不同濃度膽巴液浸泡下附子中生物堿含量變化研究△

楊千千，郝學(xué)賢，張辰露，梁宗鎖*

(1.浙江理工大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310018；2.陜西華克生物醫(yī)藥有限公司，陜西 漢中 723000；3.陜西理工大學(xué)，陜西 漢中 723000)

附子為毛茛科烏頭屬植物烏頭(AconitumcarmichaeliDebx.)的子根[1]，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗衰老、降糖和降血脂等藥理活性[2]。其中，附子回陽救逆的功效證明附子在心血管系統(tǒng)上的藥理功效具有很強(qiáng)的優(yōu)勢[3]。陜西附子生品于7月中旬至8月上旬采收，抖去泥沙，去掉須根，成為泥附子，經(jīng)炮制后稱為附片[4]。泥附子比附子炮制后的毒性高，生品中所含雙酯型生物堿含量很高，在使用中可致心臟毒，因此在臨床上的應(yīng)用受到很大限制[5]。為了用藥安全，對其進(jìn)行炮制減毒非常重要。在傳統(tǒng)炮制“泡、浸、漂”的過程中，附子中的總生物堿流失80%以上[6]。一般在附子采收24 h內(nèi)放入膽水(制食鹽的副產(chǎn)品，主要成分為氯化鈣、氯化鎂)內(nèi)浸，主要目的是防腐爛[7]。根據(jù)2015版《中華人民共和國藥典》附子項下的加工方法均需有“泥附子洗凈，浸入膽巴的水溶液中數(shù)日”的基礎(chǔ)程序[1]。本實驗研究了附子中6種酯型生物堿在不同濃度的膽巴液中浸泡不同時間下的含量變化規(guī)律，確立附子在膽巴液中浸泡的時間和浸泡附子所需的膽巴液濃度，為附子泡膽的濃度與泡膽時間提供試驗依據(jù)。

1 儀器、試劑與材料

1.1 儀器

Waters 2695 高效液相色譜儀，Waters 2998二極管陣列檢測器，Empower 3 色譜分析儀；電子天平DENVER TP-214(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試劑

苯甲酰新烏頭原堿對照品(批號：P22D7F27347，純度≥98%)、苯甲酰烏頭原堿對照品(批號：P22D7F27348，純度≥98%)、苯甲酰次烏頭原堿對照品(批號：P22D7F27346，純度≥98%)、烏頭堿對照品(批號：P17D7F27141，純度≥98%)、 新烏頭堿對照品(批號：Y17D7H26383，純度≥98%)、次烏頭堿對照品(批號：M12A7S19326，純度≥98%)，均購自上海源葉生物科技有限公司。超純水(儀器)，色譜級乙腈(≥99%)(德國默克公司)，色譜級四氫呋喃(麥克林公司)，氨水購自浙江三鷹化學(xué)試劑有限公司，異丙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、冰醋酸、醋酸銨均為分析純。膽巴(山東?；煞萦邢薰韭然}廠)，膽巴液的濃度以CaCl2含量計，10%的膽巴液(1000 mL含有133.3 g膽巴)，分別配制10%、15%、20%、25%、30%的膽巴液。

1.3 材料

附子藥材購于陜西華克生物醫(yī)藥有限公司，經(jīng)梁宗鎖教授鑒定為毛茛科烏頭屬植物烏頭AconitumcarmichaeliDebx.的子根。將泥附子除去須根、洗凈，共6 kg，分成重量相等的6份，分別置于不同濃度膽巴液中浸泡。分別在第6、12、18、24 、30 d取樣，并將其切片、烘干，作為在不同濃度的膽巴液中浸泡不同天數(shù)的樣品。在10%的膽巴液中浸泡18 d即為C10/18d，以此標(biāo)記各個樣品。

2 方法

2.1 高效液相色譜法測定附子藥材泡膽過程中6種酯型生物堿的含量

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Waters Xbridge C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；乙腈-四氫呋喃(25∶15)為流動相A，0.1 mol·L-1醋酸銨溶液(每1000 mL加冰醋酸0.5 mL)為流動相B，梯度洗脫(0～48 min，15%～26% A；48～49 min，26%～35% A；49～58 min，35% A；58～65 min，35%～15% A)[1]；流速：0.8 mL·min-1；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測波長為235 nm。

2.1.2 供試品溶液的制備 取樣品粉末(過三號篩)約1 g，平行稱取兩份，置具塞錐形瓶中，加氨試液1.5 mL，精密加入異丙醇-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液25 mL，稱定重量，超聲處理(功率300 W，頻率40 HZ，水溫在25 °C以下)30 min，放冷，再次稱重，用異丙醇-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液補(bǔ)足損失的重量，搖勻、濾過。精密量取濾液12.5 mL，40 °C以下減壓回收溶劑至干，殘渣精密加入異丙醇-二氯甲烷(1∶1)混合溶液1.5 mL溶解，過0.22 μm濾膜，取濾液，即得。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿對照品適量，精密稱量，加異丙醇-二氯甲烷(1∶1)混合溶液，分別制成1 mg·mL-1的對照品溶液。再分別將6個標(biāo)準(zhǔn)品溶液移至1 mL量瓶中制成每1 mL含苯甲酰新烏頭原堿50 μg，苯甲酰烏頭原堿70 μg，苯甲酰次烏頭原堿40 μg，新烏頭堿120 μg，次烏頭堿160 μg，烏頭堿40 μg，制成混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液I，儲存于4°C，備用。精密吸取1、2、5、10、15、20 μL混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液I，注入液相色譜儀中，以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，對照品峰面積(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[8-9]。

表1 被測生物堿的線性范圍和線性關(guān)系

2.1.4 附子中6種酯型生物堿對照品和樣品的HPLC色譜圖 分別取不同濃度不同泡膽時間的每個樣品取兩個平行樣，并按2.1.2 項下分別處理，得到供試品溶液，各個樣品的供試品溶液按2.1.1 項下條件進(jìn)行測定。如圖1所示。

注：A.對照品；B.泡膽過程中樣品；1.苯甲酰新烏頭原堿；2.苯甲酰烏頭原堿；3.苯甲酰次烏頭原堿；4.新烏頭堿；5.次烏頭堿；6.烏頭堿。圖1 附子6種酯型生物堿對照品和泡膽過程中樣品HPLC色譜圖

3 結(jié)果

3.1 生物堿的含量變化

泥附子在五個不同濃度的膽巴液浸泡過程中，未檢測到苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿。其他4種生物堿在15%及以上濃度的膽巴液中浸泡均呈下降趨勢。結(jié)果如圖2、表2所示。

注：與未泡膽比較，不同英文字母表示含量存在顯著性差異，P <0.05。圖2 4種酯型生物堿泡膽過程中含量變化

方差分析結(jié)果表明，次烏頭堿下P=0.24>0.05，說明膽巴液濃度對次烏頭堿含量沒有影響；苯甲酰新烏頭堿下時間P=0.054>0.05，說明膽巴液浸泡時間對苯甲酰新烏頭堿含量沒有影響；其他兩種生物堿P值均小于0.05，說明膽巴液浸泡時間和膽巴液濃度對其含量有影響。

表2 主體間效應(yīng)的檢驗

3.2 膽巴液浸泡過程中的效/毒比值

泥附子中的化學(xué)成分新烏頭堿、次烏頭堿和烏頭堿屬于雙酯型生物堿，且毒性極強(qiáng)，苯甲酰新烏頭原堿為單酯型生物堿，藥效活性較強(qiáng)。這幾種生物堿的毒性差異較大，比例不同，導(dǎo)致總生物堿的毒性也不同[10]。對于附子藥材質(zhì)量的評價和作出反映安全性的標(biāo)準(zhǔn)，附子的有效成分和毒性成分含量限定至關(guān)重要[11]。通過計算效/毒比值(苯甲酰新烏頭原堿含量/雙酯型生物堿總含量)，可較為全面的反映泥附子在含有膽巴的水溶液中浸泡過程中成分含量的差異[12]。

對泥附子在五個不同濃度的膽巴液浸泡過程中的單酯型生物堿和雙酯型生物堿的比值進(jìn)行計算，雙酯型生物堿含量為新烏頭堿、次烏頭堿和烏頭堿的含量相加得到的數(shù)值，單酯型生物堿以苯甲酰新烏頭原堿的含量計，如表3所示，10%和20%濃度下在泡膽進(jìn)行到24 d時其效/毒比值最大，比值分別達(dá)到0.267和0.177，而15%、25%和30%濃度下泡膽18 d時效/毒比值最大，其中最大的比值為0.115。由此，可大致得出，泥附子在泡膽過程中，效/毒比值在不斷變化，相對比較，在進(jìn)行膽巴液浸泡時，在18 d～24 d期間左右，呈現(xiàn)出活性成分較高，而毒性成分較少的狀態(tài)。

表3 附子在泡膽過程中效/毒比值

3.3 結(jié)果分析

3.3.1 雙酯型生物堿的含量變化 泥附子在五個不同濃度的膽巴液浸泡過程中，新烏頭堿的含量呈下降趨勢，其中在20%及以上濃度的膽巴液中浸泡呈顯著下降，其含量在第6 d時分別下降了78.4%，66.0%，88.1%。在10%和15%濃度下，浸泡18 d以后，含量分別下降了53.5%、55.9%，此后變化趨勢較為緩和。在整個浸泡過程中，新烏頭堿的含量在泡膽18 d以后相對定；次烏頭堿的含量整體為下降趨勢。浸泡12 d時，10%濃度下比較穩(wěn)定，下降了46.9%。在15%及以上濃度的膽巴液中浸泡12 d以后，含量分別下降了79.8%、83.8%、80.9%和70.6%，下降程度相對一致。此后次烏頭堿含量變化趨勢在各個濃度的膽巴液中相對穩(wěn)定；烏頭堿在10%濃度的膽巴液中在12 d時呈上升趨勢，在18 d時又下降到浸泡前的含量。在各個濃度的膽巴液中浸泡18 d以后，含量變化呈現(xiàn)下降趨勢。20%、25%、30%濃度下呈顯著下降趨勢，浸泡24 d時含量基本穩(wěn)定，分別下降了82.3%、79.4%、58.7%。

3.3.2 苯甲酰新烏頭原堿的含量變化 泥附子在泡膽過程中，單酯型生物堿中苯甲酰次烏頭原堿和苯甲酰烏頭原堿幾乎檢測不到，因此以苯甲酰新烏頭原堿含量計。苯甲酰新烏頭原堿在膽巴液的浸泡過程中也呈現(xiàn)下降趨勢，且下降趨勢顯著。第6 d時在20%、25%、30%濃度下分別下降了88.4%、83.2%、88.1%，此后含量稍有上升。在15%及以上濃度在第18 d時含量趨于穩(wěn)定狀態(tài)，以后下降趨勢較為緩和。

4 討論

炮制過程中對附子生物堿的變化尤為關(guān)鍵，有毒性的二萜類生物堿被水解為單酯二萜生物堿或未酯化的化合物，然后毒性顯著降低，但同時其藥理活性并不削弱[13]。所以，炮制過程也影響了附子藥材的效/毒比值。目前附子藥材的炮制仍采用傳統(tǒng)加工工藝為主，在附子采挖后于24 h內(nèi)放入含膽巴的水溶液中浸泡，然后再進(jìn)行蒸、煮、切片、水漂等加工過程，制成各種附片[21]。泥附子在不同濃度的膽巴液浸泡過程中，其雙酯型生物堿和單酯型生物堿的含量均下降，在不同濃度下均有不同程度的下降，有效成分損失嚴(yán)重[14-15]。膽巴含量在泡膽過程中具有重要作用，苯甲酰新烏頭原堿在泡膽第6 d時在20%、25%、30%濃度下分別下降了88.4%、83.2%、88.1%呈現(xiàn)急劇下降趨勢。而新烏頭堿、次烏頭堿和烏頭堿在不同濃度膽巴液中浸泡6 d時，呈現(xiàn)不同的下降趨勢。新烏頭堿在浸泡18 d以后，含量變化趨于穩(wěn)定，次烏頭堿在15%及以上濃度的膽巴液中浸泡12 d以后，含量變化趨勢在各個濃度的膽巴液中相對穩(wěn)定，烏頭堿在10%濃度的膽巴液中在12 d時呈上升趨勢，在18 d時又下降到浸泡前的含量，浸泡24 d時含量基本穩(wěn)定，分別下降了82.3%、79.4%、58.7%。以上結(jié)果分析說明，泥附子在不同濃度的膽巴液中泡膽，膽巴液濃度在20%左右，在泡膽18 d后，附子的質(zhì)量相對穩(wěn)定?！端拇ㄊ≌妹骺h概況》中也有“膽腌足二十日”的記載[16]。

有報道指出，膽巴具有利尿作用、對外周血管具有擴(kuò)張作用以及降血壓作用等，在長期服用可能對腸胃道具有刺激作用，且泥附子在膽巴液中浸泡至25 d時對氯化鈣的吸收達(dá)到飽和[17-18]。附子在膽巴液中浸泡，主要的作用以防腐保鮮為主，在后續(xù)炮制過程中需用清水浸漂，蒸煮，以達(dá)到減毒存效的目的[4]。張菊花等研究將泥附子連同膽巴溶液煮至透心以制黑順片，說明膽巴水溶液溫度高可致毒性降低快[22]。雙酯型生物堿遇熱水解[14]，說明膽巴溶液溫度升高有利于毒性降解。在室外泡膽過程中，膽巴水溶液上面會浮現(xiàn)像泡沫一樣的腐物，膽巴液濃度越高，時間越長，腐物越多。在實際生產(chǎn)加工中，附子在泡膽數(shù)日后，即進(jìn)行后續(xù)加工過程，考慮到生產(chǎn)效率，所以本實驗選取選了泡膽一個月內(nèi)的泥附子作為樣品進(jìn)行測定。同時，在泡膽過程中，要注意膽巴液的濃度，不宜過高，既造成資源浪費(fèi)，又使附子的生物堿含量損失過多，濃度太低，附子的生物堿含量變化相對不穩(wěn)定。在達(dá)到防腐目的的同時，也要考慮膽巴用量所產(chǎn)生的安全問題。

附子為典型的有毒藥材，剛采挖后的泥附子毒性很大，且容易腐爛，不易保存。附子在臨床上仍報道有中毒事件，為了使附子在臨床上的用藥安全，附子的減毒手段需進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，嚴(yán)格執(zhí)行質(zhì)量控制要求。隨著技術(shù)和科學(xué)的不斷進(jìn)步，越來越多新穎和改進(jìn)的加工技術(shù)應(yīng)用于附子的炮制，以降低其毒性，提高臨床安全性以及利于其儲存。通過直接烘烤、微生物(黑曲霉)發(fā)酵、高壓蒸汽加工、微波加工等方法均可有效降低附子中的毒性[2，19]。由于附子含水量較高，在貯藏過程中，隨著水分含量的下降，附子的生物堿含量也逐漸降低，在附子采收后，應(yīng)盡快進(jìn)行處理干燥處理，或采取其他形式的儲藏方法，如冷藏、沙藏等，以避免生物堿含量的流失[20]。因此，附子加工前的防腐保鮮非常重要，在附子采收后24 h內(nèi)放入膽巴液中浸泡，室溫下即可，方便易行，即在膽巴的水溶液中浸泡是一種經(jīng)濟(jì)適用的方法。另外，揭示膽巴在泡膽過程中與酯型生物堿變化的作用原理十分重要，溫度的控制以及對已使用過的膽巴液的處理有待深刻研究。