設(shè)施）、學生層次，設(shè)置好課程任務，在課程實施過程中，以師帶徒，提高學生能力及加強學院學風建設(shè)。

2 結(jié) 果

2.1 不同處理對小麥幼苗干鮮重及根系活力的影響

由表1可知NaCl處理顯著抑制小麥幼苗的生長。與CK相比，NaCl處理下小麥幼苗的地上部鮮重和干重分別降低45.65%和6.46%，地下部鮮重和干重分別降低55.80%和12.44%，且差異顯著。添加外源NO或SA之后都能夠緩解鹽脅迫，二者的復合處理也可以提高小麥幼苗的地上部和地下部鮮重及干重。其中1/2(SA+SNP)處理地上部鮮重及干重較NaCl處理分別增加67.34%和6.80%，地下部鮮重及干重分別增加76.91%和17.61%，且差異顯著，可見其效果最明顯。

表1 外源NO與SA復合調(diào)控對鹽脅迫下小麥幼苗干鮮重及根系活力的影響Table 1 Effects of extraneous nitric oxide and salicylic acid on fresh or dry matter weight and root activity of the wheat seedlings under salt stress

根系活力是根生命力強弱的綜合評價指標，反映植物根系的整體發(fā)育狀況。由表1可知，與CK相比，NaCl處理可顯著降低小麥幼苗的根系活力。SNP 和SA單獨處理小麥幼苗根系活力分別較NaCl處理提高52.34%、47.56%； SNP和SA復合處理下其根系活力分別較NaCl處理提高74.26%、61.94%，且差異顯著。說明外源NO、SA及其復合處理在鹽脅迫下均可促進小麥幼苗根系的生長，提高其根系活力，從而促進植株對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收以及地上部的良好生長，且以1/2(SA+SNP)交互作用效果更明顯。

2.2 不同處理對小麥幼苗葉片光合色素含量的影響

由表2可見，鹽脅迫顯著降低小麥幼苗葉片光合色素的含量。與CK相比，NaCl處理的葉綠素a (Chlorophyll a, Chl a)、葉綠素b(Chlorophyll b, Chl b)和類胡蘿卜素(Carotenoid, Car)的含量分別降低16.98%、17.86%、5.03%。隨著SNP或SA的添加，Chl a、Chl b和Car 的含量均有明顯的提高。其中1/2(SA+SNP)處理提高的幅度更大，且與NaCl處理差異顯著，其Chl a、Chl b和Car的含量較NaCl處理分別提高39.58%、24.46%、33.06%。表明NaCl處理對小麥幼苗產(chǎn)生脅迫，而外源N O與S A可以緩解這種脅迫，尤其是1/2(SA+SNP)的復合處理對鹽脅迫的緩解效果更明顯。

2.3 不同處理對小麥幼苗產(chǎn)生速率和H2O2含量的影響

圖1 外源NO與SA復合調(diào)控對鹽脅迫下小麥幼苗超氧陰離子產(chǎn)生速率（A）及過氧化氫含量（B）的影響Fig. 1 Effects of extraneous nitric oxide and salicylic acid on generation rate (A) and H2O2 content (B) of the wheat seedlings under salt stress

表2 外源NO與SA復合調(diào)控對鹽脅迫下小麥幼苗葉片光合色素含量的影響Table 2 Effects of extraneous nitric oxide and salicylic acid on chlorophyll contents in leaves of the wheat seedlings under salt stress/(mg·g-1 FW)

22變化趨勢類似，NaCl處理下顯著提高，添加SNP和SA均可降低鹽脅迫下H2O2且差異顯著，其中1/2(SA+SNP)處理H2O2的累積量降低最為明顯。

2.4 不同處理對小麥幼苗丙二醛含量和電解質(zhì)滲出率的影響

鹽脅迫誘導丙二醛（MDA）的積累，促進膜脂過氧化對小麥幼苗的傷害（圖2A）。與CK相比，NaCl處理下小麥幼苗葉片和根系中的MDA含量分別提高38.95%、56.29%。添加SNP或SA均可以起到緩解效應，其中SNP和SA交互作用的緩解效應更明顯。與NaCl處理相比，1/2(SA+SNP)處理小麥幼苗葉片和根系中的MDA含量顯著降低，分別降低15.78%、24.23%，表現(xiàn)出更好的緩解效果。

鹽脅迫處理下小麥幼苗的電解液滲出率均顯著升高（圖2B）。與CK相比，NaCl處理的電解液滲出率提高70.72%。而添加SNP或SA均可以顯著降低電解質(zhì)滲出率，并且SNP和SA交互作用的緩解效應更明顯，與其他3個處理相比也具有顯著差異。與NaCl處理相比，1/2(SA+SNP)處理小麥幼苗的電解質(zhì)滲出率降低32.50%，表現(xiàn)出更好的緩解效果。

2.5 不同處理對小麥幼苗抗氧化酶活性的影響

超氧化物歧化酶（SOD）的活性在NaCl處理下顯著降低（圖3A）。與CK相比，NaCl處理使小麥幼苗葉片和根系中的SOD活性分別降低18.67%、41.79%。添加SNP或SA可以緩解鹽脅迫造成的SOD活性降低，其中SNP和SA交互作用的緩解效應更明顯。與NaCl處理相比，1/2(SA+SNP)處理小麥幼苗葉片和根系中的SOD活性顯著提高，分別提高14.49%、21.53%，表現(xiàn)出最好的緩解效果。為適應鹽脅迫，NaCl處理下小麥幼苗的過氧化物酶（POD）活性顯著提高（圖3B）。與CK相比，其葉片和根系中的POD活性分別提高10.86%、12.11%。隨著SNP和SA的添加，各處理均顯著提高小麥幼苗的POD活性，起到緩解鹽害的作用，其中SNP和SA復合處理的緩解效應更明顯。與NaCl處理相比，1/2(SA+SNP)處理小麥幼苗葉片和根系中的SOD活性分別提高9.12%、7.34%，具有顯著差異，表現(xiàn)出最好的緩解效果。

圖2 外源NO與SA復合調(diào)控對鹽脅迫下小麥幼苗丙二醛含量（A）及電解質(zhì)滲出率（B）的影響Fig. 2 Effects of extraneous nitric oxide and salicylic acid on MDA content (A) and electrolyte leakage (B) of the wheat seedlings under salt stress

圖3 外源NO與SA復合調(diào)控對鹽脅迫下小麥幼苗SOD（A）、POD（B）及CAT（C）酶活性的影響Fig. 3 Effects of extraneous nitric oxide and salicylic acid on SOD (A), POD (B) and CAT (C) activity of the wheat seedlings under salt stress

2.6 不同處理對小麥幼苗脯氨酸含量的影響

脯氨酸在植物體內(nèi)的含量在一定程度上反映植物的抗逆性。由圖4可知，在鹽脅迫條件下，脯氨酸含量增加，從而小麥幼苗更好地適應鹽脅迫逆境。隨著SNP和SA的添加，進一步提高了小麥幼苗的脯氨酸含量，起到緩解鹽害的作用，其中SNP和SA交互作用的緩解效應更為明顯。與NaCl處理相比，1/2(SA+SNP)處理小麥幼苗葉片和根系中的脯氨酸含量分別增加了6.62%、35.55%，差異顯著，表現(xiàn)出更好的緩解效應。

圖4 外源NO與SA復合調(diào)控對鹽脅迫下小麥幼苗脯氨酸含量的影響Fig. 4 Effects of extraneous nitric oxide and salicylic acid on proline content of the wheat seedlings under salt stress

2.7 不同處理對小麥幼苗體內(nèi)Na及其他礦質(zhì)元素含量的影響

由表3可知，在NaCl處理下，小麥有幼苗葉片和根系中的Na含量顯著增加，分別較CK增加2.67倍和3.57倍。添加外源SNP與SA之后，Na含量有所下降，尤其是1/2(SA+SNP)處理Na含量顯著下降。可見1/2(SA+SNP)處理抑制了小麥對Na的吸收。

N、P、K、Ca、Mg的含量在NaCl處理條件下降低，說明過量的Na抑制這些礦質(zhì)元素的吸收。然而添加外源SNP或SA或SNP+SA可以緩解N、P、K、Ca和Mg含量的降低，并促進小麥幼苗對這些礦質(zhì)元素的吸收。其中，1/2(SA+SNP)處理結(jié)果差異顯著。與NaCl相比，1/2(SA+SNP)處理條件下，N在葉和根中的含量分別增加15.49%、27.30%；P在葉和根中的含量分別增加23.04%、21.40%；K在葉和根中的含量分別降低3.08%、97.78%；Ca在葉和根中的含量分別降低45.07%、110.12%；Mg在葉和根中的含量分別降低15.85%、18.87%，且均具有顯著差異。

表3 外源NO與SA復合調(diào)控對鹽脅迫下小麥幼苗礦質(zhì)元素含量的影響Table 3 Effects of extraneous nitric oxide and salicylic acid on mineral elements content of the wheat seedlings under salt stress /(mg·kg-1)

3 討 論

3.1 外源NO與SA復合調(diào)控對鹽脅迫下小麥幼苗干鮮重、根系活力及光合色素含量的影響

Tariq等［16］研究表明鹽脅迫會抑制植物的光合作用、養(yǎng)分平衡、抗氧化酶活性、可溶性物質(zhì)積累等多種生理過程，進而抑制植株生長。而NO和SA作為生長調(diào)節(jié)物質(zhì)可以參與逆境脅迫的多重生理調(diào)控。本試驗結(jié)果顯示NaCl處理降低小麥幼苗的干重及鮮重，而添加外源物質(zhì)可以緩解這種影響，并且SNP與SA復合處理條件下小麥的鮮重和干重較單獨施用效果更好，尤其是1/2(SA+SNP) 效果更優(yōu)。通過測定小麥的根系活力、葉片的葉綠素含量，可以看出SA+SNP顯著提高了鹽脅迫下小麥的根系活力和葉綠素含量。SA+SNP可以通過提高根系活力來促進小麥對礦質(zhì)元素的吸收，也可以通過促進葉綠素的合成來提高小麥的光合作用，進而對鹽害有很大的緩解作用。有研究表明，外源添加NO和SA能夠有效修復亞砷酸鹽對水稻根系生長及葉綠素合成的抑制作用［8］，這與本研究結(jié)果一致。此外，SNP和SA對鹽害的緩解作用還可能是因為對膜功能和抗氧化劑的保護作用。

3.2 外源NO與SA復合調(diào)控對鹽脅迫下小麥幼苗丙二醛含量和電解質(zhì)滲出率的影響

在本研究中，N a C l處理增加了小麥幼苗的膜脂過氧化作用，而外源NO和SA，尤其是1/2(SA+SNP)，顯著降低了MDA積累。Gunes等［17］研究表明SA可以通過抑制OH-的合成來降低MDA的含量；此外NO可以通過降低和H2O2的積累來降低膜脂過氧化作用［18］。鹽脅迫對植物的另一直接毒性作用表現(xiàn)為過量的Na造成了細胞膜電解質(zhì)滲出率增加。鹽脅迫下MDA含量和電解質(zhì)滲出率的增加會導致小麥的生理生化功能衰退，最終阻礙植株生長。試驗表明外源添加SNP和SA可以降低小麥幼苗的電解質(zhì)滲漏率和MDA含量，其中以1/2(SA+SNP)效果更優(yōu)。Bastam等［19］研究表明SA可通過促進對離子的吸收和提高抗氧化能力來維護膜功能，從而保護植物免受氧化損傷。外源添加SA和SNP降低電解質(zhì)滲漏率可能是由于減緩了生物膜的過氧化作用，從而減輕了鹽脅迫下小麥質(zhì)膜受損程度。

3.3 外源NO與SA復合調(diào)控對鹽脅迫下小麥幼苗抗氧化酶活性的影響

3.4 外源NO與SA復合調(diào)控對鹽脅迫下小麥幼苗脯氨酸含量的影響

本研究測定了鹽脅迫對滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響。在NaCl處理下，外源添加SNP和SA，可以提高小麥幼苗葉片和根系中脯氨酸的含量， 以1/2(SA+SNP)處理效果更好。這可能是由于NO與SA通過促進脯氨酸生物合成的基因表達來影響脯氨酸濃度。有研究表明脯氨酸可以通過和生物大分子（比如DNA、蛋白質(zhì)）相互作用清除羥自由基，從而穩(wěn)定生物大分子的結(jié)構(gòu)。Tan等［18］表明NO與SA可以通過誘導脫落酸合成來調(diào)節(jié)脯氨酸的含量，從而緩解滲透脅迫。因此可以推斷，鹽脅迫下NO與SA對滲透物質(zhì)的調(diào)節(jié)作用可能是其保護小麥幼苗免遭鹽害的原因之一。

3.5 外源NO與SA復合調(diào)控對鹽脅迫下小麥幼苗體內(nèi)Na及其他礦質(zhì)元素含量的影響

有研究表明植物對鹽脅迫的主要反應是減少K的含量，Na替代K的吸收從而導致營養(yǎng)失衡［23］。在本研究中，NaCl處理增加了小麥幼苗葉片和根系中Na的含量，降低了其它礦質(zhì)元素（N、P、K、Ca、Mg）的含量。這可能是由于離子間存在競爭排斥作用，高濃度的Na+和Cl-競爭排斥了其他離子的吸收，從而導致小麥礦質(zhì)養(yǎng)分含量降低。而研究結(jié)果表明SNP和SA的復合施用可以促進N、P、K、Ca、Mg元素的吸收，從而提高這些礦質(zhì)元素在地上部的積累。同樣，SA+SNP可以通過提高對其他元素的吸收來降低對Na的吸收?？梢奡A+SNP可以改善鹽脅迫誘導的礦質(zhì)營養(yǎng)失衡，從而促進小麥幼苗的生長。

4 結(jié) 論

與單獨添加SNP或SA相比，SA+SNP復合處理更能顯著提高鹽脅迫下小麥幼苗葉綠素含量、抗氧化酶活性、脯氨酸和可溶性蛋白含量；降低產(chǎn)生速率、H2O2和MDA含量以及電解質(zhì)滲漏率；提高小麥根系活力，促進其對N、P、K、Ca等礦質(zhì)營養(yǎng)元素的吸收，同時抑制了Na的吸收，減少小麥體內(nèi)的Na含量，從而緩解了鹽脅迫對小麥生長的抑制作用。本研究條件下，各處理中以1/2(SA+SNP)處理的緩解小麥鹽脅迫的效果最優(yōu)。