黃連五種主要生物堿的提取純化及含量測定△

張純剛，唐靜雅，于琛琛，程蘭，康廷國

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116620；2.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，遼寧 大連 116620)

黃連味苦，性寒，歸心、胃、肝、膽、大腸經(jīng)，具有瀉火解毒、清熱燥濕的功效。黃連中含有小檗堿、巴馬汀堿、黃連堿，表小檗堿等生物堿都具有較強(qiáng)的藥理活性?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃連主要有效成分生物堿類不僅具有抗菌、抗病毒的功效，還具有抗心律失常、改善充血性心力衰竭、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、降血糖、降血脂、抗血小板凝集、利膽、抗腫瘤等藥理作用，被廣泛應(yīng)用于各種病證的治療[1]。因此，對(duì)黃連五種主要生物堿提取與純化工藝進(jìn)行研究對(duì)于臨床研究有著重要的意義。黃連提取純化方法很多種，有水提、醇提以及柱層析純化等[2-7]?！吨腥A人民共和國藥典》2015年版一部黃連含量測定項(xiàng)下一測多評(píng)法及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道同時(shí)測定四種生物堿的含量[8-15]。本實(shí)驗(yàn)采用硫酸水提結(jié)合酸溶鹽析沉淀的方法提取純化生物堿，通過優(yōu)化方法同時(shí)檢測五種含量較大的生物堿，并計(jì)算五種生物堿的含量?；谝陨辖Y(jié)果，為后續(xù)進(jìn)行的降血糖方面制劑研究提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀Agilent 1100 series(美國安捷侖科技有限公司)；硫酸、氯化鈉為分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；甲醇、乙腈為色譜純(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)。黃連(批號(hào)：C150677)由大連權(quán)健中藥飲片有限公司提供，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)康廷國教授鑒定為正品黃連Coptidis Rhizoma。鹽酸小檗堿對(duì)照品、鹽酸藥根堿對(duì)照品、鹽酸黃連堿對(duì)照品、鹽酸表小檗堿對(duì)照品、鹽酸巴馬汀對(duì)照品(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)分別為Y18N8S48598、Z27A6S2808、ZS0924BE14、H25F3X1、Z23O6L4910，純度≥98%)。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱定鹽酸小檗堿對(duì)照品、鹽酸黃連堿對(duì)照品、鹽酸表小檗堿對(duì)照品、鹽酸巴馬汀為對(duì)照品及鹽酸藥根堿對(duì)照品適量，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1 mL含51 μg鹽酸小檗堿、10.2 μg鹽酸黃連堿、17.6 μg鹽酸表小檗堿、8.6 μg的鹽酸巴馬汀及2.4 μg鹽酸藥根堿的混合對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取經(jīng)提取后的黃連提取物粉末約0.2 g，置50 mL容量瓶中，精密加入甲醇-鹽酸(100∶1)溶解，超聲處理30 min，放冷至室溫后續(xù)加甲醇-鹽酸(100∶1)定容。精密吸取上述溶液2 mL至10 mL容量瓶中，加入甲醇-鹽酸(100∶1)進(jìn)行定容，再經(jīng)過0.22 μm微孔濾膜過濾，作為供試品溶液。

2.1.3 色譜條件 固定相：Eclipse XDB C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液(45∶55)(每100 mL中加十二烷基硫酸鈉0.4 g，再以磷酸調(diào)節(jié)pH 4.0)；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：室溫；檢測波長：345 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 黃連中總生物堿含量測定的方法學(xué)建立

2.2.1 專屬性試驗(yàn) 分別吸取空白及對(duì)照品溶液和供試品溶液，按2.1.3項(xiàng)下色譜條件，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖(圖1)。結(jié)果表明，在上述色譜條件下五種成分的分離情況及峰形良好，專屬性良好。

注：A.供試品；B.對(duì)照品；C.空白；1.鹽酸藥根堿；2.鹽酸表小檗堿；3.鹽酸黃連堿；4.鹽酸巴馬??；5.鹽酸小檗堿。圖1 黃連五種生物堿HPLC圖譜

2.2.2 線性關(guān)系 將對(duì)照品溶液依次進(jìn)樣2、4、8、10、16、20 μL。得鹽酸藥根堿、鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿的回歸直線方程及線性范圍，結(jié)果見表1。

表1 五種生物堿的回歸方程及線性范圍

2.2.3 精密度試驗(yàn) 取五種生物堿混合對(duì)照品溶液，各重復(fù)進(jìn)樣 6 次，測得鹽酸藥根堿、表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿平均峰面積的RSD依次為1.13%、1.47%、1.76%、1.27%、1.10%，RSD<2%，精密度良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按既定方法制備供試品溶液，分別于2、4、6、8 h進(jìn)樣10 μL檢測。結(jié)果鹽酸藥根堿、表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的RSD依次為0.87%、0.31%、0.97%、0.30%、1.89%，RSD<2%，說明樣品在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次的樣品6份，照上述制定的方法制備供試品溶液和進(jìn)行HPLC 測定，測得鹽酸藥根堿、表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿平均峰面積的RSD依次為1.44%、1.64%、1.92%、1.63%、1.70%，RSD<2%，本方法重復(fù)性良好。

2.2.6 回收率試驗(yàn) 采用加樣回收率方法考察回收率，結(jié)果鹽酸藥根堿、表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿的平均回收率依次為99.85%、100.08%、99.09%、99.69%、101.65%，RSD依次為1.66%、1.50%、1.18%、0.79%、1.34%。表明方法準(zhǔn)確可靠。

2.2.7 樣品含量測定 按上述色譜條件，以混合對(duì)照液進(jìn)行計(jì)算，對(duì)鹽酸藥根堿、表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿五種生物堿進(jìn)行含量測定，計(jì)算五種生物堿含量之和。

2.3 提取工藝研究

2.3.1 酸濃度考察 取黃連飲片粉末約10 g，共3份，分別加0.5%、1.5%、2.5%的硫酸溶液80 mL，加熱回流提取3次，每次40 min，濾過，合并濾液，用水定容至200 mL，取上述提取液適量，用甲醇稀釋到適當(dāng)濃度，經(jīng)過0.22 μm微孔濾膜過濾，按照2.2.7 樣品含量測定項(xiàng)下進(jìn)行測定，測得5種生物堿含量并加和，計(jì)算5種主要生物堿的提取率，結(jié)果見表2。

表2 酸濃度對(duì)五種主要生物堿提取率的影響

從表2 結(jié)果可知，隨著酸濃度的升高，黃連五種主要生物堿提取率先升高后下降。酸濃度在1.5%時(shí)五種主要生物堿提取率達(dá)到最高值。

2.3.2 提取時(shí)間考察 取黃連飲片粉末約10 g，共3份，加1.5%硫酸溶液80 mL，分別加熱回流提取20、40、60 min，提取3次，濾過，合并濾液，用水定容至200 mL，即得，結(jié)果見表3。

表3 提取時(shí)間考察試驗(yàn)結(jié)果

從表3 結(jié)果可知，隨著提取時(shí)間的延長，黃連五種主要生物堿提取率逐漸提高，40 min時(shí)和60 min時(shí)五種主要生物堿提取率相差較小，因此推測再繼續(xù)延長時(shí)間五種主要生物堿提取率并不會(huì)增加，因此選擇40 min時(shí)黃連五種主要生物堿提取效率最佳。

2.3.3 加液量考察 取黃連飲片粉末約10 g，共3份，分別加1.5%硫酸溶液40、80、120 mL，加熱回流提取3次，每次40 min，濾過，合并濾液，分別用水定容至合適體積，即得，結(jié)果見表4。

表4 加液量考察試驗(yàn)結(jié)果

從表4 結(jié)果可知，隨加液量的增加，黃連五種主要生物堿提取率逐漸提高，繼續(xù)增加加液量五種主要生物堿提取率并沒有繼續(xù)提高，加液量為80 mL時(shí)黃連五種主要生物堿提取效率最佳。

2.3.4 提取次數(shù)考察 取黃連飲片粉末約10 g，共4份，分別加1.5%硫酸溶液80 mL，加熱回流分別提取1次、2次、3次、4次，40 min/次，濾過，合并濾液，分別用水定容至200 mL，即得，結(jié)果見表5。

表5 提取次數(shù)考察試驗(yàn)結(jié)果

從表5結(jié)果可知，隨著提取次數(shù)的增加，黃連五種主要生物堿提取率逐漸提高，當(dāng)提取次數(shù)為4次時(shí)最高，但是提取3次與提取4次差別很小，考慮提取效率因素，提取3次的黃連五種主要生物堿提取率最優(yōu)。

2.4 黃連總生物堿純化工藝研究

2.4.1 Ca(OH)2中和條件的考察 取黃連提取液4份，每份50 mL，分別用Ca(OH)2調(diào)節(jié)pH 5～6、pH 7、pH 8～9、pH 10，濾過后的濾液分別置于50 mL容量瓶中，加水至刻度。取上述濾液1 mL，加甲醇定容至25 mL，過0.22 μm微孔濾膜，照上述含量測定中要求測定黃連總生物堿含量。取上述各濾液40 mL，分別加鹽酸調(diào)節(jié)pH 1.5～2，加氯化鈉4 g，使用漩渦儀攪勻使溶解，在冰箱中靜置過夜，抽濾，干燥，收集純化物，所制得的純化物主要是由五種主要生物堿組成的，結(jié)果如表6。

試驗(yàn)結(jié)果表明，pH 5～6 時(shí)，黃連中五種主要生物堿加和的得率最大且純化物純度較高。采用Ca(OH)2中和硫酸，并濾除沉淀，在沉淀過程中會(huì)有部分生物堿沉淀析出，造成過濾后生物堿的部分損失，但是經(jīng)過Ca(OH)2中和硫酸濾除沉淀后，得到的純化后的生物堿固體純度更高了，對(duì)后續(xù)制備高載藥量的黃連生物堿降糖制劑奠定了基礎(chǔ)。

表6 Ca(OH)2中和條件下不同pH值考察試驗(yàn)結(jié)果

2.4.2 酸沉條件考察 取黃連提取液400 mL，加Ca(OH)2調(diào)節(jié)pH 5～6，抽濾。分別量取濾液3份，每份100 mL，用鹽酸分別調(diào)節(jié)pH 1.5～2、pH 2～3、pH 3～4，每份樣品均加氯化鈉10 g，使用漩渦儀攪勻使溶解，在冰箱中靜置過夜，抽濾，濾渣在干燥箱中真空干燥(50 ℃)，收集純化物。結(jié)果如表7。

表7 鹽酸酸化下不同pH考察結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)黃連提取液進(jìn)行酸沉實(shí)驗(yàn)時(shí)，隨著pH 升高，黃連中五種主要生物堿的得率變小，純化物純度降低，pH 為1.5～2時(shí)為最優(yōu)。

2.5 黃連五種主要生物堿含量測定

取黃連提取液1000 mL，共3份，分別加Ca(OH)2調(diào)節(jié)pH 5～6，抽濾，濾液加鹽酸調(diào)節(jié)pH 1.5～2，加氯化鈉100 g，充分?jǐn)嚢?，后在冰箱冷藏靜置過夜，抽濾，濾渣干燥(50 ℃)，收集純化物。含量測定結(jié)果見圖2。

圖2 黃連五種主要生物堿含量測定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

黃連提取率最優(yōu)條件是：研磨黃連呈粉末狀，加8倍量1.5%的硫酸溶液，煎煮三次，每次40 min。硫酸濃度不宜過高，以免提取時(shí)由于水分蒸發(fā)，局部濃度過高產(chǎn)生碳化的現(xiàn)象。

五種主要生物堿純化物純度最優(yōu)條件是：黃連提取液采用Ca(OH)2調(diào)節(jié)pH 5～6，濾液加HCl調(diào)節(jié)pH 1～2，加5%氯化鈉溶液使之溶解，冰箱冷藏過夜，濾餅50 ℃烘干。在黃連生物堿純化過程中，向提取液中加入Ca(OH)2中和硫酸時(shí)，由于Ca(OH)2微溶于水，與硫酸反應(yīng)時(shí)間較長，因此加入Ca(OH)2后需不斷攪拌，以促進(jìn)Ca(OH)2與硫酸充分反應(yīng)。如果攪拌不充分，則pH測定不準(zhǔn)確，對(duì)沉淀提純的結(jié)果有較大的影響。雖然在沉淀提純過程中，有少部分生物堿的損失，不能完全提取純化出來，但是由于得到的五種主要生物堿純化物的純度較高，為制備高載藥量的黃連生物堿降糖制劑奠定了較好的基礎(chǔ)，得到了純度較高的原料藥。

黃連五種主要生物堿的采用高效液相色譜法進(jìn)行含量測定方法，五種生物堿分離度符合要求，方法精密度、準(zhǔn)確穩(wěn)定可靠，檢測結(jié)果準(zhǔn)確。